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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine erweiterte Hefe One-Hybrid screening Protokoll um den Transkriptionsfaktoren (TFs) zu identifizieren, die an einer menschlichen DNA-Region of Interest binden können. Diese Methode nutzt eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die die Bindung von Verhören kann > 1.000 TFs in einem einzigen Experiment.

Zusammenfassung

Die Sätze von Transkriptionsfaktoren (TFs), die jedem menschlichen Gens regulieren zu identifizieren, ist eine schwierige Aufgabe, die erfordert zahlreiche experimentelle und rechnerische Ansätze zu integrieren. Eine solche Methode ist die Hefe ein-Hybrid (Y1H) Assay, in welche, die Wechselwirkungen zwischen TFs und DNA-Regionen im Milieu der Nucleus Hefe mit Reporter-Gene getestet werden. Y1H-Assays umfassen zwei Komponenten: als "DNA-Köder" (z.B.., Promotoren, Enhancer, Schalldämpfer, etc.) und eine "TF-Beute," die auf Reporter Genaktivierung untersucht werden kann. Die meisten veröffentlichten Protokolle für die Durchführung von Y1H-Bildschirme basieren auf TF-Beute Bibliotheken oder Arrays in DNA-Köder Hefestämme zu verwandeln. Hier beschreiben wir eine Pipeline, verbesserte Y1H genannt (eY1H) Tests, wo TF-DNA-Wechselwirkungen verhört werden, bei der Paarung DNA-Köder-Stämme mit einer angeordneten Sammlung von TF-Beute Stämme mit einem high-Density-Array (HDA) Roboter-Plattform, mit der Vorführung in einem 1.536 Kolonie-Format. Dies ermöglicht eine drastische Zunahme der Durchsatz (60 DNA-Köder-Sequenzen gegen > 1.000 TFs dauert zwei Wochen pro Forscher) und Reproduzierbarkeit. Wir illustrieren die verschiedenen Arten von erwarteten Ergebnissen von Tests menschlichen Promotorsequenzen gegen eine Reihe von 1.086 menschlichen TFs, sowie Beispiele für Probleme, die während der Bildschirme und wie man sie beheben können.

Einleitung

Ein zentrales Problem im Bereich Biomedizin ist die Mechanismen Bestimmung jedes menschliche gen geregelt. Transkription ist der erste Schritt bei der Kontrolle der gen-Expression-Ebenen, und es wird durch Sätze von Transkriptionsfaktoren (TFs), die einzigartig für jedes Gen reguliert. Angesichts der Tatsache, dass Menschen für kodieren > 1.500 TFs1,2, Ermittlung des vollständigen Satzes von TFs, die der Tätigkeit des einzelnen Gens Steuern bleibt eine offene Herausforderung.

Zwei Arten von Methoden können verwendet werden, um TF-DNA-Wechselwirkungen Karte: TF-zentriert und DNA-zentrierten Methoden3 (Abbildung 1A). In TF-zentrierten Methoden ist eine TF von Interesse für die Bindung genomische DNA-Regionen oder seine DNA-Bindung Spezifität zu ermitteln sondiert. Diese Methoden umfassen Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung, Protein Bindung Microarrays und SELEX4,5,6. In DNA-zentrierten Methoden ist eine DNA-Sequenz des Interesses sondiert, um den Satz von TFs zu bestimmen, die an der DNA-Sequenz binden. Die am häufigsten angewandte solcher Methoden ist Hefe One-Hybrid (Y1H) Tests, in denen, die Interaktionen zwischen TFs und DNA-Regionen im Milieu der Nucleus Hefe mit Reporter Gene7,8,9getestet werden.

