3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.

Zusammenfassung

Verschiedene Begrenzungen von 2D-Zellkultursystemen haben Interesse an 3D-Zellkulturen und-analyseplattformen geweckt, die die räumliche und chemische Komplexität lebender Gewebe besser nachahmen und in vivo-Gewebefunktionen nachahmen würden. Die jüngsten Fortschritte in der Mikrofabrikationstechnologie haben die Entwicklung von 3D-Umgebungen in vitro-Umgebungen erleichtert, in denen Zellen in eine klar definierte extrazelluläre Matrix (ECM) und eine definierte Reihe löslicher oder matrix assoziierter Biomoleküle integriert werden können. Die technologischen Barrieren haben jedoch ihren weit verbreiteten Einsatz in Forschungslabors eingeschränkt. Hier beschreiben wir eine Methode, um einfache Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multizellulären Organoiden in 3D-Mikroumgebungen mit einem definierten Chemoattractant Farbverlauf zu experimentieren. Wir veranschaulichen die Nutzung dieser Plattform zur Analyse der Reaktion von Epithelzellen und Organoiden auf die Abstufungen von Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF). EGF-Steigungen waren in den Geräten für mehrere Tage stabil, was zu einer gerichteten Zweigbildung bei Brustorganoiden führte. Diese Analyse ließ zu dem Schluss kommen, dass die kollektive Gradientenwahrung durch Zellgruppen empfindlicher gegenüber einzelnen Zellen ist. Wir beschreiben auch die Herstellungsmethode, die weder Photolithografieanlagen noch fortgeschrittene Soft-Lithografie-Techniken erfordert. Diese Methode wird hilfreich sein, um 3D-zelluläre Verhaltensweisen im Zusammenhang mit der Analyse von Entwicklung und pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs, zu untersuchen.

Einleitung

In physiologischer Umgebung sind Zellen in eine extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet und einer Fülle von Biomolekülen ausgesetzt. Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Mikroumgebung regulieren intrazelluläre Prozesse, die verschiedene Phenotypen steuern, darunter Migration, Wachstum, Differenzierung und Überleben^{1, 2.} In einer herkömmlichen 2D-Zellkultur wurde viel über zelluläre Verhaltensweisen gelernt. Mit dem Aufkommen von intravitalen Bildgebungen und Experimenten mit Zellen, die in 3D-Hydrogelen eingebettet sind, wurden jedoch wichtige Unterschiede in den Zellverhalten in den vereinfachten 2D-In-vitro-Kulturen vs. 3D-Gewebehung-ähnlichen Umgebungen erkannt. Während die Zellen mit ECM-Fasern interagieren und ihre mechanischen Eigenschaften innerhalb der 3D-Matrix spüren, ist die Materialsteifigkeit des Gels keine vollständig unabhängige Variable in einem 2D-In-vitro-System. Die Dimensionalität verändert die fokale Haftbildung, was zu einer unterschiedlichen Zellmorphologie und zum Verhalten führt. Darüber hinaus sind Zellen auf einer 2D-Oberfläche weniger Signalkassen ausgesetzt als Zellen, die in 3D für alle Richtungen offen sind.

Diese Einschränkungen haben die Interessen für 3D-Systeme erhöht, die die räumliche und chemische Komplexität lebender Gewebe repräsentieren und besser in vivo-Gewebefunktionen vorhersagen. Sie wurden in vielen Formen entwickelt, von Organoiden als sich selbst zusammenstellende zelluläre Mikrostrukturen bis hin zu Zellen, die zufällig in ECM^3,4durchsetzt sind. Die jüngsten Fortschritte in der Mikrofabrikationstechnologie haben das Aufkommen verschiedener Arten von 3D-Kultursystemen^5,6^{,7, 8, 9 für}die Untersuchung phänotypischer Veränderungen und Mobilartige Reaktionen auf lösliche Signale; Technische Barrieren schränken jedoch den weit verbreiteten Einsatz in Forschungslabors ein. In vielen Fällen erfordern die Herstellungsprozesse Photolithografietechniken und Hintergrundwissen für weiche Lithografie. Darüber hinaus müssen verschiedene Faktoren kontrolliert werden, um ein Gerät erfolgreich zu bauen und über einen langen Zeitraum eine optimale Funktion des Gerätes zu erreichen.

Unsere Methode beschreibt, wie man ein 3D-PDMS-Gerät konstruiert, um Zellen und multizelluläre Organoide in eine 3D-Mikroumgebung mit definierten Chemoattracten-Farbverläufen zu integrieren und dann epitheliale Reaktionen auf EGF¹⁰zu analysieren. Unsere Daten zeigen, dass die Fähigkeit von Organoiden, auf flache EGF-Steigungen zu reagieren, aus der interzellulären chemischen Kopplung durch Spaltknoten entsteht. Es schlägt das Potenzial von Organoiden für eine präzisere Erkennung von schwachen und lauten räumlich gestaffelten Eingängen vor. Der Herstellungsprozess erfordert weder eine Reinraumanlage noch Photolithografietechniken. Das 3D-PDMS-Gerät enthält jedoch notwendige Faktoren der 3D-physiologischen Umgebung. Diese Methode wird hilfreich sein, um 3D-zelluläre Verhaltensweisen zu studieren und es hat ein großes Forschungspotenzial mit verschiedenen Zelltypen, Chemoattractants und ECM-Kombinationen.

