Verwendung von En Face Immunofluoreszenz Färbung zur direkten Beobachtung von vaskulären Endothelzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung vor, um die Endothelzellen der Mausaorta direkt zu beobachten. Diese Technik ist nützlich, wenn der zelluläre und molekulare Phänotyp von Endothelzellen in verschiedenen Strömungsmustern und bei der Entwicklung von Arteriosklerose untersucht wird.

Zusammenfassung

Aberrante Veränderungen des endotheliaalen Phänotyps und der Morphologie gelten als Erste in der Pathogenese der Arteriosklerose. Die direkte Beobachtung des intakten Endothels liefert wertvolle Informationen zum Verständnis der zellulären und molekularen Ereignisse in den dysfunktionalen Endothelzellen. Hier beschreiben wir eine modifizierte En-Face-Immunfluoreszenz-Färbungstechnik, die es Wissenschaftlern ermöglicht, klare Bilder der intakten endotheliaalen Oberfläche zu erhalten und die Molekülexpressionsmuster vor Ort zu analysieren. Die Methode ist einfach und zuverlässig für die Beobachtung der gesamten endotheliale Monolayer an verschiedenen Stellen der Aorta. Diese Technik kann ein vielversprechendes Werkzeug sein, um die Pathophysiologie der Arteriosklerose zu verstehen, besonders in einem frühen Stadium.

Einleitung

Die frühen Veränderungen in der Vaskulatur initiieren vor allem das Endothel, das als selektive Barriere zwischen Blut und Gefäßwand mit seinen interzellulären engen Kreuzungskomplexen¹fungiert. Erhebliche Beweise deuten auf eine entscheidende Rolle für die mechanischen Auswirkungen des Blutflusses bei der Modulation der Endothelfunktion²hin. Fluidscherspannung, eine Reibungskraft, die durch den Blutfluss erzeugt wird, formt die Endothelzellmorphologie und -funktion differenziell, abhängig von den spezifischen Strömungsparadigmen an verschiedenen Gefäßstellen^2,3. Atherosklerotische Läsionen treten bevorzugt an Stellen gestörten Blutflusses (d-Flow), wie Gefäßkrümmungen, Strömungsteiler und Verzweigungspunkte, im Vergleich zu Regionen mit stetigem Fluss (s-Flow), wie dem geraden Segment der Arterie. Daher sollte die direkte Beobachtung der endotheliaalen Morphologie und Molekülexpressionsmuster wichtige Einblicke in die strukturellen und funktionellen Phänotypen von Endothelzellen unter unterschiedlichen Strömungsparadigmen liefern.

Kultivierte Endothelzellen exprimieren möglicherweise nicht den eigentlichen Phänotyp, wie sie es in vivo tun, teilweise aufgrund des Verlusts von Auswirkungen von Fluidscherspannung, umgebenden Zytokinen und Zellzell- oder Zell-Extrazellmatrix-Wechselwirkungen. Um dies zu unterstützen, kann die intakte Endothelzellmonoschicht mit klassischer Immunhistochemie an Querabschnitten untersucht werden. Die endotheliale Monoschicht ist jedoch so dünn und zerbrechlich, dass sie in der Regel nicht eindeutig beobachtet werden kann. En Face Immunohistochemistry wurde verwendet, um die innere Oberfläche des Endothel zu beobachten, ist aber entweder kompliziert oder erratisch in seinen Ergebnissen, weil das Endothel leicht aus dem darunter liegenden Gewebe entfernt wird, oder nur ein Teil der arteriellen Wand von Ratten oder Kaninchen, deren Wände dick sind, ist^{montiert 4,5}.

Mausmodelle haben in vielerlei Hinsicht erhebliche Vorteile gegenüber anderen Tieren. Hier verwenden wir eine modifizierte En-Face-Immunfluoreszenz-Technik, um Endothelzellen des Aortenbogens und der Thoraxaorta in c57BL/6 Maus zu analysieren. Eine solche Technik wurde weit verbreitet, um die endotheliale Pathophysiologie in verschiedenen Strömungsmustern und in der Entwicklung von Arteriosklerose^6,7,8,9,10zu studieren. Diese Methode ermöglicht es Wissenschaftlern, die gesamte Oberfläche des Endothels klar zu beobachten und die Expressionsmuster eines bestimmten Proteins in Regionen unter unterschiedlicher Fluidscherspannung zu vergleichen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit experimentellen Protokollen durchgeführt, die vom Committee on Animal Resources der Shanghai Jiao Tong University genehmigt wurden.