Y1H-Assays umfassen zwei Komponenten: als "DNA-Köder" (z.B., Promotoren, Enhancer, Schalldämpfer, etc.) und eine "TF-Beute," die Reporter-Gen Aktivierung9,10 (Abbildung 1 b) gezeigt werden kann. Der DNA-Köder wird geklont, stromaufwärts von zwei Reporter Gene (LacZ und HIS3) und beide DNA-bait::reporter-Konstrukte sind integriert Hefegenoms generieren chromatinized "DNA-Köder Stämme." Die TF-Beute, codiert in ein Plasmid, das einen TF verschmolzen mit der Aktivierungsdomäne (AD) der Hefe Gal4 TF ausdrückt wird in die DNA-Köder Sorte Fisch für TF-DNA-Wechselwirkungen eingeführt. Wenn die TF-Beute an die DNA-Köder-Sequenz bindet, wird die Anzeige in der TF-Beute vorhanden zur Aktivierung der beiden Reporter-Gene führen. Infolgedessen, können Zellen mit einem positiven Interaktion für Wachstum auf Tellern Histidin fehlt, als auch als kompetitiver Inhibitor, 3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT) die Überwindung ausgewählt und als blauen Kolonien im Beisein von X-gal visualisiert werden. Weil die potente Hefe Gal4 AD dient, Y1H Assays können Interaktionen mit transcriptional Aktivatoren sowie Repressoren erkennen. Darüber hinaus angesichts der Tatsache, dass TF-Beute aus einem starken Hefe-Promotor (ADH1) ausgedrückt werden, können Wechselwirkungen auch für TFs erkannt werden, die geringe endogene Expression Ebenen, die herausfordern, um von ChIP11,12zu erkennen.

Die meisten veröffentlichten Protokolle für die Durchführung von Y1H Assays basieren auf DNA-Köder Hefestämme TF-Beute einzuführen, durch die Umwandlung von gepoolter TF-Beute-Bibliotheken, gefolgt von Auswahl, Kolonie, die Kommissionierung und Sequenzierung den interagierenden TF identifizieren, oder durch Umwandlung einzelner klont8,9. Dies sind zeitraubende Protokolle, Beschränkung der Anzahl von DNA-Sequenzen, die pro Forscher getestet werden können. Eine jüngste Verbesserung der Y1H-Assays, genannt verstärkt Y1H (eY1H), die Screening-Durchsatz mit einer high-Density Arrays (HDA) Roboterplattform Hefestämme DNA-Köder mit einer Sammlung von Hefestämme jeweils mit dem Ausdruck einer anderen Paaren sprunghaft angestiegen TF-Beute10,13 (Abbildung 1). Diese Bildschirme beschäftigen ein 1.536 Kolonie Format erlaubt, die meisten menschlichen TFs in vervierfacht mit nur drei Platten zu testen. Weiter, angesichts der Tatsache, dass TF-DNA-Wechselwirkungen in gewissem Sinne paarweise getestet werden, ermöglicht dieser Ansatz für den Vergleich von Interaktionen zwischen DNA-Köder (z. B. zwei forensisches Einzel-Nukleotid-Varianten) und zwischen verschiedenen TFs oder TF Varianten11,12 ,14.

Mit eY1H-Assays, haben wir den größten menschlichen und Caenorhabditis Elegans DNA-zentrierten TF-DNA-Wechselwirkungen Netzwerke bis dato abgegrenzt. Insbesondere haben wir 2.230 Interaktionen zwischen 246 menschlichen Entwicklungs-Enhancer und 283 TFs12gekennzeichnet. Darüber hinaus haben wir eY1H Assays aufzudecken veränderten TF Bindung an 109 Einzel-Nukleotid forensisches Varianten zugeordnet Erbkrankheiten wie Entwicklungsstörungen Fehlbildungen, Krebs und neurologische Erkrankungen eingesetzt. Vor kurzem haben wir eY1H ein Netzwerk bestehend aus 21.714 Interaktionen zwischen 2.576 C. Elegans gen Promotoren und 366 TFs11abzugrenzen. Dieses Netzwerk wurde die funktionale Rolle der Dutzende von C. Elegans TFs aufzudecken.

Die Protokolle zum DNA-Köder Flecken zu generieren und die Ebenen der Reporter Hintergrundaktivitäten zu bewerten gewesen berichtet an anderer Stelle15,16,17. Hier beschreiben wir eine eY1H-Pipeline, die verwendet werden kann, menschlichen genomische DNA-Region gegen eine Reihe von 1.086 menschlichen TFs auf den Bildschirm. Sobald eine Hefe DNA-Köder Belastung entsteht und eine TF-Beute-Array wird auf die entsprechenden Platten entdeckt, kann das gesamte Protokoll innerhalb von zwei Wochen (Tabelle 1) durchgeführt werden. Noch wichtiger ist, kann das Protokoll parallelisiert werden, so dass ein einzelner Forscher 60 DNA-Köder-Sequenzen gleichzeitig Bildschirm kann. Um das Protokoll zu demonstrieren, haben wir die Veranstalter der beiden Zytokin-Gene CCL15 und IL17F überprüft. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse aus gescheiterten Bildschirme zu veranschaulichen die Arten von Problemen, die auftreten können, bei der eY1H-Assays und wie sie zu beheben.