Protokoll

Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee, Johns Hopkins University, School of Medicine, geprüft und genehmigt wurden.

1. Herstellung des mesofluidischen Geräts

1. Entwerfen Sie die Maske der Form für PDMS-Gerät mit einer 3D-CAD-Software.
2. Drucken Sie die Form mit Stereolithografiegeräten mit einem wärmebeständigen Harz.
   Hinweis: Die hier beschriebenen Verfahren wurden von einem kommerziellen 3D-Druckdienst durchgeführt.
3. Mischen Sie eine PDMS-Monomerlösung mit dem Härtemittel in einem 10:1-Verhältnis gründlich. 3 mL PDM-Mischung wurde für die Herstellung des Gerätes benötigt. Das Gesamtvolumen hängt von der Anzahl der zu fertiger Formen ab.
4. Das Gemisch durch den Einsatz eines eigenen Laborvakuums oder einer Vakuumpumpe in einem Vakuumtrockner 1 Stunde abstaubar.
5. Die Oberfläche der Form mit einem Klebeband ablöschen, um Staub zu entfernen, und dann die PDMS-Mischung in die Form gießen. Wenn Blasen in den Prozess eingeführt werden, wiederholen Sie die Entgasung im Vakuumtrockner. Blasen, die zwischen den Säulen der Form gefangen sind, können entfernt werden, indem man sie mit einer scharfen Nadel versenkt.
   Achtung: Der Entgasungsprozess bei Raumtemperatur sollte innerhalb von 1 Stunde oder weniger durchgeführt werden.
6. Sichern Sie den PDMS, indem Sie bei 80 ° C für 2 Stunden heizen. Lassen Sie die Form bei Raumtemperatur abkühlen.
7. Schneiden Sie die Grenze zwischen Schimmel und PDMS mit einer Klinge und schälen Sie dann PDMS von der Form vorsichtig ab.
8. Das PDMS-Teil auf die 22 mm x 22 mm Coverslip montieren und ein Loch am Eingang schlagen.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
9. Reinigen Sie das PDMS-Keil und 22 mm x 22 mm Koverslip, indem Sie die Oberflächen mit Lowlint-Gewebe und 70% Ethanol abwischen. Dann große Staubpartikel entfernen, indem sie mit einem Klebeband abnehmen.
10. Sterilisieren Sie das PDMS-Teil und kupfen Sie entweder durch Autoklaven (121 ° C für 8 Minuten nass, 15 Minuten trocken) oder durch UV-Licht für 1 Stunde.
11. Die Unterseite des PDMS-Teils behandeln und mit einer Korona-Auslasspistole 5 min in der Gewebekultur abdecken und dann miteinander verbinden.
    CAUTION: Legen Sie alle nicht leitenden Materialien wie Polystyrol-Schaum auf den Boden und entfernen Sie dabei alle leitenden Materialien. Sammeln innerhalb von 5 Minuten nach der Behandlung in das Gerät einspritzen, um die Bindung zwischen Kollagengel und Glaskappenlippe zu erhöhen.

2. Zellvorbereitung: Primäres Säugetierorganoid-Isolierung

Hinweis: Die Details der Säugetierung der Organoiden finden Sie in einem früheren Werk 11. Jede Art von Einzelzelle oder Organoid kann nach eigenen Isolation-/Ablösungsprotokollen hergestellt werden.

1. Das Brustdrüsengewebe der Mäuse mit einem Skalpell würfeln, bis sich das Gewebe entspannt und 30 min bei 37 ° C in 50 mL Collagenase-/Trypsin-Lösung (10 mL pro Maus) in DEME/F12 mit 0,1 g Trypsin, 0,1 g Kollagenase, schütteln , 5 mL FBS, 250 μL von 1 μg/mL Insulin und 50 μL von 50 μg/mL gentamicin.
2. Zentrifuge die Collagenase/trypsin Lösung mit 1.250 x g für 10 min. Entfernen Sie den Supernatant durch Aspiration. Die Zellen in 10 mL von DMEM/F12 und die Zentrifuge mit 1.250 x g für 10 min zerlegen. Nach dem Entfernen von DMEM/F12 durch Aspiration, wieder Suspendierung von Zellen in 4 ml DMEM/F12 mit 40 μL DNase (2 units/μL) ergänzt.
3. Schütteln Sie die DNase-Lösung von Hand für 2-5 min und dann Zentrifuge mit 1.250 x g für 10 min.
4. Trennen Sie Organoide von einzelnen Zellen durch vier Differentialzentrifugationen (pulsieren Sie auf 1.250 x g und stoppen Sie die Zentrifuge 3-4 s, nachdem sie die beabsichtigte Geschwindigkeit erreicht hat). Zwischen jedem Puls, saugen Sie den Supernatant und erneuern Sie das Pellet in 10 mL DMEM/F12.
5. Das abschließende Pellet in der gewünschten Menge an Wachstumsmedium von DMEM/F12 mit 1% Penicillin/Streptomycin und 1% Insulin-Transferrin-selenium-X für die Kollagenvorbereitung neu aussetzen.

