Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Mitochondriale Atmung ist entscheidend für das organismal überleben; Sauerstoff-Verbrauch ist daher ein hervorragender Indikator für mitochondriale Gesundheit. In diesem Protokoll wir beschreiben die Verwendung von handelsüblichen Respirometer basale messen und maximale Sauerstoff-Verbrauch im Leben, intakt und frei bewegliche Caenorhabditis Elegans.

Zusammenfassung

Optimale Funktion der Mitochondrien ist wichtig für gesunde Zellaktivität, besonders in Zellen mit hohem Energiebedarf wie in das Nervensystem und Muskel. Einklang mit diesem, wurde mitochondriale Dysfunktion assoziiert mit einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen und Altern im Allgemeinen. Caenorhabditis Elegans wurden mächtige Modellsystem für die Aufklärung der vielen Feinheiten der mitochondrialen Funktion. Mitochondriale Atmung ist ein starker Indikator für die Funktion der Mitochondrien und neu entwickelte Respirometers bieten eine State-of-the-Art Plattform, um die Atmung in den Zellen zu messen. In diesem Protokoll bieten wir eine Technik, um live, intakte C. Eleganszu analysieren. Dieses Protokoll umfasst einen Zeitraum von ~ 7 Tage und umfasst Schritte für (1) wachsen und Synchronisation von C. Elegans (2) Vorbereitung von Verbindungen injiziert werden und Hydratation der Sonden, be- und Patrone Gleichgewichtherstellung Medikament (3), (4) Vorbereitung der Wurm assay Platte und Assay laufen und (5) nach dem Experiment Datenanalyse.

Einleitung

Adenosintriphosphat (ATP), die Hauptquelle der Zellenergie, wird durch Enzyme in der Elektronentransport-Kette (etc.) befindet sich in der inneren mitochondrialen Membran in den Mitochondrien produziert. Pyruvat, eine wichtige Metaboliten genutzt für mitochondriale ATP-Produktion, wird in der mitochondrialen Matrix importiert es decarboxyliert ist, Acetyl Coenzym A (CoA) zu produzieren. Acetyl-CoA tritt anschließend der Zitronensäure-Zyklus, was bei der Erzeugung von Nicotinamid Adenin Dinucleotide (NADH), eine wichtige Elektron Trägermolekül. Da Elektronen von NADH zu Sauerstoff über die usw. übergeben werden, aufbauen Protonen in die mitochondriale Intermembran Raum, die Ergebnisse in der Generation eines elektrochemischen Gradienten durch die Membran. Diese Protonen fließt dann aus dem Intermembran Raum in diesem elektrochemischen Gradienten zurück in der mitochondrialen Matrix durch die Proton-Pore des ATP-Synthase, fahren die Rotation und die Synthese von ATP¹ (Abbildung 1).

Mitochondriale Funktion beschränkt sich nicht nur zur Energiegewinnung sondern ist auch entscheidend für die Kalzium-Homöostase, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) aufräumen und Apoptose, kritisch Positionierung ihrer Funktion im organismal Gesundheit². Mitochondriale Funktion kann mit einer Vielzahl von Tests, einschließlich aber nicht beschränkt auf Analysen, die mitochondriale Membranpotential messen, ATP und ROS Ebenen und mitochondriale Kalzium-Konzentrationen bewertet werden. Jedoch diese Assays zur Verfügung stellen einer Momentaufnahme der mitochondrialen Funktion und daher möglicherweise nicht bietet einen umfassenden Überblick der mitochondrialen Gesundheit. Da Sauerstoff-Verbrauch bei der ATP-Generierung auf eine Vielzahl von sequentiellen Reaktionen angewiesen ist, dient es als eine überlegene Indikator für die Funktion der Mitochondrien. Interessanterweise sind Variationen in Sauerstoff-Verbrauch durch mitochondriale Dysfunktion^3,4,5beobachtet worden.

Sauerstoff-Verbrauch (OCR) von lebenden Proben gemessen werden, mit Techniken, die im großen und ganzen in zwei Gruppen eingeteilt werden können: amperometrischen Sauerstoffsensoren und Porphyrin-basierte Leuchtstoffe, die durch Sauerstoff⁶gestillt werden können. Amperometrischen Sauerstoffsensoren sind weitgehend nach Maß OCR in kultivierten Zellen, Geweben, und Modellsysteme, wie C. Elegansbenutzt worden. Porphyrin-basierte Phosphore mit Respirometers besitzen jedoch folgende Vorteile: (1) sie ermöglichen eine Gegenüberstellung zweier Proben in dreifacher Ausfertigung, (2) sie benötigen kleinere Stichprobengröße (z. B. 20 Würmer pro Bohrloch im Vergleich zu ~ 2, 000−5, 000 Würmern, in der Zeiten während der experimentellen ausführen, wodurch die Notwendigkeit für manuelle Anwendung gewünscht Kammer)⁷, und (3) der Respirometer kann programmiert werden, dazu vier verschiedene zusammengesetzte Injektionen an.