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Protokoll

1. Vorbereitungen

  1. SC −U −H Platten (150 mm Petrischalen)
    Hinweis: Diese Platten werden für den Anbau von DNA-Köder-Hefestämme verwendet werden.
    1. Auflösen der Drop-out-Mix, Hefe-Stickstoff-Basis (YNB), Adenin Hemisulfate und Ammoniumsulfat in 920 mL Wasser und pH 5.9 mit 5 M NaOH (ca. 1 mL pro Liter Medien; siehe Tabelle 2 für Komposition). Gießen Sie in eine 2 L Flasche und fügen Sie eine Stir Bar.
    2. In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 950 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).
    3. Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.
    4. Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar. Fügen Sie die Glukose, auch auf einem Teller rühren mischen und auf 55 ° C im Wasserbad abkühlen lassen.
    5. Fügen Sie das Leucin und Tryptophan zu den Medien. Gut auf einem Teller rühren mischen Sie und gießen Sie in sterile Petrischalen 150 mm (~ 80 mL pro Teller). Für 3 – 5 Tage bei Raumtemperatur, trocken in Plastiktüten wickeln und für bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur lagern.
  2. YAPD rechteckigen Platten
    Hinweis: Diese Platten werden für den Anbau des Rasens für die DNA-Köder-Belastung und für die Paarung mit der TF-Array-Kollektion verwendet.
    1. Pulver (siehe Tabelle 3 für Komposition), mit Ausnahme von Agar, in 950 mL Wasser in eine 2 L Flasche auflösen und eine Bar unter Rühren hinzufügen.
    2. In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 950 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).
    3. Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.
    4. Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar.
    5. Fügen Sie die Glukose Mischung gut auf einen rühren Teller und Cool bis 55 ° C. Gießen Sie Medien in die rechteckigen Platten (siehe Tabelle der Materialien; ~ 70 mL pro Teller) mit einer peristaltischen Pumpe (5 mL/sec) und einen 6 mm Schlauch. Für 1 Tag bei Zimmertemperatur trocken in Plastiktüten wickeln und in den kalten Raum für bis zu 6 Monate zu speichern.
      Hinweis: Obwohl die vorgeschlagenen Medienlautstärke 70 mL pro Platte ist, kann 50-80 mL pro Platte verwendet werden. Die drei kritische Punkte zu beachten, wann Gießen Platten 1 sind), dass sie abgeglichen werden, so dass die Agar-Medien die gleiche Dicke in der Platte hat (ein flacher Tisch oder eine Oberfläche für Teller gießen und nicht im Stapel von mehr als sieben Platten Gießen) 2) Sicherstellung der Abwesenheit von Luftblasen im Agar Medien (Bläschen sollte sein tauchte mit einer sterilen Nadel) und 3) die Platten nur für einen Tag trocknen und verpacken die Platten in Plastiktüten zur Fehlervermeidung in Hefe anheften.
  3. SC −Trp und Sc −U −Trp rechteckigen Platten
    Hinweis: Diese Platten werden für den Anbau der TF-Array-Sammlung (Sc −Trp) und diploiden Hefe wählen nach der Paarung (Sc −U −Trp) verwendet werden.
    1. Auflösen der Drop-out-Mix, YNB, Adenin Hemisulfate und Ammoniumsulfat in 920 mL Wasser und pH 5.9 mit NaOH 5M (ca. 1 mL pro Liter Medien) (Zusammensetzung siehe Tabelle 4 ). Gießen Sie in eine 2 L Flasche und fügen Sie eine Stir Bar.
    2. In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 950 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).
    3. Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.
    4. Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar. Fügen Sie die Glukose, mischen und auf einem Teller rühren und kühlen bis 55 ° C.
    5. Fügen Sie das Leucin, Histidin und Uracil (weglassen der Uracil für den Sc −U −Trp Platten).
    6. Auch auf einem Teller rühren mischen und gießen Sie in rechteckigen Platten (~ 70 mL pro Teller) mit einer peristaltischen Pumpe (5 mL/sec) und 6 mm Schlauch. Für 1 Tag bei Raumtemperatur trocknen, die Platten in Plastiktüten wickeln und in den kalten Raum für bis zu 3 Monaten zu speichern.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal rechteckigen Platten
    Hinweis:     diese Platten dienen als Anzeige Platten eY1H Assays.
    1. Die Drop-out-Mix, YNB, Adenin Hemisulfate und Ammoniumsulfat in 850 mL Wasser auflösen (Zusammensetzung siehe Tabelle 5 ). Tun Sie nicht pH. Gießen Sie in eine 2 L Flasche und fügen Sie eine Stir Bar.
    2. In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 850 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).
    3. Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.
    4. Bereiten Sie 10 x BU Salze (1L vor) durch die Kombination von 900 mL Wasser, 70 g Na2HPO4∙7H2O und 34,5 g NaH2PO4∙H2O. Mix mit einer Rühren auflösen Pulver und passen den pH-Wert auf 7,0 mit 5 M NaOH. Fügen Sie Wasser, 1 L und Autoklaven zu bringen.
    5. Bereiten Sie die X-gal-Lösung durch eine 50 mL-Kunststoff-Rohr mit 42,5 mL Dimethyl Formamid 3,5 g X-gal-Pulver hinzufügen. Dimethyl Formamid, leichter aufzulösen X-gal-Pulver hinzufügen (Dies dauert 30 min). Halten Sie Stammlösung in der Dunkelheit (Verwendung opak 50 ml-Tube oder Abdeckung in Folie). Shop bei-20 ° C.
    6. Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar. Fügen Sie die Glukose und 10 x BU Salze (siehe Tabelle 5 für Komposition), mischen und auf einem Teller rühren und kühlen bis 55 ° C.
    7. Fügen Sie das Leucin, 3AT und X-gal (Zusammensetzung siehe Tabelle 5 ).
    8. Nun auf einem Teller rühren mischen und gießen Sie die rechteckigen Platten (~ 70 mL pro Teller) mit einer peristaltischen Pumpe (5 mL/sec) und einen 6 mm Schlauch. Für 1 Tag bei Zimmertemperatur trocken in Plastiktüten wickeln, und speichern Sie in den kalten Raum in Alu-Folie abgedeckt (3AT und X-gal sind lichtempfindlich) für bis zu 1 Monat.