3. Kollagenvorbereitung und Injektion

Hinweis: Andere ECM-Gele können nach eigenen Gelengeprotokollen hergestellt werden.

1. Bereiten Sie Collagen-Typ I-Lösung (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH-Lösung, normales Wachstumsmedium auf Eis.
   Achtung: Halten Sie Eis auf, bis das Verfahren abgeschlossen ist.
2. 6 μL von 1 N NaOH-Lösung, 200 μL Wachstumsmedium und 50 μL von 10x DMEM in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr geben und die Lösung gründlich vermischen.
3. 425 μL Kollagen in die vorgemischte Lösung geben und durch Pipettieren gründlich mischen.
4. Zentrifugen Sie die Kollagenmischung kurz (weniger als 5 Sekunden), um Blasen aus der Mischung zu trennen und zu entfernen.
5. Halten Sie die neutralisierte Kollagenlösung 1 Stunde lang auf Eis, um die Faserbildung zu induzieren.
6. 50 μL Zellaufhängung in das Kollagen-Gemisch geben und gründlich mischen.
   Hinweis: Die endgültige Kollagenkonzentration beträgt 2 mg/mL.
7. Die Lösung mit 200 μL Pipet über den Eingang des PDMS-Geräts eingeben, bis die ganze Kammer ausgefüllt ist. Wenn das Kollagengemisch durch die Lücken der Säulen überfließt, schneiden Sie das überschüssige Kollagengel mit scharfem OP-Klinge nach Gelation aus.
8. Halten Sie das Gerät im Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO₂ für 1 Stunde, um Gelation zu induzieren.
9. Füllen Sie die Behälter beidseitig mit Wachstumsmedium aus und halten Sie das Gerät bei 37 ° C mit 5% CO2 im Inkubator, bis eine konfokale Bildgebung durchgeführt wird.

4.3D-Bildgebung und Quantifizierung

1. Installieren Sie eine Live-Zell-Bildationskammer in ein konfokales Mikroskop und stellen Sie die Temperatur und CO 2 auf 37 ° C bzw. 5% vor. Um Feuchtigkeit zu erhöhen, Wasser in den Behälter der Kammer geben und bei Bedarf nasse Tücher in die Kammer legen.
2. Legen Sie das PDMS-Gerät in die Kammer und fügen Sie EGF zu einem der Reservoirs als "Quelle" des EGF in der Gradientenbildung hinzu. Das andere Reservoir wird einem "Spülbecken" dienen, das für die Entwicklung der räumlich gestaffelten EGF-Verteilung benötigt wird. 2,5 nM EGF wurde in der Spüle für die Herstellung der Steigung von 0,5 nM/mm in dieser Studie hinzugefügt.
3. Stellen Sie die Palette des Z-Stapels ein, der das Volumen der organoiden von Interesse abdeckt, und starten Sie die Bildgebung.
   CAUTION: Um die Phototoxizität zu vermeiden, versuchen Sie eine geringere Laserintensität in der konfokalen Bildgebung oder verwenden Sie Multi-Photon-Bildgebungstechniken.
4. Rekonstruieren Sie ein 3D-Bild aus 2D-Bildstapel mit kommerzieller Software oder einem maßgeschneiderten Programm. Messen Sie die Länge und den Winkel der Zweige, die sich von den Organoiden oder der Migration einzelner Zellen erstrecken. Führen Sie hier die Quantifizierung durch, indem Sie mit ImageJ eine freie Umrisslinie um den organoiden Körper ziehen.

Ergebnisse

EGF ist ein wesentlicher Regulator für die Verzweigung der Morphogenese in Brustdrüsen und ein kritischer Chemoattractant, der die Migration von Brusepithelzellen bei invasivem Krebswachstum leitet. Wir haben die oben beschriebenen mesoskopischen fluidischen Geräte verwendet, um die Reaktion der Zellen auf definierte EGF-Fardienten zu untersuchen (Abbildung 1A, B) 10. Das Gerät ergibt einen 5 mm breiten, 10 mm lang...

Diskussion

Die Herstellung von PDMS-Formen erfolgte mit einem kommerziellen 3D-Druckservice, kann aber auch mit einem High-End-3D-Drucker im eigenen Haus durchgeführt werden. Die Stereolithographie wird unter den verschiedenen 3D-Fertigungsmethoden für hochauflösende Formengenerationen empfohlen. Da die PDMS-Härtung bei einer hohen Temperatur (80 ° C) erfolgt, sollten die Materialien ausreichend thermisch beständig sein, was bei Auslagerung des Drucks explizit angegeben werden sollte. Eine thermische Nachkur kann mit dem Druc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935