In diesem Protokoll sind Schritte im Umgang mit einem Porphyrin-basierte Sauerstoff-Sensor Respirometer Maßnahme OCR in live, intakte C. Elegans beschrieben. Zwar gibt es ein schriftliches Protokoll für die Verwendung von großformatigen, Hochdurchsatz Respirometer⁸, wurde dieses Protokoll für die Verwendung mit einem mehr Budget-freundlich, zugänglich und kleineren Maßstab-Instrument angepasst. Dieses Protokoll eignet sich besonders für die Beurteilung des Unterschied in OCR zwischen zwei Stämmen, wo Hochdurchsatz-Screening ist nicht erforderlich und seine Verwendung wäre übertrieben.

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Protokoll

Hinweis: Abbildung 2 bietet einen schematischen Überblick über das vollständige Protokoll.

1. Wachstum und Synchronisation von Nematoden Bevölkerung^9,10

1. L4-Larven von gewünschten genetischen Hintergründen zu übertragen (z. B. N2 [Wildtyp] und Sel-12 Tiere) auf Nematoden Medien (NGM) Wachstumsfugen (Rezept siehe Tabelle 1 ) mit einem Rasen von Escherichia coli (OP50)¹¹frisch ausgesät. Verwenden Sie mindestens zwei 100 mm oder drei 60 mm Platten für jede Belastung. Inkubieren Sie die Würmer bei der entsprechenden Wachstum Temperatur (zwischen 15 – 25 ° C), für 3 – 4 Tage oder bis Platten mit großen Anzahl von Eiern und trächtigen Würmern konzentriert sind.
2. Waschen Sie die Eier und Würmer von den Tellern mit ca. 6 mL M9 Puffer (siehe Tabelle 1 für Rezept) pro 100 mm Platte von Nematoden und Transfer Glas mit Pasteur Pipetten in einzelnen 15 mL Zentrifuge Rohre für jede Belastung. Diese Rohre Spin-down für 3 min bei 6.180 x g und Absaugen, die M9-Puffer, behalten nur die Tiere und Eier Pellet.
3. 3 – 4 mL Bleichmittel-Lösung zugeben (siehe Tabelle 1 für Rezept) zu jedem Rohr und zeitweise Wirbel für 6 min. hinzufügen M9 Puffer füllen jedes Rohr und drehen bei 6.180 x g für 1 min und aspirieren überstand. Diese waschen mit M9 dreimal wiederholen und das Ei Pellet in eine frische 15 mL Röhrchen mit ca. 9 mL M9 Puffer verschieben.
4. Synchronisieren der frisch geschlüpften Würmer durch Nutating bei 20 ° C für 16 / 48 h. Spin diese Rohre nach unten bei 6.180 x g für 1,5 min und legte die synchronisierten L1 Tiere auf NGM Einzelplatten, frisch entkernt mit einem Rasen von OP50 (ca. 6.000-10.000 Tiere pro 100 mm Platte) und halten Sie bei 20 ° C.
5. Diese Tiere erreichen das Larvenstadium L4 nach ~ 42 h. Zu diesem Zeitpunkt verschieben die L4-Larven mit einem Platin Pick, OP50 ausgesät NGM Platten mit 0,5 mg / mL 5-Fluoro-2'-Deoxyuridine (FUdR) zu verhindern, dass sie Nachkommen produzieren.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Stämme innerhalb eines Experiments über einen ähnlichen Zeitraum hinweg synchronisiert werden. FUdR Behandlung der Tiere sterilisiert und verhindert, dass Ei legen und Nachkommen-Produktion, die OCR beeinflussen könnten. Diese sterilisierte Tiere werden am nächsten Tag (Tag 1 Erwachsene Tiere ~ 66 h) für die Tests ausgewertet. FUdR wurde gemeldet, die Physiologie und die Lebensdauer von bestimmten mutierten Würmern auswirken. Daher sollte dies berücksichtigt werden wenn das Medikament für Sterilisation^12,13,14verwendet wird. Würmer können auch mittels der Femininisierung Mutationen wie fem-1(hc17) oder fem-3(e2006) sterilisiert werden. Allerdings könnte diese Mutationen mitochondriale Funktion auswirken.