(2) Schmierblutungen ein TF-array

  1. Auftauen der TF-Beute-array
    1. Die Hefe Glycerin Lager Platten mit dem TF-Beute-Array auf Eis auftauen.
      Hinweis: TF-Beute-Arrays können als zuvor veröffentlichten10,12,13,18generiert werden.
    2. Aufzuwirbeln Sie die Hefe mit einer 12-Kanal-Pipette innerhalb von 1 – 3 min. vor dem nächsten Schritt.
  2. Entdecken die Hefe in Sc −Trp rechteckige Platten
    1. Im HDA-Roboter (siehe Tabelle der Materialien), wählen Sie Multi-well-96-Platten als Quelle, 96 Agarplatten als Ziel und 96 lange Pin-Pads.
      Hinweis: PIN-Pads sind nicht wiederverwendbar und müssen verworfen werden.
    2. Wählen Sie das Replizieren viele Programm, zwei Kopien pro 96-Well-Platte zu machen. Verwenden Sie den Papierkorb nicht oder überdenken Sie Optionen zur Vermeidung von hinteren Kontaminationen der gefrorenen Bestände zu.
    3. Wählen Sie die Option nach oben und unten in der Quelle, die Hefe mischen wirbeln.
    4. Das gefleckte Array Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für 2 – 3 Tage.
  3. Erzeugung von 384 Kolonie Arrays in Sc −Trp rechteckigen Platten
    1. Wählen Sie in der Roboter 96 Agarplatten als Quelle, 384 Nährbodenplatte als Ziel und 96 kurze Pin-Pads.
    2. Wählen Sie die 1:4-Array -Programm. Auf diese Weise werden die vier 96 Kolonie Platten (jeweils eine unterschiedliche TF) in eine 384 Kolonie Platte konsolidiert. Verwenden Sie den Papierkorb nicht oder überdenken Sie Optionen zur Vermeidung von Kontaminationen zwischen verschiedenen Platten zu.
    3. Die Platten Tasche und inkubieren Sie die gefleckte 384-Kolonie Array Agar-Seite bei 30 ° C für 2 Tage.
  4. Erzeugung von 1.536 Kolonie Arrays in Sc −Trp rechteckigen Platten
    Hinweis: Dadurch werden Arrays enthalten vier Kolonien für jedes TF-Beute.
    1. Wählen Sie in der Roboter 384 Agarplatten als Quelle, 1.536 Agarplatten als Ziel und 384 kurze Pin-Pads.
    2. Wählen Sie das 1:4 Assay single-Source-Programm. Ziel ist es, jede Kolonie in vier Kolonien Quadruplicates zu kopieren. Verwenden Sie den Papierkorb und überdenken Sie Optionen zu, da es beinhaltet vier Mal jede Kolonie zu kopieren.
    3. Die Platten Tasche und inkubieren Sie die gefleckte 1536-Kolonie Array Agar-Seite bei 30 ° C für 3 Tage.
  5. Verstärkung der 1.536 Kolonie Array in Sc −Trp rechteckigen Platten
    1. Wählen Sie in der Roboter 1.536 Agarplatten als Quelle, 1.536 Agarplatten als Ziel und 1.536 kurze Pin-Pads.
    2. Wählen Sie das Replizieren viele Programm, 3 – 4 Kopien zu replizieren. Verwenden Sie den Papierkorb und überdenken Sie Möglichkeit zu, aber werfen Sie das Pad beim Umschalten auf eine andere Platte des Arrays um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
    3. Die Platten Tasche und inkubieren der gefleckte 1536-Kolonie Array Agar-Seite sich bei 30 ° C für 3 Tage bis zur Paarung Schritte (siehe unten) verwenden. Danach halten Sie die Platten bei Raumtemperatur und Kopie wieder nach 7 Tagen für eine neue Runde des Screenings.

