Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren

Zusammenfassung

Ein Pan-Lysavirus verschachtete Umkehr-Transkription Polymerase-Kettenreaktion wurde entwickelt, um speziell alle bekannten Lyssaviren zu erkennen. Die Validierung mit Tollwut-Hörnproben verschiedener Tierarten ergab, dass diese Methode eine Empfindlichkeit und Spezifität hat, die dem Gold-Standard-Fluoreszenz-Antikörper-Test entspricht und für die routinemäßige Tollwutdiagnostik verwendet werden könnte.

Zusammenfassung

Um Tollwut-Virus und andere Mitgliedsarten der Gattung Lyssavirus in der Familie Rhabdoviridaezu erkennen, wurde das Pan-Lysavirus verschachtelte Umkehr-Transkription Polymerase-Kettenreaktion (verschachteltes RT-PCR) entwickelt, um die konservierte Region zu erkennen Das Nucleoprotein (N) Gen der Lyssaviren. Die Methode wendet die umgekehrte Transkription (RT) an, wobei virale RNA_als Schablone und Oligo (dT) 15 und zufällige Hexamer als Primer verwendet werden, um die virale Komplementär-DNA (cDNA) zu synthetisieren. Dann wird die virale cDNA als Vorlage verwendet, um ein 845 bp N-Gen-Fragment in der ersten Runde PCR mit äußeren Primern zu verstärken, gefolgt von Zweitrunden-verschachteltem PCR, um das endgültige 371 bp-Fragment mit inneren Primern zu verstärken. Diese Methode kann verschiedene genetische Ketten von Tollwut-Viren (RABV) erkennen. Die Validierung, mit 9.624 Hirnproben von acht heimischen Tierarten in 10 Jahren klinischer Tollwut-Diagnosen und Überwachung in China, zeigte, dass die Methode 100% Empfindlichkeit und 99,97% Spezifität im Vergleich zu den direkten Fluoreszenzerkrankungen hat Antikörpertest (FAT), die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) empfohlene Goldstandard-Methode. Darüber hinaus könnte die Methode auch das gezielte N-Gen-Fragment von 15 anderen zugelassenen und zwei neuartigen Lyssavirus-Arten im 10. Bericht des Internationalen Komitees für die Besteuerung von Viren (ICTV), wie durch eine mimische Erkennung von synthetisierten N Gen-Plasmide aller Lyssaviren. Das Verfahren bietet eine bequeme Alternative zu FAT für die Tollwutdiagnose und ist als National Standard (GB/T36789-2018) von China zugelassen.

Einleitung

Tollwut ist eine weltweite Zoonos-Krankheit, die durch Viren innerhalb der Gattung Lyssavirus 1 verursachtwird. Lyssaviren (Familie Rhabdoviridae) sind einfallslose RNA-Viren mit einem etwa 12 kb-Genom, das fünf Proteine kodiert: N, Phosphoprotein (P), Matrix-Protein (M), Glykoprotein (G) und das große Protein oder Polymerase (L). Basierend auf Nukleotidsequenzen des N-Gens, der genetischen Distanz und der antigenen Muster wurden die Lyssaviren in 16 Arten unterteilt, die das klassische Tollwut-Virus (RABV) und die Tollwutviren (RRV) umfassen: Lagos-Batt-Virus (LBV), Duvenhage-Virus (DUVV) ), Mokola-Virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australische Fledermaus lyssavirus (ABLV), Aravan Virus (ARAV), Ikoma Virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut Virus (IRKV), Khujand-Virus (KHUV), Westkaukasischer Fledermau-Virus (WCBV), Shimoni-Bmeldchen-Virus (SHIBV), und Lleida Fledermaus Lyssavirus (LLEBV)². In jüngster Zeit wurden zwei zusätzliche Lyssaviren identifiziert: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) von einer Brandt-Fledermaus (Myotis brandtii)in Finnland im Jahr 2017 3 und Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) von einer japanischen Pipistrelle isoliert ( Pipistrellus abramus) in Taiwan, China 2016^{– 2017 4}.

Alle Säugetiere sind anfällig für Tollwut; Allerdings erlauben keine groben pathognomonischen Läsionen oder spezifische klinische Anzeichen ihre Identifizierung, und die Diagnose kann nur im Labor⁵erfolgen. Die am weitesten verbreitete Methode zur Tollwutdiagnose ist die FAT, die sowohl von der WHO als auch von der OIE^{5,6 als}Goldstandard^angesehenwird. Dennoch kann der FAT unzuverlässige Ergebnisse bei degradided/autolysierten Hirngewebsproben liefern. Darüber hinaus kann es nicht verwendet werden, um biologische Flüssigkeitsprobe wie Hirnspinalflüssigkeit (CSF), Speichel und Urin zu unterlassen, wodurch die Verwendung in der antemortem-Diagnose 7 weitgehendausgeschlossen wird. Alternative konventionelle diagnostische Tests, wie der Tollwut-Gewebekultur-Infektionstest (RTCIT) und der Maus-Impfung (MIT), erfordern mehrere Tage⁶, ein großer Nachteil, wenn eine schnelle Diagnose unerlässlich ist.

Verschiedene molekulare Diagnosetests (z.B. der Nachweis der viralen RNA durch RT-PCR, der PCR – Enzym-verknüpfte immunsorsorbierte Assay [PCR-ELISA], In-situ-Hybridisierung und Echtzeit-PCR) werden alsschnelle und sensible Techniken für die Tollwettung eingesetzt 8. RT-PCR wird jetzt von OIE für die routinemäßige Tollwutdiagnose empfohlen, und eine heminachente (hn) PCR wird im OIE-Handbuch für Diagnostiktests und Impfstoffe für terrestrische Tierebeschrieben, um alle Lyssaviren 5 zu erkennen. Hier beschreiben wir ein pan-Lyssavirus verschachtelten RT-PCR, das die spezifische und sensible Erkennung aller 18 Lyssavirus-Arten ermöglicht, die mit der FAT vergleichbar sind oder sie übertreffen. Das Prinzip der Methode ist ein RT der Ziel-RNA (konservierte Region des Lyssavirus N-Gens) in cDNA, gefolgt von der Verstärkung der cDNA um zwei Runden PCR. Die cDNA unterzieht sich der ersten Runde PCR mit äußeren Primern, um ein 845 bp-Fragment zu verstärken; Die Second-round-PRR verwendet dann das PCR-Produkt der ersten Runde als Vorlage, um ein 371 bp-Fragment mit inneren Primern zu verstärken. Die beiden PCR-Runden erhöhen die Empfindlichkeit des Tests deutlich.

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Protokoll

Die Verwendung von Mäusen in diesem Protokoll wurde durch den Verwaltungsausschuss für Tierschutz des Instituts für Militärmedizin, Akademie der Militärmedizinischen Wissenschaften, China (Labortierpflege und Nutzung des Ausschusses Genehmigung, Genehmigung genehmigt Nummer JSY-DW-2010-02). Alle institutionellen und nationalen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren wurden befolgt.

1. RNA-Extraktion

1. Extrahieren Sie RNA aus rabiaten Hirngewebe, Hautbiopsien, Speichel oder CSF oder aus RABV-infizierter Zellkultur, wobei Guanidinium isothiocyanat-phenol-chloroform-basierte Extraktionsmethoden oder kommerziell erhältliche virale RNA-Extraktionskits verwendet werden. Verwenden Sie die vorbereitete RNA sofort oder lagern Sie sie bei-80 ° C, bis sie benötigt wird.

2. Umkehrung der Transcription der Viralen RNA

1. Entfernen Sie die in Tabelle 1 aufgeführten RT-Reagenzien aus dem Gefrierschrank, halten Sie sie auf Eis und tauchen Sie auf und wirbeln Sie sie vor dem Gebrauch.
2. Bereiten Sie 12 μL RT-Reaktionsmix in einem 0,2 mL-PCR-Rohr mit den Reagenzien in Tabelle 1vor. Lassen Sie die Pipettiervariationen, indem Sie ein Volumen von Master-Mix mindestens eine Reaktionsgröße größer als erforderlich.
3. Fügen Sie dem RT-Reaktionsmix innerhalb eines PCR-Arbeitsplatzes in einem Vorlagen-Raum 8 μL-Probe, positive Kontroll-RNA oder negative Steuerung hinzu. Die RT-Positivkontrolle ist eine RNA, die aus der Zellkultur gewonnen wird, die mit dem festen RABV-Stamm CVS-11 infiziert ist (Challenge-Virus-Standard-11) und bei-80 ° C gespeichert wird. Die Negativkontrolle enthält RNase-freies ddH_{2 O.}
4. Den Inhalt der RT-Rohre durch Wirbeln vermischen; Dann Zentrifuge kurz.
5. Laden Sie die Reaktionsrohre in einen thermischen Zylinder. Das cDNA-Syntheseprogramm mit folgenden Bedingungen einrichten: 42 ° C für 90 min, 95 ° C für 5 min und 4 ° C auf Eis. Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 20 μL ein.

