Orthotopic Rat Nierentransplantation: Ein neuartierter und vereinfachter chirurgischer Ansatz

Zusammenfassung

Der Zweck dieses Manuskripts und Protokolls ist es, den chirurgischen Eingriff der orthotopischen Nierentransplantation bei Ratten im Detail zu erklären und zu demonstrieren. Diese Methode wird vereinfacht, um die korrekte Durchblutung der Spenderniere zu erreichen und die Reperfusionszeit durch die venöse und urterische Manschette Anastomose-Technik zu verkürzen.

Zusammenfassung

Die Nierentransplantation bietet eine höhere Überlebensrate und eine verbesserte Lebensqualität für Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium im Vergleich zu jeder Art von Nierenersatztherapie. In den vergangenen Jahrzehnten wurde das Ratten-Nierentransplantationsmodell eingesetzt, um die immunologischen Phänomene der Abstoßung und Toleranz zu untersuchen. Dieses Modell ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug geworden, um neue immunmodulatorische Arzneimittel und Therapien zu testen, bevor es mit teuren präklinischen großen Tierstudien fortfahren kann.

Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Überblick darüber, wie man eine orthotopische Nierentransplantation bei Ratten zuverlässig durchführt. Dieses Protokoll enthält drei markante Schritte, die die Erfolgswahrscheinlichkeit erhöhen: Durchblutung der Spenderniere durch Spülung durch die Portalvene und die Verwendung eines Manschettensystems, um die Nierenvenen und Harnleiter zu anastomosieren, wodurch Kälte und Wärme abnehmen Ischiema-Zeiten. Mit dieser Technik haben wir Überlebensraten über 6 Monate hinweg mit normalem Serumcreatinin bei Tieren mit syngeneischen oder toleranten Nierentransplantationen erreicht. Je nach Studienziel kann dieses Modell durch Vor-oder Nachtransplantationsbehandlungen modifiziert werden, um die akute, chronische, zelluläre oder antikörpervermittelte Abstoßung zu untersuchen. Es ist ein reproduzierbares, zuverlässiges und kostengünstiges Tiermodell, um verschiedene Aspekte der Nierentransplantation zu untersuchen.

Einleitung

Historisch gesehen wurden die ersten Transplantationsabstoßungsstudien von Brent und Medawar mit Hauttransplantationen inNagetieren 1 durchgeführt. Es wurde schnell klar, dass die Haut ausgeprägte immunologische Eigenschaften hat, was sie zu einem hochimmunogenen Organ macht, das sich in der Abstoßung von anderen vaskularisierten Festorganen 2 unterscheidet. Die Rattenstudien über die Abstoßung fester Organtransplantationen beschränken sich gewohnheitsmäßig auf Herz-, Leber-und Nierentransplantationen. Obwohl jedes dieser Organe geeignet ist, die Ablehnung zu studieren, gibt es für jedes dieser Organe Vor-und Nachteile. Herztransplantationen werden oft in den Bauch transplantiert und in die Aorta und Vena cava vergiftet, wobei das heimische Herz des Empfängers auf Platz³liegt. Dies stellt keine klinischen, anatomischen und physiologischen Bedingungen des Menschen dar. Darüber hinaus sind die Herzen sehr empfindlich gegen kalte Ischämie und müssen bevorzugt innerhalb von 1 Stunde neu verwendet werden, um ihre Funktion 4 wiederherstellen^zukönnen. Lebertransplantationen gelten in der Regel als chirurgisch anspruchsvoller und zeitsensibler. Nach dem Entfernen der einheimischen Leber muss die Spenderleber innerhalb von 30 Minuten implantiert und neu verwendet werden, da die Empfänger ohne eine funktionierendeLeber nicht länger halten können. Die Leberarterie, die Portalvene und vor allem die Rekonstruktion des Gallengangs erfordern raffinierte chirurgische Fähigkeiten. Neben den chirurgischen Herausforderungen ist bekannt, dass die Leber tolerogene Eigenschaften besitzt und Nagetiere und Menschen operativ tolerant werdenkönnen^6,7,8. Die Niere, im Gegensatz zu den oben genannten Organen, kann in einer orthotopischen Weise transplantiert werden, ist bekannt, dass ein immunogenes Organ mit konsistenten, reproduzierbaren Abstoßungsepisoden (wenn nicht immunsupprimiert), und ermöglicht für längere kalte Ischämie Zeiten von mehreren Stunden. Damit ist die Ratten-Knierentransplantation ein ideales Modell für das Studium der allograften Abstoßung und-toleranz.