3. eY1H Bildschirm

  1. DNA-Köder Sorte Rasen vorbereiten, Paarung
    1. Vor Ort die Hefe DNA-Köder-Stämme auf einer Sc −U −H Platte und wachsen für 3 Tage bei 30 ° C.
    2. Streifen Sie die Hefe in einem 15 cm Sc −U −H Platte mit einem sterilen Zahnstocher, so, dass jede Platte 12 – 16 verschiedene Stämme passt. Inkubieren Sie eines Tages bei 30 ° C.
    3. Streifen Sie die Hefe in einem 15 cm Sc −U −H Platte mit einem sterilen Zahnstocher, so, dass jede Platte 4 verschiedene Stämme passt. Eines Tages bei 30 ° c inkubieren
    4. Kratzen Sie die Hefe mit einem sterilen Zahnstocher, und achten Sie nicht auf Schaben Agar und in ein 1,5 Rohr mit 500 µL steriles Wasser.
    5. Fügen Sie 10 – 15 sterile Glasperlen auf einer rechteckigen Platte YAPD. Fügen Sie die Hefesuspension auf den Teller und kräftig schütteln Sie, in alle Richtungen für 1 min um sicherzustellen, dass die Hefe durch die Platte verteilt ist.
    6. Umkehren Sie die Platte sofort und tippen Sie auf, so dass die Perlen in den Deckel gehen. Entfernen und die Perlen zu recyceln.
    7. Die Platten Tasche und inkubieren Agar-Seite nach unten für 1 – 2 Tage bei 30 ° C. Dann fahren Sie mit der Paarung Schritt.
  2. Paarung von Hefe DNA-Köder und TF-Array-Stämme
    1. Übertragen Sie das TF-Array zu einer rechteckigen Platte YAPD mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatte als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Replizieren viele Programm. Jeder TF-Array-Platte lässt sich auf 3 – 4 YAPD Platten (abhängig von der Anzahl der Platten in dem Array) zu übertragen. Die TF-Array-Platten verwendet für die Paarung müssen 2 – 3 Tage alt sein, aber nicht mehr als Paarung möglicherweise ineffizient.
    2. Übertragen Sie den Rasen eines DNA-Köder-Stamm auf die YAPD-Platten bereits mit dem TF-Array mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatte als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Replizieren viele Programm. Verwenden Sie einen zufälligen Offset in der Quelle mit einem Radius von ~0.6 mm um zu vermeiden, Hefe von der gleichen Stelle und mischen auf Ziel Kontakt zwischen Hefestämme zu erleichtern. Verwenden Sie den Rasen mit den DNA-Köder-Stämme (Abschnitt 3.1) als Quelle und die YAPD-Platten mit der TF-Array in Schritt 3.2.1 als Ziel gesichtet.
    3. Die Platten Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für 1 Tag.
  3. Auswahl der diploiden Hefe
    1. Übertragen Sie die begatteten Hefe aus den YAPD Platten auf Sc −U −Trp Platten mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatte als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Programm zu replizieren . Mischen Sie auf Quelle und Ziel.
    2. Die Platten Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für 2 – 3 Tage (längere Inkubationszeit führt zu hohen Hintergrundaktivität Reporter).
  4. Transfer zum Auslesen Platten
    1. Übertragen Sie die diploide Hefe aus den Sc −U −Trp Platten auf Auslesen rechteckigen Platten Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatten als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Programm zu replizieren .
    2. Die Platten Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für bis zu 7 Tage.
  5. Darstellung der Anzeige Platten
    1. Fotografieren Sie für DNA-Köder-Sorten mit hoher Hintergrundaktivität Reporter an den Tagen 2, 3 und 4. Andernfalls nehmen Sie Bilder bei Tag 4 und 7. Positive Interaktionen werden durch Wachstum und blaue Farbe der Hefe Kolonien identifiziert und manuell ermittelt werden, oder es kann ermittelt werden, mit Bildanalyse-Software.