2. Vorbereitung von Verbindungen injiziert werden und Hydratation der Sonden

Hinweis: Während der Test ausführen, werden beide basal und maximale Atmung Sätze von den Nematoden gemessen. Maximale Atmung wird bei den Tieren auf die Zugabe von Carbonyl Zyanid-4 (Trifluormethoxy) Phenylhydrazone (FCCP), ein abkoppeln Ionophore, der mitochondrialen Membranpotentials stört und damit die ATP-Synthese mit dem Transport von Protonen ausgelöst durch die mitochondriale Membran abgekoppelt gleichzeitig Protonen Pumpen, Elektronentransport und Sauerstoffverbrauch,^4,15 gehen von der ATP Synthese (Abbildung 1). Der letzte Schritt im Test beinhaltet die Zugabe von Natriumazid (NaN-₃), ein Medikament, das hemmt die komplexe IV und V in die ETC, so dass man nicht mitochondriale Atmung¹⁶ (Abbildung 1) zu bestimmen. Die folgenden Schritte können am Tag vor dem eigentlichen Test-Lauf durchgeführt werden.

1. Bereiten Sie 1 mL Stammlösungen der FCCP (10 mM in Dimethyl Sulfoxid [DMSO]: 1000 x die endgültige Assay-Konzentration) und NaN₃ (400 mM dH₂O: 10 x letzte Assay-Konzentration) und bei-20 ° C.
   Hinweis: Führen Sie verpflichtet eine Konzentrationskurve optimieren die Konzentration von FCCP um maximale OCR-Antwort für jedes Instrument und Laborumgebung zu entlocken.
2. Hydrat der Sensorkassette durch Zugabe von 200 µL dH₂O jedes gut (und die umliegenden Reservoir) in der Platte, sicherzustellen, dass des Sensors, die Sonden im dH₂O und über Nacht bei Raumtemperatur lagern untergetaucht sind.
   Hinweis: Die Patrone, die Sonden gelassen werden können bis zu 72 h untergetaucht, aber im Falle einer längeren Hydration, sollten die Platten in Paraffin Film gewickelt und bei 4 ° c gelagert Wenn über Nacht Flüssigkeitszufuhr nicht möglich ist, sollte der Sensorkassette für mindestens 4 Stunden vor Assay hydratisiert.
3. Schalten Sie das Heizelement innerhalb der Respirometer-Schnittstelle und lagern Sie das Gerät in einer Brutmaschine 15 ° C über Nacht zu niedrigeren Kerntemperatur innerhalb des Instruments zu verhindern, dass die Tieren Überhitzung während des Tests ausführen.
   Hinweis: Die Respirometer ist mit einem Heizelement ausgestattet aber kann nicht gekühlt werden. Innerhalb einer 15 ° C Inkubator haben die Respirometer eine stabile Temperatur zwischen 18-22 ° C, die eine gesunde Temperatur für C. Elegans Wartung ist.

3. Medikament be- und Patrone entnehmen

1. Pipette heraus und entsorgen Sie die dH₂O verwendet, um die Sensor-Hydrat-Sonden und ersetzen Sie es mit 200 µL der Kalibrator Lösung (pH-Wert 7,4) in jede Vertiefung. FCCP Vorratslösung bis 100 µM FCCP dH₂O verdünnen und die Injektion Port A in der Sensorkassette 20 µL der verdünnten Lösung hinzufügen. Anschluss B der Senor Patrone 22 µL 400 mM Natriumazid hinzufügen.
2. Aktivieren Sie die Respirometer und wählen Sie im home-Bildschirm starten; die Vorlagen-Seite wird angezeigt. Wählen Sie auf der Seite "Vorlagen" leere oder eine zuvor entworfenen Vorlage; die Seite "Gruppen" wird angezeigt. Auf der Seite "Gruppen" die Brunnen A und H als die Hintergrund-Brunnen und zuordnen der verbleibenden 6 Brunnen in entsprechende Gruppen entsprechend der Versuchsplan.
3. Drücken Sie den Pfeil auf der rechten unteren Ecke, um das Protokoll-Seite gehen. Sicherstellen Sie auf der Seite "Protokoll", dass die äquilibriert, basale und Injektionen 1 und 2 -Tasten ausgewählt werden. Auf dieser Seite stellen Sie die Anzahl der Messwerte der basalen OCR sowie maximale OCR (nach Injektion 1 mit FCCP) und nicht-mitochondriale OCR (nach Injektion 2 mit Natriumazid).
   Hinweis: Jede Messung vorangestellt ist eine Mischung und Warteschritt und den Zeitrahmen für diese Parameter sind in Tabelle 2gezeigt.
4. Wählen Sie den Pfeil in der unteren rechten Ecke und erscheint eine Aufforderung, die Sensorplatte Patrone zu laden. Sicherstellen Sie, dass die Sensorplatte Patrone in der richtigen Orientierung, nach den Anweisungen auf der Erinnerungsseite Prompt geladen wird. Die Respirometer wird nun die Patrone equilibrate.
   Hinweis: Diese Gleichgewichtherstellung bietet genügend Zeit, setzen Sie die Tiere in entsprechenden Vertiefungen der Zellplatte untersucht werden.