Die Nierentransplantation (KT) ist die bevorzugte Wahl der Behandlung von Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium. In den letzten Jahrzehnten haben sich die kurzfristigen Überlebensergebnisse nach KT dramatisch verbessert, aber die langfristigen Überlebensergebnisse stagnieren 9. Konventionelle immunsuppressive Therapien bleiben die Standard-Anti-Abstoßungstherapie. Der chronische Einsatz von immunsuppressiven Therapien führt jedoch zu einer signifikanten Morbidität^undMortalität, wie Nephrotoxizität, Diabetes und sekundären bösartigen Erkrankungen 10^{, 11,12}. Auf lange Sicht bedrohen chronisch antibody-und zellmedizinisch vermittelte Abstoßungen das Überleben der Transplantation, wobei nur begrenzte therapeutische Möglichkeiten zur Verfügung stehen.

Ein wichtiges Ziel bei der Transplantation ist die Induktion von Transplantationstoleranz, um chronische Immunsuppression zu vermeiden. Das Ratten-KT-Modell ist ein robustes Werkzeug, um den immunologischen Abstoßungsprozess zu untersuchen und neue Ansätze zur Immunomodulation und Transplantationstoleranz zu evaluieren. Die Ratte dient auch als geeignetes Modell, um akute und chronische Zell-und Antikörper-vermittelte Abstoßung^{13,14, 15,16, 17zu}untersuchen. Dieses chirurgische Modell hat sich als zuverlässiges, reproduzierbares und kostengünstiges Werkzeug erwiesen, um verschiedene Aspekte der allograften Abstoßung und-toleranz zu untersuchen. Es wird oft verwendet, um neuartige toleranzinduzierende Protokolle zu testen, bevor teure und schwerfällige Großtierstudien durchgeführt werden. Die Durchführung von KT bei Ratten erfordert eine umfassende chirurgische Ausbildung und Expertise, um Überlebensraten von & gt;90% zu erreichen. In diesem Manuskript und in dem begleitenden Lehrvideo bieten wir einen schrittweisen Umriss für orthotopische KT in der Ratte, wie sie seit vielen Jahren in unserer Einrichtung erfolgreich durchgeführt wird.

Vor Beginn eines Verfahrens ist die Auswahl des Spenders und des Empfängers von entscheidender Bedeutung und hängt von der Art des Experiments ab. Idealerweise sollten Spender und Empfänger zwischen 220 – 260 g wiegen und zwischen 8 – 12 Wochen alt sein. Tiere unter 220 g haben kleinformatige Arterien, Venen und Harnleiter, was die Anastomose beim Empfänger besonders herausfordernd macht. Geringfügige Blutverluste können zu Hypovolämie führen und bei kleineren Tieren zum Tod führen. Tiere, die schwerer als 260 g sind, zeigen mehr Fett um ihre Gefäße herum, und die Isolierung der Gefäße wird mehr Betriebszeit erfordern und die kalte Ischämie erhöhen.