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Ergebnisse

Drei wesentliche Faktoren berücksichtigt werden, wenn Analyse ergibt sich aus eY1H Assays: Reporter Hintergrundaktivität des DNA-Köder-Stammes, die Stärke der Reporter Aktivität entsprechend TF-DNA-Wechselwirkungen und die Anzahl der positiven Kolonien. Der Reporter Hintergrundaktivität (d. h. Autoactivity) der DNA-Köder Belastung bezieht sich auf das Wachstum und die Farbe der Hefe Kolonien auf der Platte auslesen, auch in Abwesenheit des TF-Beute. Im Idealfall nicht Autoactive Stämme zeigen eine weiße oder hel...

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Diskussion

Der hier beschriebene stark Roboter eY1H Paarung Screening Ansatz erhöht den Durchsatz um den Satz von TFs zu identifizieren, die an eine DNA-Region, im Vergleich zu früheren Bibliothek Screening oder angeordneten Screening Ansätze beruhen auf Umwandlung zu binden. Weiter, die TF-DNA-Wechselwirkungen von eY1H, die Tests sehr reproduzierbar sind, da 90 % der Interaktionen erkannt sind positiv für alle vier Kolonien pro TF getestet, und 90 % der Interaktionen testen in einem unabhängigen Bildschirm des gleichen Hefe D...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health [R35-GM128625, J.I.F.B.].

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLCSigmaA8056-100GCompetitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrateUS BiologicalsA0865Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological gradeAmerican International ChemicalAGHGUPNutritive media for yeast growth
Ammonium SulfateUS BiologicalsA1450Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose AnhydrousUS BiologicalsG3050Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen baseUS BiologicalsD9540-02Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH MeterHanna InstrumentsHI2020-01To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ctDiamondTo streak yeasts on petridishes
Glass BeadsWalter Stern100CTo spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99%Millipore SigmaG9012-1LRequired to make frozen yeast stocks
L-HistidineUS BiologicalsH5100For yeast growth selection in selective media
L-LeucineUS BiologicalsL2020-05For yeast growth selection in selective media
L-TryptophanSigmaT-0254For yeast growth selection in selective media
N,N-DimethylformamideSigma319937-1LTo make X-gal solution
Omnipense EliteWheatonW375030-AFor dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, BacteriologicalAmerican International ChemicalPEBAUPProtein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mmVWR10753-950For growing yeast baits for screening
PlusPlatesSinger InstrumentsPLU-003To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated IncubatorThermoFisher ScientificPR205745RTo incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 shortSinger InstrumentsREP-005To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 shortSinger InstrumentsREP-004To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 longSinger InstrumentsREP-001To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 shortSinger InstrumentsREP-002To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robotSinger InstrumentsFor transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)FisherS318-1For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrateSanta Cruz Biotechnologysc-203402CRequired for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrateSanta Cruz Biotechnologysc-202342BRequired for LacZ reporter activity on X-gal 
UracilSigmaU0750-100GFor yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)Gold BiotechnologyX4281C100β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast ExtractUS BiologicalsY2010Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS US BiologicalsY2030Required for vigorous yeast growth

Referenzen

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  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
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