3. Erste-Runden-PCR

1. Halten Sie die PCR-Reagenzien, die in Tabelle 2 auf dem Eis aufgeführt sind, bis zum Gebrauch auf Eis; Dann tauten und wirbeln sie.
2. Bereiten Sie den PCR-Mix in der ersten Runde in einem 0,2 mL-PCR-Rohr mit den Reagenzien vor, die in Tabelle 2aufgeführt sind.
3. Fügen Sie eine 2 μL-Probe von cDNA oder Plasmid in den PCR-Mix der ersten Runde innerhalb eines PCR-Arbeitsplatzes in einem Vorlagen-Raum ein. Die PCR-Positivkontrolle ist CVS-11 cDNA, wie in Schritt 2.3 für die oben genannte RT-Methode erwähnt. Die PCR-Negativkontrolle ist ddH_{2 O.}
4. Übertragen Sie die versiegelten Rohre auf einen PCR-Thermozylinder und cycle mit den in Tabelle 3aufgeführten Parametern.

4. Second-Round PCR

1. Bereiten Sie den PCR-Mix in einem 0,2 mL-PCR-Rohr mit den Reagenzien vor, die in Tabelle 4aufgeführt sind.
2. Fügen Sie 2 μL PCR-Produkt in den Second-round-PCR-Mix ein. Dazu gehören ddH 2 O_alsnegative Kontrolle der Second-round-PCR.
3. Führen Sie das PCR-Thermoradfahren mit den gleichen Parametern durch, wie in Schritt 3.4 angegeben.

5. Analyse der PCR-Produkte durch Elektrophorese auf Agarose Gels

1. Bereiten Sie ein 1,5% agarose Gel vor, indem Sie 100 ml Tris-Acetate-EDTA (TAE) 1,5 g Agar hinzufügen und es gründlich auflösen, indem Sie es in einem Mikrowellenofen erwärmen.
2. Fügen Sie Ethidium Bromid (EB) (bei einer Endkonzentration von 0,01%) Oder eine andere kommerzielle EB-Substitution. Das Gel in die Form gießen und bei Umgebungstemperatur für mindestens 30 Minuten erstarren lassen.
3. Bereiten Sie die Verladeproben vor, indem Sie 5 μL jedes PCR-Produktes mit 1 μL 6x Ladepuffer mischen.
4. Laden Sie die Proben und den geeigneten DNA-Marker separat in die Brunnen und führen Sie das Gel ca. 30-45 min bei 120 V, bis die Farbstofflinie etwa 75%-80% nach unten läuft.
5. Schalten Sie die Leistung aus, trennen Sie die Elektroden von der Stromquelle und entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Gel-Kasten.
6. Verwenden Sie ein UV-Gel, das das Gerät dokumentiert, um die DNA-Fragmente zu visualisieren und zu fotografieren.