Protokoll

Lewis (RT1¹⁾und Dark Agouti (DA) (RT1Aa) Ratten wurden von kommerziellen Anbietern gekauft (siehe Materialliste). Diese vollständig MHC-falsch abgestimmten Stämme werden oft verwendet, um eine akute Nierenallograft-Abstoßung zu untersuchen. Alle Tiere wurden nach den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) in einer speziellen pathogenfreien Einrichtung an der Johns Hopkins University untergebracht und gepflegt. Alle Verfahren wurden vom Ausschuss für Tierpflege und-nutzung genehmigt.

1. Geberverfahren

1. Bereiten Sie alle chirurgischen Instrumente, die in diesem Verfahren als Sterilisation verwendet werden, und Autoklaven, um infektiöse Komplikationen zu verhindern.
2. Die Spenderratte durch die Isoofluran-Inhalation anästhetisieren (Induktion bei 3% – 4% und Wartung bei 1% – 2%) Für den Rest des Verfahrens. Geben Sie allen Spender-und Empfängertieren präventives Buprenorphin subkutan bei 0,1 mg/kg Körpergewicht für Schmerzmittel.
3. Nun die Ratte in eine untere Position legen und die Gliedmaßen mit sterilen Maskenband immobilisieren.
4. Verwenden Sie einen mechanischen Clipper, um Haare aus dem Bauchbereich zu entfernen.
   1. Tragen Sie ein Augenschmiermittel auf und verwenden Sie sterile Gaze, die in Povidon-Jod getränkt sind, gefolgt von Gazze, die in Isopropylalkohol eingeweicht ist, um das chirurgische Feld zu sterilisieren.
   2. Achten Sie vor dem ersten Schnitt darauf, dass die Ratte adäquat betäubt wird, indem Sie das Fehlen des Zehenpinken-Entnahmereflexes überprüfen.
5. Beginnen Sie mit der Schere, indem Sie eine große längliche Mittellinie und Muskelschnitt von der Symphysis pubis bis zum Xiphoid herstellen, und geben Sie die Peritonealhöhle ein.
6. Zwei Widerrufsbeläge auf beiden Seiten der Bauchwand einlegen, um die Innentwallhöhle zu entlarven.
7. Bedecken Sie den Darm mit einer feuchten sterilen Gaze und verschieben Sie ihn auf die rechte Seite des Bauches, indem Sie die Aorta, Vena Cava und linke Niere. 1 mL vorgeheizter Salz mit einer 1 ccm-Spritze auftragen, um den Darm und die Bauchorgane feucht und bei normaler Temperatur zu halten.
   1. Tragen Sie eine zweite feuchte Gaze auf, um den Magen-und Milzkranz auf die Niere zu bedecken und zu mobilisieren, und eine kleine feuchte Gaze, um die exponierte Niere zu bedecken (Abbildung1A).
8. Verwenden Sie mikrochirurgische Trennungs-Zangen, um die linke Nierenarterie und Vene aus dem Bindegewebe und einander zu isolieren und zu mobilisieren. Isolieren Sie die linke Nierenvene, indem Sie die linke Gonadalvene abkauern und isolieren Sie die linke Nierenarterie, indem Sie die Nebennierenarterie abbauen. Danach mobilisieren Sie die Aorta und die Vena cava überlegen und minderwertig der linken Nierenpediküre,indem Sie das Bindegewebe mit zertrinkenden Zangen trennen (Abbildung 1B).
9. Teilen und mobilisieren Sie den Harnleiter aus dem Bindegewebe mit sich abgetrennten Zangen und machen Sie einen diagonalen Schnitt in einer Länge von 2 cm, der vom Nierenbecken mit Mikroscheren gemessen wird. Eine Polyamid-Manschette (siehe Materialtabelle) halbwegs in die Harnröhre einlegen und die Manschette durch einen Knoten mit 8-0 sichern Seidennaht (Abbildung 1C).
   Hinweis: Es ist wichtig, nicht alle Fett-und Bindegewebe aus dem Harnleiter zu entfernen, da sie Schutz vor Behinderung durch Klebstoffe bieten, und ihre Entfernung kann zu Harnnekrosen führen. Achten Sie besonders darauf, dass das Schiff, das Sauerstoff an den Harnleiter liefert, erhalten bleibt.
10. Mobilisieren Sie die linke Niere, indem Sie sie mit Hilfe von Zangen oder Mikroscheren vom perinephrischen Fett trennen. Lassen Sie die Fettkapsel der Niere befestigt und verwenden Sie diese Stelle für den Umgang mit der Niere.
    1. Die minderwertige vena cava.
11. Minister 200 Einheiten Heparin mit einer Spritze mit einer 27 G-Nadel durch die Penisvene. Den Spritplatz mit einem Wattestäbchen mindestens 1 min unter Druck setzen, um Blutungen vorzubeugen.
12. Identifizieren Sie die Portalvene (pv) und die minderwertige vena cava (ivc) (Abbildung 1D). Spülen Sie die Niere, indem Sie 50 ml Kaltsalz mit 500 Einheiten Heparin in die Portalvene mit einer 16 G-Nadel (Abbildung1E) mischen. Vor dem Spülen die minderwertige vena cava auf der infrahepatischen Ebene und die Portalvene Caudal an der Nadeleinsetzstelle abschneiden, damit das Blut aus dem Kreislauf austreten kann. Beginnen Sie mit der Spülung der Niere, indem Sie nach und nach die Salzlösung einschleppen. Beobachten Sie einen Farbwechsel der Niere von dunkelrot zu einer gleichmäßigen grauen und blassen Farbe (Abbildung 1F).
13. Nach dem Spülen die Nierenarterie und die Vene in der Nähe der Aorta und der Vena Cava anrichten und die gespülte Niere in eine Petrischale in kalte Saline auf Eis legen. Bild 2 A stellt den schematischen Überblick über das Spenderverfahren dar.
14. Sobald die Niere in kalter Saline ist, fixieren und immobilisieren Sie den Griff der Venenkuppe ( siehe Materialtafel) und ziehen Sie die Nierenvene sanft durch die Manschette. Dann fixieren Sie die Nierenvene über die Manschette, indem Sie drei Knoten mit einer 8-Null-Seidense (Abbildung 2B) platzieren.
    Achtung: Achten Sie besonders auf die Ausrichtung der Vene bei der Sicherung. Rotierte Venen führen zu einer Behinderung des Blutflusses und führen zu Thrombosen.