1. Perfusion der Maus aorta

1. Kurz gesagt, anästhet 12 Wochen alte C57BL/6 Mäuse mit intraperitonealen Injektionen von Natriumpentobarbital (50 mg/kg Körpergewicht). Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, indem Sie den Schwanz sanft kneifen.
   HINWEIS: Wenn keine Bewegung beobachtet wird, ist das Tier ausreichend beästhetisiert, um die Experimente zu starten.
2. Verkleben Sie die Pfoten der Maus mit Klebebändern auf einen Stapel Papiertücher.
3. Halten Sie die Haut der Maus mit Zange und schneiden Sie die Haut mit einer Schere vom Bauch bis zur Oberseite des Thorax.
4. Öffnen Sie die Bauchhöhle unter dem Brustkorb mit einer scharfen Schere.
5. Heben Sie das Brustbein mit Dereinspen und schneiden Sie die Membran; dann den Brustkorb abschneiden, um die Brusthöhle freizulegen.
6. Schneiden Sie die Vena cava knapp über der Leber, mit der Schere.
7. Druckdurchlässigung (100 mmHg) des arteriellen Baumes für 5 min mit vorgekühlter normaler Kochung mit 40 Einheiten/ml Heparin durch den linken Ventrikel, bis Lunge und Leber blass werden. Dann mit vorgekühlten 4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Saline (PBS, pH 7,4) für 3 min.
8. Entfernen Sie alle Muskeln, Organe und Fett, bis die Aorta ausgesetzt ist.
9. Platzieren Sie die Maus unter ein Sezierendes Mikroskop.

2. Zerlegung und Längsöffnung der Aorta

1. Setzen Sie die Aorta deutlich unter einem Sezieren des Mikroskops aus und entfernen Sie das Bindegewebe entlang der Aorta so sauber wie möglich, mit empfindlichen Zangen und einer empfindlichen Schere (Abbildung 1).
2. Sezieren Sie die thorakale Aorta vom Herzen zum Zöliakiestamm mit einer zarten Schere und legen Sie die Aorta in eine 6 cm große Zellkulturschale mit PBS. Schneiden Sie die Aorta längs, entlang der geringeren Kurve und entlang der größeren Kurve, bis das gerade Segment erreicht ist. Schneiden Sie die drei Zweige des Aortenbogens, einschließlich der Innominate, links gemeinsame Carotis und die linke subklavische Arterie, mit Mikroschere, wie in Abbildung 2gezeigt.

3. Vorbehandlung und Immunfärbung der Aorta

1. Permeabilisieren Sie die Aorta mit 0,1% Polyoxyethylen-Octylphenylether in PBS für 10 min und blockieren Sie sie mit 10% normalem Ziegenserum in Tris-gepufferter Kochsaline (TBS) mit 2,5% Polysorbat 20 für 1 h bei Raumtemperatur in einer 12-Well-Zellkulturplatte.
2. Als nächstes die Aorta mit 5 g/ml Kaninchen anti-VCAM-1 und 5 g/ml Ratte Anti-VE-Cadherin im Sperrpuffer inkubieren, über Nacht bei 4 °C.
3. Nach dem Spülen der Probe 3x mit Waschlösung (TBS mit 2,5% Polysorbat 20) die fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper (1:1.000 Verdünnung, Alexa Fluor 555-markiertes Antikaninchen-IgG und Alexa Fluor 488-markiertes Antiratten-IgG) temperatur. 3x in der Waschlösung abspülen.
4. Die Aorta mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) (1 g/ml) für 10 min gegenfärben und 3x in der Waschlösung abspülen.

4. Montage der Aorta auf der Glasrutsche

1. Legen Sie die Aorta auf einen Deckelschlupf mit der Luminaloberfläche nach unten und bewegen Sie sie langsam auf die Antifade-Montagelösung, die zuvor auf den Deckelschlupf gefallen war. Dehnen Sie die Aorta vorsichtig, um das Exemplar flach zu halten.
2. Inverse den Deckelschlupf und legen Sie es auf das Gleitglas. Es ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen zwischen der Probe und dem Glas verbleiben.

5. Beobachtung der Aorta

1. Untersuchen Sie die Aorta mit einem laserscannenden Konfokalmikroskop.
2. Analysieren Sie mit der Image-Pro Plus-Software Farbintensitäten verschiedener Kanäle aus der gewünschten Region in den En-Face-Bildern.

Ergebnisse

Eine 12 Wochen alte C57BL/6-Maus wurde eingeschläfert und mit normaler Saline mit 40 Einheiten/ml Heparin durchsetzt und dann 4% Paraformaldehyd vorgechillt. Die Mausaorta wurde unter einem Sezierendes Mikroskop (Abbildung 1) ausgesetzt, seziert und längs aufgeschnitten (Abbildung 2). Die Immunfluoreszenzfärbung der vaskulären Endothelzellen wurde wie in Abbildung 3 und Tabelle 1...

Diskussion

Das Endothel ist zahlreichen proatherogen Faktoren ausgesetzt, einschließlich Lipiden, Entzündungsmediatoren und Flüssigkeitsscherspannung^1,11,12. Die direkte Beobachtung von Endothelzellen vor Ort bietet die besonderen Vorteile, Veränderungen in der Zellmorphologie, interzellulären Knoten und Molekülexpressionsmustern als Reaktion auf die Verletzungsreize zu analysieren.

Frühere Studien haben ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mountant	Servicebio	G1401
Delicate Forceps	RWD Life Science	F11001-11
Delicate Scissors	RWD Life Science	S12003-09
Dissecting Forceps	RWD Life Science	F12005-10
Mciro Spring Scissors	RWD Life Science	S11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)	Amresco	M143
Polysorbate 20 (Tween 20)	Amresco	0777
VCAM-1 antibody	Abcam	ab134047
VE-Cadherin antibody	BD Biosciences	555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG	invitrogen	A-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG	invitrogen	A-21208
Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss