Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Entwicklung eines klinisch relevanten murinen Modells von Leberkrebs, das die typischen Immunmerkmale von hepatozellulärem Krebs (HCC) rekapituliert.

Zusammenfassung

Das Fehlen eines klinisch relevanten Tiermodells, das sich mit den typischen Immunmerkmalen von hepatozellulärem Krebs (HCC) befasst, hat die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien erheblich behindert. Um ein ideales Tiermodell zu entwickeln, das menschliche HCC rekapituliert, erhalten immunkompetente männliche C57BL/6J-Mäuse zunächst eine Tetrachlorsäure-Injektion (CCl₄), um Leberfibrose zu induzieren, und erhalten dann histologisch-normale onkogene Hepatozyten von jungen SV40 T Antigen (TAg)-transgene Mäuse (MTD2) durch intrasplenische (ISPL) Inokulation. Androgen erzeugt in Empfänger männlichen Mäusen in der Pubertät initiiert TAg-Expression unter Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotor. Dadurch werden die übertragenen Hepatozyten zu Krebszellen und bilden Tumormassen bei der Einstellung von Leberfibrose/Zirrhose. Dieses neuartige Modell imitiert die Initiierung und Progression des menschlichen HCC im Kontext von Leberfibrose/Zirrhose und spiegelt die typischsten Merkmale des menschlichen HCC einschließlich Immunfunktionsstörungen wider.

Einleitung

Hepatozellulärer Krebs (HCC) ist die am schnellsten zunehmende Krebsart in den Vereinigten Staaten (US)^1,2,3. Jedes Jahr werden ca. 850.000 neue Fälle diagnostiziert^4,5 und 700.000 Patienten sterben an dieser tödlichen Krankheit^6,7,8,9,10 und ist damit weltweit die zweithäufigste Todesursache im Zusammenhang mit Krebs. Die Verwaltung von HCC umfasst chirurgische Resektion, Transplantation, Ablation, Chemoembolisierung oder systemische Therapien, wie Sorafenib¹¹. Früherkennung und Management mit chirurgischer Resektion oder Transplantation haben den höchsten Gesamtüberlebensvorteil⁴. Leider, die Mehrheit der Patienten in einem späteren Stadium anwesend und erfordern Management mit Ablation, Chemoembolisierung oder Sorafenib¹². Sorafenib, ein Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor (RTKI), wurde von der Food and Drug Administration im Jahr 2008 als einzige systemische medikamentöse Therapie zur Behandlung von nicht resezierbaren HCC zugelassen. Obwohl das Medikament nur eine bescheidene Erhöhung des Gesamtüberlebens bietet, von 7,9 auf 10,7 Monate¹³, es bot eine neue therapeutische Strategie, die verwendet werden könnte, um HCC zu verwalten.

Die Manipulation des Immunsystems zur Beseitigung etablierter Krebsarten ist ein schnell wachsendes Feld in der Krebsforschung¹⁴. Immun-Checkpoint-Studien haben erheblich fortgeschrittene immuntherapeutische Arzneimittelentwicklung in der Krebsbehandlung^15,16. Die FDA genehmigte die Verwendung von Antikörpern (Abs) gegen zytotoxisches T-Lymphozyten-Antigen 4 (CTLA-4), programmiertes Zelltodprotein 1 (PD-1) und seinen Liganden PD-L1 zur Behandlung von Melanom, Lungenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs und Blasenkrebs^{17, 18 , 19 , 20}. Klinische Studien zur Monotherapie oder Kombinationstherapie mit einem oder mehreren Antikörpern gegen PD-1, PD-L1 oder CTLA-4 zur Behandlung fortgeschrittener HCC sind im Gange^21,22,23und einige Studien haben positive Ergebnisse gezeigt. Im Jahr 2017 erteilte die FDA eine beschleunigte Zulassung für Anti-PD-1-Antikörper zur Behandlung von HCC-Patienten, die gegen Sorafenib resistenzen, aber die Gesamtansprechrate dieser Therapie beträgt nur 14,3%. Andere Strategien wurden zu diesem Zeitpunkt nicht in die klinische Praxis übersetzt^24,25. Überwindung der tumorinduzierten tiefen Immuntoleranz zur Verbesserung der Immun-Checkpoint-Therapie²⁶; Vorhersage der Wirksamkeit der Immun-Checkpoint-Therapie; Immunbedingte Nebenwirkungen zu verhindern; Optimierung der Verabreichung S-Route, Dosierung, und Häufigkeit; und die Suche nach effektiven Kombinationen der Therapien^27,28,29 bleiben alle extrem herausfordernde Aufgaben.

Es gibt mehrere konventionelle Ansätze, die verwendet werden, um HCC in Mausmodellen zu induzieren und werden in Abhängigkeit von der speziellen Forschungsfrage des Forschers^{verwendet 30}. Chemisch induzierte HCC-Mausmodelle mit genotoxischen Verbindungen imitieren verletzungsinduzierte Malignität. Xenograft-Modelle durch ektopische oder orthotopische Implantation von HCC-Zelllinien eignen sich für das Arzneimittelscreening. Eine Reihe von genetisch veränderten Mäusen wurden entwickelt, um die Pathophysiologie von HCC zu untersuchen. Transgene Mäuse, die virale Gene, Onkogene und/oder Wachstumsfaktoren exdrücken, ermöglichen die Identifizierung von Wegen, die an der Hepatocarcinogenese beteiligt sind. Aufgrund inhärenter Einschränkungen fassen diese Modelle nicht die typischen Immuneigenschaften des menschlichen HCC zusammen, was die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien erheblich behindert hat^{14 ,15}. Kürzlich haben wir ein klinisch relevantes murines Modell entwickelt. Dieses neuartige Modell imitiert nicht nur die Menschliche HCC-Initiierung und Progression, sondern spiegelt auch die meisten typischen Merkmale menschlicher Krankheiten wider, einschließlich Immunfunktionsstörungen. Wir haben seine biologischen und immunologischen Eigenschaften charakterisiert. Unter Der Nutzung dieses neuartigen Modells haben wir verschiedene immuntherapeutische Strategien zur Behandlung von HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. Diese einzigartige Plattform ermöglicht es uns, Mechanismen der tumorinduzierten Immunverträglichkeit zu untersuchen und proof-of-Concept-Therapiestrategien für HCC für eine eventuelle klinische Translation zu entwickeln.

Protokoll

HINWEIS: Das gesamte Verfahren einschließlich tierischer Probanden wurde vom IACUC an der University of Missouri genehmigt. Alle Mäuse wurden nach den Kriterien des "Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren" human gepflegt. Das folgende Verfahren zur Zellisolierung und -impfung sollte in einer Kapuze durchgeführt werden. Alle Darsteller sollten die standardmäßige persönliche Schutzausrüstung für den Umgang mit Mäusen und Gewebe tragen.

1. Induktion von Leberfibrose und Zirrhose mit IP-Injektion von Kohlenstofftetrachlorid (CCl₄)

HINWEIS: Siehe Abbildung 1. (CCl₄ ist ein hochgefährliches Reagenz, es sollte sorgfältig und mit chemikalienbeständigen Handschuhen behandelt werden)

1. Erhalten Sie männliche C57BL/6J-Mäuse, die sechs bis acht Wochen alt sind (siehe Tabelle der Materialien).
2. 10% CCl₄ (v/v) Lösung in Maisöl in einem Zentrifugenrohr vorbereiten. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen basierend auf der Anzahl der zu injizierenden Mäuse (siehe Schritt 1.6).
3. Verwenden Sie die geeignete Mäusehandhabungstechnik, um eine Maus für die Injektion auszuwählen.
4. Halten Sie die Maus mit ihrer rückenden Seite (Bauch) manuell zurück.
5. Reinigen Sie die Injektionsstelle an der Bauchwand der Maus, indem Sie mit 70% Alkohol schrubben.
6. Injizieren Sie männliche C57BL/6J-Mäuse mit 160 l 10% CCl_4-Lösung durch intraperitoneale (IP) Injektion mit einer 25-Spur-Einwegnadel.
7. Stellen Sie sicher, dass die Nadel nur durch die Bauchwand (ca. 4-5 mm) mit Abschrägung nach oben und leicht abgewinkelt bei 15-20 Grad eindringt.
8. Injizieren Sie Mäuse zweimal pro Woche für insgesamt vier Wochen - jede Maus erhält insgesamt acht Injektionen.
   HINWEIS: Zwei Wochen nach der letzten Injektion sind behandelte Mäuse bereit für die ISPL-Impfung onkogener Hepatozyten von MTD2-Mäusen.

2. Isolierung von Tag-transgenen Hepatozyten von MtD2-Mäusen der Linie

HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Lösungsrezepte.

10x Ausgewogene Salzlösung von Earle ohne Ca oder Mg (EBSS ohne Ca oder Mg)	4 g KCl 68 g NaCl 1.4 g NaH2PO4 H2o 10 g Dextrose Wasser zu 1 Liter hinzufügen, pH bis 4.32 Durchpassern des Filters
Lösung 1	20 ml 10x EBSS ohne Ca oder Mg 44 g NaHCO3 1,33 ml 1,5 Mio. Hepes 10 ml von 10 ml EGTA Wasser zu 200 ml hinzufügen
Lösung 2	100 ml 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Wasser zu 1 Liter hinzufügen
0,75% Kollagennaselösung	15 mg Kollagenase Typ 1 20 ml Lösung 2
Komplettes Medium	2 RPMI 50 ml FBS 5 mL 100x Penicillin-Streptomycin

Tabelle 1: Lösungsrezepte.

1. Besorgen Sie sich die Linie MTD2-Mäuse^38, um als Quelle onkogener Hepatozyten zu dienen.
2. Anästhetisieren Sie 5 Wochen alte MTD2-Mäuse mit 2,5% Isofluran.
   HINWEIS: Die richtige Anästhesisierung wird durch die Toe Pinch-Methode überprüft. Kurz gesagt, mit zwei Fingern, geben Sie der Maus Zehen / Fuß eine gute Quetschung. Wenn es keine Entzugsreaktion gibt, wird das Tier tief genug beurteilt, um mit der Operation zu beginnen.
3. Wenn sie angemessen sediert sind, platzieren Sie Mäuse in eine Supine-Position und fixieren Sie die Extremitäten mit Klebeband, um eine ausreichende Exposition der Bauchoberfläche zu gewährleisten.
4. Führen Sie einen Mittellinien-Laparotomie-Einschnitt mit einer Schere entlang der Länge der Linea alba groß genug, um eine ausreichende Exposition der Leber zu bieten.
5. Verdrängen Sie den Darm nach links, um eine bessere Exposition der Leber und Portal Triade zu bieten.
6. Sezieren Sie über der Leber, um die minderwertige Vena cava (IVC) zu belichten.
7. Ligate die IVC über der Leber mit einer Arterienklemme.
8. Zurück zur unteren Grenze der Leber, verwenden Sie eine Schmetterlingsnadel (siehe Materialien), um IV Zugang zur Portalvene zu erhalten. Fix Katheter von Hand.
9. Sukzessive durchdringen Sie die Mausleber mit einer Injektionsspritze bei 8,9 ml/min mit 15 ml Lösung 1, 15 ml 0,75% Kollagennaselösung 2 und 15 ml Lösung 2 über den Katheter.
10. Ernten Sie die durchnässte Leber, indem Sie die Tumormasse von MTD2-Mäusen in einem 50 ml konischen Rohr mit 10-15 ml PBS schneiden und einnehmen.
11. ENTFERNEN Sie PBS und waschen Sie eine zusätzliche Zeit mit PBS; zentrifugieren Sie bei diesem Schritt nicht.
12. Schneiden Sie die Leber in kleinere Stücke mit der Schere und dann wieder mit PBS 2x waschen, um restliches Blut zu entfernen.
13. Fügen Sie 5 ml komplettes RPMI-Medium in das konische Rohr und kontinuierlich Hacken der Leber mit schere zu kleinen Stücken (<3 mm)-Gewebe sollte glatt durch eine 5 ml Pipette gehen.
14. Fügen Sie ein vollständiges RPMI zu einem Endvolumen von 30 ml hinzu und suspendieren Sie die Leber mit einer 5 ml Pipette.
15. Filtern Sie die Mischlösung mit einem 70-mm-Sieb in ein 50 ml konisches Rohr.
16. Waschen Sie das Sieb mehrmals mit komplettem RPMI und stellen Sie das Endvolumen auf 50 ml ein, indem Sie zusätzliches RPMI-Medium hinzufügen.
17. Drehen Sie die Suspension schnell durch Zentrifuge auf maximal 500 U/min; sobald die Geschwindigkeit auf 50 x gbeschleunigt wird, sollte die Zentrifuge gestoppt werden.
18. Dekantieren Sie den Überstand und hängen Pellets in 20 ml PBS.
19. Zählen Sie Zellen mit Trypan-Blauausschluss und einem Hämozytometer, und passen Sie dann die Zellkonzentration für die folgende Zellimpfung auf 2,5 x 10⁶/ml an.
    HINWEIS: Die erwartete Ausbeute von 5 Gramm Tumorgewebe beträgt 80 Millionen Hepatozyten mit Lebensfähigkeit >95%.

3. Impfung der Hepatozyten von MTD2-Mäusen in die Leber von wildlebenden Typ C57BL/6J-Mäusen durch ISPL-Injektion

1. Die aseptische Technik sollte in allen Verfahren
2. Anästhetisieren Siedie CCl 4-behandelten männlichen C57BL/6J-Mäuse mit 2,5% Isofluran, die Mäuse sollten mit Augenschmiere behandelt werden, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
3. Bereiten Sie Spritzen mit 200 L Hepatozyten zur Injektion vor.
4. Wenn ausreichend sediert, positionieren Sie Mäuse mit der linken Seite nach oben.
5. Rasieren Sie die gesamte linke Flanke der Mäuse, dann schrubben Sie die Fläche, abwechselnd zwischen 70% Alkohol und Betadin dreimal.
6. 5 mg/kg Carprofen subkutaneouly vor dem chirurgischen Schnitt verabreichen.
7. Machen Sie einen 1 cm Schnitt auf der linken Flanke parallel zur^13. Rippe vom dorsalen Extrembeginnen direkt unterhalb des Wirbelsäulenmuskels.
8. Identifizieren Sie die Milz, und exemiten Sie sie dann mit stumpfspitzen Zangen.
9. Beschneiden Sie die Milz mit zwei mittelgroßen Titanclips. Platzieren Sie beide Clips zwischen der Milzarterie und der Vene, lassen Sie Raum zwischen den Clips, um sie später nach der Impfung zu schneiden.
   HINWEIS: Das Ziel ist es, den unteren Pol der Milz zu isolieren, um das Risiko der Aussaat zu reduzieren.
10. Mit einer 27 G-Nadel in die untere Milz der Milz injizieren.
11. Schneiden Sie den unteren Zweig des Pedikles (untere Splenic-Polgefäße) mit einem mittelgroßen Clip ab.
12. Schneiden Sie die Milz zwischen den beiden zunächst platzierten Clips.
13. Entfernen Sie den unteren Pol der Milz, die direkt mit Tumorzellen injiziert wurde.
14. Verwenden Sie 3-0 Polyglactin 910 unterbrochenes Nähen, um die innere Muskelschicht zu schließen.
15. Verwenden Sie sterilisierte Stahl-Wundclips, um die äußere Hautschicht zu schließen.
    HINWEIS: Stahlclips werden bevorzugt über Nähten, um zu vermeiden, dass Tiere Nähte auskauen und eine klaffende Wunde hinterlassen.
16. 5 mg/kg Carprofen subkutan nach der Naht verabreichen.
17. Legen Sie alle erholenden Tiere auf ein temperaturgeregeltes Heizkissen und überwachen Sie genau, bis sie vollständig von der Anästhesie genesen sind.
18. Geben Sie Mäusen nach der Operation freien Zugang zu Wasser. Wenn die Maus während der Operation dehydriert wird, verabreichen Sie subkutane Flüssigkeiten (<1 ml).
19. Entfernen Sie Hautclips nach 7-10 Tagen nach der Operation.

Ergebnisse

Onkogene Hepatozyten, die von TAg-transgenen Mäusen isoliert wurden (Abbildung 2), wurden in der Leber von Wildtypmäusen durch intra-splenische Injektion ausgesät (Abbildung 3). Die transplantierten Hepatozyten wuchsen erfolgreich und zuverlässig orthotopische HCC-Tumoren (Abbildung 4) mit tumorspezifischem Antigen SV40 TAg (Abbildung 5) bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose ( Abbildung1).

Diskussion

Mit diesem Protokoll haben wir ein zuverlässiges und reproduzierbares murines Modell von HCC etabliert, das die menschliche HCC-Initiierung und Progression imitiert. Klinisch, viele Risikofaktoren sukzessive induzieren Leberschäden, Leberfibrose, Zirrhose und die endk.-Phase von HCC. In unserem Protokoll wird die IP-Injektion von CCl₄ verwendet, um zuerst Leberfibrose bei Wildtypmäusen zu produzieren, was es den nachfolgenden onkogenen Hepatozyten ermöglicht, die Tumoren bei der Einstellung von Leberfibros...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close