4. Vorbereitung der Wurm Platte und Assay laufen

1. Fügen Sie 200 µL Puffer M9 in jeder der 8 Brunnen der Zellplatte und in den Stauseen rund um den Brunnen.
2. Wählen Sie ~ 100 Würmer aus jedem Stamm auf ungesetzte NGM Teller und Ruhe für ca. 2-3 min. nass am Ende der Platin Pick mit M9 Puffer und wählen Sie 20 Alter synchronisiert Tiere in Brunnen B-G, wobei der Hintergrund Brunnen A und H leer lassen.
   Hinweis: Nach dem Laden jedes nun, warten Sie ca. 2 min, die Tiere in den Boden der Näpfchen zu begleichen. Es ist auch ratsam, dass eine Wurm Nummer Kurve ausgeführt werden, um die Wurm-Anzahl pro Bohrloch für jedes Instrument und das Labor zu optimieren.
3. Jetzt sollte das Respirometer kalibriert werden und indem Sie auf OK , auf dem Bildschirm, die Platte mit Kalibrierung Puffer wird ausgeworfen und kann aus der Respirometer entfernt werden, während der Sensorkassette im Inneren des Gerätes bleibt. Ersetzen Sie die Kalibrator-Platte mit der Platte mit Tieren. Platte zu laden und die Tür schließen, indem Sie auf weiter und ermöglichen des Tests ausgeführt.

5. nach dem Experiment Datenanalyse

1. Sobald der Test abgeschlossen ist, folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm und entfernen Sie der Zellplatte und Sensor-Steckmodul und fügen Sie ein Flash-Laufwerk am USB-Anschluss die Laufdaten in der .war-Format zu speichern. Entfernen Sie der Sensorkassette und die Tiere auf den Boden der Näpfchen zu begleichen, für ca. 2 min. statt Zellplatten unter ein Stereo-Mikroskop seziert und die Anzahl der Tiere pro Bohrloch.
2. Öffnen Sie die Analysesoftware auf dem Computer und öffnen Sie die Registerkarte "Normalisierung" um OCR auf tierische Zahl zu normalisieren. Gelten Sie entsprechende Bezeichnungen für die verschiedenen Gruppen unter der Registerkarte ändern und exportieren Sie die Datei als Prisma-Datei zur weiteren Analyse.
   Hinweis: Der Durchschnitt der ersten fünf Messungen, bevor die Zugabe von FCCP die basale OCR, während der Durchschnitt der fünf Messungen ist nach FCCP Zusatz die maximale OCR ist und dem Durchschnitt der letzten fünf Messungen (mindestens zwei Messungen durchgeführt werden sollte) nach Natrium-Azid Zusatz der nicht-mitochondriale Atmung beträgt. Der Test sollte dreimal wiederholt werden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

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Ergebnisse

Mit dem Protokoll beschriebenen, OCR Wildtyp Tiere und drei verschiedenen Sel-12 mutierte Stämme wurden ermittelt. SEL-12 kodiert das C. Elegans Ortholog Presenilin¹⁷. Mutationen im menschlichen Presenilin sind die häufigste genetische Aberration, verbunden mit der Entwicklung der familiären Alzheimer-Krankheit¹⁸. Unsere Studien haben erhöhte mitochondriale Kalziumspiegel Sel / 12 mutierte Tieren im Ve...

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Diskussion

Mitochondriale Atmung ist eine aufschlussreiche Indikator für die Funktion der Mitochondrien; Daher ist es sehr wertvoll, in der Lage, den Sauerstoff-Verbrauch in einem biologischen System, ob in vitro oder in vivo zu messen. Respirometers spüren Sauerstoffgehalt mit Porphyrin-basierte Leuchtstoffe, die durch Sauerstoff oder über amperometrischen Sauerstoffsensoren, die auf die Erzeugung von einer elektrischen aktuelle Proportional zur Sauerstoffdruck gestillt bekommen. Clark-Elektrode fällt in diese Kategorie und wu...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm, 60 mm Petri dishes	Kord-Valmark Labware Products	2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubes	Globe Scientific	6285
15 mL conical tubes	Corning	430791
22 × 22 mm coverslip	Globe Scientific	1404-10
50 mL conical tubes	Corning	430829
Agar	Fisher Scientific	BP1423-2
Bacto peptone	BD, Bacto	211677
Bacto tryptone	BD, Bacto	211705
Bacto yeast extract	BD, Bacto	212705
Bleach	Generic
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Abcam	ab120081
Cholesterol	Fisher Scientific	C314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Thomas Scientific	C987Y85
Glass Pasteur pipettes	Krackeler Scientific	6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)	Fisher Scientific	BP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	BP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	Fisher Scientific	BP332-1
Seahorse XFp Analyzer	Agilent
Seahorse XFp FluxPak	Agilent	103022-100
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002