6. Charakterisierung von Nested RT-PCR

1. 6.1. Spezifität und Empfindlichkeit für den Nachweis von 18 Lyssavirus-Plasmiden
   1. Bestellen Sie 18 kommerzielle Plasmide, die das volle N-Gen jedes Lyssavirus (16 ICTV-Arten und zwei neuartige Arten) für die PCR enthalten.
   2. Berechnen Sie die Kopationsnummer des Plasmids mit der Avogadro-Nummer (N_A)und der folgenden Formel.
      [(g/μL Plasmid DNA)/(Plasmid-Länge in bp x 660)] x 6.022 x 10^{23 =} Anzahl der Molekües/μL
   3. Bereiten Sie Lagerlösungen (2,24 x 10⁹ Molekües/μL) aller 18 Plasmide in ddH_{2 O.}vor.
   4. Führen Sie neun 10-fache serielle Verdünnungen aller 18 Plasmide in ddH₂O. Dilute 10 μL jedes Plasmid-Bestands mit 90 μL von ddH 2 O. Vortex_undZentrifuge kurz.
   5. Führen Sie die PCR-Verstärkung, wie sie in den Abschnitten 3-5 beschrieben ist.
   6. Analysieren Sie die Spezifität und Empfindlichkeit der verschachtelten PCR, indem Sie eine Reihe von Lyssavirus-Plasmiden erkennen.
2. Bestimmung des d Etüden l imit
   1. Den Titer des Tollwut-Virus-Stammes CVS-11 Zellkultur auf 10^5.5 TCID₅₀/mL (Virustiter nach dem OIE-Handbuch bestimmt)⁵anpassen.
   2. Führen Sie fünf 10-fache serielle Verdünnungen von CVS-11 (Bestandslösung ist 10^5.5 TCID₅₀/mL), wie in Schritt 6.1.4 beschrieben.
   3. Führen Sie die RNA-Extraktion und die verschachtelten RT-PCR-Verstärkungsverfahren aller viralen Verdünnungen durch, wie in den Abschnitten 1-5 beschrieben.
3. Verdiäre ison of Die Nester RT-PCR Mit dem "Goldstandard" FAT
   1. Testen Sie alle klinischen Proben durch verschachteltes RT-PCR und bestätigen Sie dann die Ergebnisse mit der FAT⁵ und N Gensequenzierung⁹.
   2. Verwenden Sie für eine statistische Auswertung mit SAS 9.1 normalisierte Daten. Verwenden Sie den Cappa-Test und den Chi-Quadrat-Test von McNemar für einen statistischen Vergleich der diagnostischen Tests (SAS-Befehl: Proc freq; table/agree). Berechnen Sie Vertrauensintervalle, die eine abinomiale Verteilung annehmen.
4. Bewertung der Wirksamkeit bei der Prüfung degradierter Proben
   1. Stellen Sie zwei bestätigte klinische Hirngewebe-Proben von rabiaten Hunden bei 37 ° C.
   2. Die beiden Proben an jedem Tag der Exposition bei 37 ° C durch verschachtelte RT-PCR, die FAT und die MIT 5untersuchen.

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Ergebnisse

Die Ergebnisse der verschachtelten RT-PCR zur Erkennung von 18 Lyssavirus-Arten werden in Abbildung1 gezeigt. Alle PCR-positiven Steuerungen zeigten die zu erwartenden 845 bp in der ersten und 371 bp in den Zweitrundenverstärkungen ohne Band in der Negativsteuerung. Alle 18 Lyssaviren produzierten die erwarteten 845 and/oder 371 bp-Bands, was darauf hindeutet, dass die verschachtelten RT-PCR alle 18 lyssaviren entdeckt haben. Sechzehn Lyssaviruses Plasmide hatten eine effiziente Verstärkun...

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Diskussion

Derzeit ist RABV ein großes Lyssavirus, das für fast alle Menschen-und TiertRAB-Tollwut in China sowie in anderen Ländern verantwortlich ist. Zudem wurde erstmals eine IRKV-Variante von einem Murina leucogaster Fledermaus in der Provinz Jilin im Nordosten Chinas im Jahr 2012¹⁰identifiziert, und es wurde berichtet, dass es in der Provinz Liaoning 2017 11^Uhrden Tod eines Hundes verursacht. Zuletzt war auch ein neuartiges Lyssavirus, TWBLV, von einer japan...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 × TAE	Various	Various
6 × loading buffer	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	Various	Various
DL 2,000 Marker	Takara	3427A
dNTPs (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2.5 mM)	TakaRa	4030
Electrophoresis System	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μL)	TakaRa	RR001
Gel Imaging System	UVITEC	Fire Reader
Microcentifuge tubes	Various	Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR Machine	BIO-RAD	T100
PCR Tubes	Various	Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors	Various	Various
Random Primer	TakaRa	3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL)	TakaRa	2313A
RNase-free ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10×)	TakaRa	9152A
Tips	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various