2. Rezeptverfahren

1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1 – 1.11 aus dem Spenderverfahren.
2. Auf der linken Nierenarterie zwei atraumatische Mikrogefäßklemmen und in der Nähe der Aorta und der Vena cava platzieren (Abbildung3 A).
3. Ligieren Sie die Wiederennungsvene des Empfängers in der Nähe des Einlaufs der Niere. Spülen Sie die Nierenvene mit hepariniertem Salz, um das restliche Blut aus dem Gefäß zu entfernen.
4. Schieben Sie die ligierte Nierenvene über die gefesselte Nierenvene, die zuvor in der Spenderniere positioniert war, und sichern Sie sie mit einem 8-0 Seidennaht (Abbildung 3B). Halten Sie die gleiche Positionsorientierung bei der Sicherung der Nierenvene über der Manschette.
5. Ligieren Sie den Harnleiter auf dem Niveau des unteren Pols der linken Niere. Mobilisieren Sie die Niere aus dem perinephrischen Fett.
6. Ligieren Sie die Nierenarterie proximal an der Einmündung der Empfängerniere. Spülen Sie es mit heparinisiertem Salz, um überschüssiges Blut im Gefäß zu entfernen. Führen Sie eine Ende-zu-Ende-Anastomose der Nierenarterie mit 8 bis 10 unterbrochenen Nähten mit einer 10-0 Nylonnaht (Abbildung3 C). Die Arterie mit Hilfe der Adventsschicht verwalten.
7. Entfernen Sie die Gefäßklemmen, um die Reperfusion der Niere wieder einzuleiten. Beginnen Sie mit dem Entfernen der Klemme auf der Vene, gefolgt von der Klemme auf der Arterie(Abbildung3D). Verwenden Sie einen sterilen Baumwollschwab, um alle verströmten Bereiche rund um die Anastomose-Region leicht zu unter Druck zu setzen. Ein paar Minuten sollten ausreichen, um eine Patentanastomose zu erreichen.
8. Beachten Sie kurz die Niere, um für eine angemessene Perfusion zu beurteilen. Unmittelbar nach der Wiederdurchblutung sollte die Niere die Farbe wechseln und nach wenigen Minuten ihre natürliche dunkelrote Farbe wiedererlangen (Abbildung3E). Manchmal werden sichtbare Peristalse der Harnleiter und Urin-Produktion vor Ort beobachtet.
9. Beenden Sie, indem Sie die exponierte Spitze der Harnkuppe in die Rezipiental-Ureter einlegen und sichern Sie den Empfängerureter mit einem 8-0 Seidennaht (Abbildung 2C und Abbildung3F).
10. Um die Spender-und EmpfängerdURals in Position zu halten, binden Sie die Enden der einzelnen Harnröhren aneinander.
11. Optional kann die richtige Niere nephrectomisiert werden, indem man die richtige Nierenarterie und die Vene mit einer 4-0 Seidennaht abbindet und die Niere entfernt.
12. Entfernen Sie alle Magergrößen aus der Bauchhöhle, bringen Sie alle Organe in ihre natürliche Position zurück, drücken Sie 1 ml Salz über den Darm, um sie feucht zu halten, und schließen Sie den Bauch mit einer 4-0 absorbierbaren Naht auf dem Rektusmuskel und eine 4-0 Seidennaht, um die Haut zu schließen er in unterbrochener Manier.

3. Postoperative Betreuung

1. Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig mit Zugang zu ad libitum Wasser und Nahrung und ermöglichen Sie die Erholung auf einem 37 ° C Heizkissen.
2. Für die Schmerzlinderung 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan injizieren und das Tier zur Genesung überwachen. Je nach Beschwerden oder Schmerzen kann in den nächsten Tagen eine zusätzliche Schmerzstillstand erforderlich sein. Antibiotika werden nicht routinemäßig verabreicht, da infektiöse Komplikationen selten sind.
3. Beobachten Sie die Genesung für 1 – 2 Stunden, bevor Sie das Tier zurück in die Tieranlage. Prüfeln Sie das Tier 2x–3x Tag für die ersten 24 Stunden, gefolgt von einer täglichen Inspektion. Achten Sie auf Anzeichen von Schmerzen und Not, orale Aufnahme und Harnleistung.
4. Entfernen Sie die Nähte 7 – 10 Tage nach der Operation.

Ergebnisse

Wir haben syngeneic (N = 5) und allogeneic Nierentransplantationen (N = 5) durchgeführt. Tiere mit einer synthetischen Transplantation erreichten ein langfristiges Überleben ohne immunsuppressive Behandlung. Tiere, die eine allogene Transplantation ohne Immunsuppression erhielten, lehnten ihre Transplantation ab und erlagen einem Nierenversagen mit einem medianen Überleben von 8 Tagen (Abbildung4 A). Das mittlere Serum Creatinin hat sich in der Syngeneic...

Diskussion

In diesem Manuskript beschreiben wir die chirurgische Methode des orthotopischen KT in Ratten im Detail, einschließlich aller notwendigen Geräte, um diese Prozedur durchzuführen (Abbildung5). 1965 veröffentlichten Fisher und Lee den ersten Bericht über KT in Ratten, der zum Auftakt eines spannenden Untersuchungsfeldes 18 wurde. Seitdem wurden viele Modifikationen eingeführt, um die Reproduzierbarkeit dieses Modells zu verbessern. Es diente als effektives Tiermod...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm