Ein In-Vitro-Modell für das Studium der Tau Aggregation mit Lentiviral-vermittelter Transkription menschlicher Neuronen

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wird ein Verfahren beschrieben, bei dem menschliche neuronale Kulturen mit Linsenkonstrukten übertragen werden, die für mutwillige menschliche Tauben kodieren. Durchgeführte Kulturen zeigen Tau-Aggregate und damit verbundene Pathologien.

Zusammenfassung

Die Aberrante Aggregation des Proteintau ist pathogenisch an einer Reihe neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt, darunter die Alzheimer-Krankheit (AD). Obwohl Mausmodelle der Tauopathie eine wertvolle Ressource für die Untersuchung der neurotoxischen Mechanismen des aggregierten Tau zur Verfügung gestellt haben, wird immer deutlicher, dass das Maushirn aufgrund der Unterschiede zwischen den Arten in der Neurophysiologie ungeeignet ist. Modellierung des menschlichen Zustandes. Fortschritte in den Methoden der Zellkultur haben menschliche neuronale Kulturen für den experimentellen Einsatz in vitro zugänglich gemacht und bei der Entwicklung der Neurotherapie geholfen. Trotz der Anpassung der menschlichen neuronalen Zellkulturen sind In-vitro-Modelle menschlicher Tauopathie aber noch nicht weit verbreitet. Dieses Protokoll beschreibt ein zelluläres Modell der Tau-Aggregation, in dem menschliche Neuronen mit Linsenvektoren transferiert werden, die für pathogenisch mutierte Tau kodieren, die zu einem gelben Fluoreszenzprotein (YFP)-Reporter verschmolzen sind. Durchgeführte Kulturen produzieren Tau-Aggregate, die positiv für Thioflavin und Anzeige von Markern der Neurotoxizität, wie verminderte axonale Länge und erhöhte lysosomale Volumen. Dieses Verfahren kann ein nützliches und kostengünstiges Modell für die Untersuchung menschlicher Tauopathien sein.

Einleitung

Die pathologische Aggregation des mikrotubule-assoziierten Proteintau ist ein prägendes Merkmal vieler neurodegenerativer Erkrankungen, darunter AD, frontotemporale Demenz (FTD), Pick es Krankheit und progressive supranuclear Lähmung (PSP) 1^. In einem nicht erkrankten Zustand bindet tau Mikrotubule-Filamente in neuronalen Axonen²und stabilisiert sie. Die krankheitsbedingte Hyperphosphoryation von Tau fördert jedoch die Tau-Aggregation, die Trennung von Mikrotubuli und die neuronale Toxizität 3. Die toxischen Wirkungen des aggregierten Tau können eine aberzogene^Aktivierung von cholinergen 4 und glutamatergischen Rezeptoren⁵ beinhalten, die zu einer Dysregulation von intrazellulärem Kalzium und schließlich zum Zelltod führen. In Tiermodellen verbessert die Reduktion des Hirntau die Pathologie^bei AD-Mäuse 6 und bei Mausmodellen der sich wiederholendenmilden traumatischen Hirnverletzung 7.

Montierende Beweise zeigen, dass sich die Struktur und die Bindungsaffinität von Maus-Tau von der vom Menschen abgeleiteten Taube unterscheiden und dass die Maus tau für die Modellierung menschlicher Tauopathien ungeeignet ist. Menschliche Zelltauopathie-Modelle sind jedoch nicht weit verbreitet. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, ein In-vitro-Modell der Tau-Aggregation zu beschreiben, in dem menschliche Neuronen mit liniviralen Vektoren übertragen werden, die mutierende menschlicheTau-Konstrukte 9 enthalten. Tau Aggregat verursacht Linziviralkonstrukte für die Tau-Wiederholungsdomäne P301L und V337M Mutationen, die zu einem YFP-Reporter verschmolzen sind (Tau-R@ DLM-YFP) während der Steuerung den Code für die Wild-typ (Wt) tau-wiederholen Domain, die mit einem YFP-Reporter (Tau-Wt-YFP) verschmolzen ist. Neuronale Kulturen, die mit dieser Methode transduced werden, drücken etwa neunmal mehr Tau aus als nicht übertragene Kulturen. Obwohl die Menge der überdrückten Tau-Expressions-Expression in etwa gleich ist zwischen Tau-RDLM-YFP-und Tau-Wt-YFP-übertragenen Zellen, werden nur Neuronen mit Tau-RDLM-YFP-Displayaggregaten übertragen. Die Kulturen, die mit Tau-RDLM-YFP-Fleck positiv für Thioflavin übertragen werden, zeigen eine Reduktion der axonalen Länge und der synaptischen Dichte. Daher kann dieses zelluläre Modell ein nützliches Werkzeug sein, um die Tau-Aggregation in vitro zu untersuchen.

Protokoll

1. Vorbereitung von Medien und Reagenten

1. Tauen Sie die Kellermembranmatrix-Beschichtung für Kulturplatten bei 4 ° C auf (lassen Sie die Kellermembranmatrix nicht erwärmen oder sie wird sich verfestigen). 1 mL aliquots machen und bei-20 ° C oder-70 ° C aufbewahren.
2. Reconstitute basic fibroblaast growth factor (bFGF) in sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) bei 10 μg/mL und machen 10 μL Aliquots. Speichern Sie sie bei 4 ° C.
3. Zu einer neuen, unöffneten 500 ml Flasche DMEM/F12 mit Glutamin, B27 (10 ml), N2 (5 ml) und Penicillin-Streptomycin (5 ml) hinzufügen. 50 mL dieses neuronalen Stammzellmediums (NSC) in ein konisches Rohr legen und 10 μL von 10 μg/μL (2 μg/mL final) bFGF hinzufügen. Speichern Sie die NSC (+) bFGF-Medien bei 4 ° C.
4. Um (-) bFGF-Medien zu machen, verwenden Sie das gleiche Rezept wie in Schritt 1.3 beschrieben, fügen Sie aber nicht bFGF hinzu. Diese Medien werden verwendet, um NSCs zu Neuronen zu differenzieren und neuronale Kulturen nach der Differenzierung zu erhalten.

2. Lentivirale Konstrukte

NOTE: Vor Beginn der Arbeit mit Linsenkonstrukten, stellen Sie sicher, dass das Labor für die Verwendung von biosicher-Level-2 (BSL-2)-Wirkstoffen zugelassen wurde. Darüber hinaus müssen BSL-2-Kulturhauben, persönliche Schutzausrüstung (PSA) und Entsorgungsmethoden bei der Arbeit mit Linsenvektoren eingesetzt werden.

1. Erhalten Sie Tau-Konstrukte, die in Lentivirus verpackt sind, aus einer bevorzugten Quelle (siehe Sanders et al.¹⁰ für die Konstruierung von Informationen).

3. Kultivierung der neuralen Stammzellen der Menschen

NOTE: NSCs werden typischerweise auf 100000 – 150000 Cells/2 und die meisten kommerziell erhältlichen NSCs^werden als 1 x 10⁶ Cells/vial verkauft. Dieses Protokoll wurde für 10 cm Zellkultur-Gerichte optimiert (obwohl andere Größen von Gerichten verwendet werden können); Wenn also kommerziell erhältliche NSCs verwendet werden, müssen die NSCs möglicherweise um eine solche Kultivierung in Sechsbrunnen-Gerichten erweitert werden, um genügend Zellen zu bilden, um 10 cm lang zu säen. Dieses Protokoll kann alternativ für eine Vielzahl von Zellkultur-Schalengrößen angepasst werden (es enthält aber keine Anweisungen für die Weitergabe von NSCs, da diese Protokollean anderer Stelle 11^,12verfügbar sind).

1. Für die Herstellung von Zellkulturplatten sollte man einen Aliquot gefrorener Kellermembranmatrix-Beschichtung für Zellkulturplatten entfernen und bei 4 ° C auftauen (Aliquots können über Nacht am Tag vor der Absenderung der Zellen bei 4 ° C platziert werden). Fügen Sie 385 μL der Kellermembranmatrix-Beschichtung zu 5 ml DMEM/F12 media + penicillin-streptomycin hinzu.
   Hinweis: 5 ml DMEM/F12 media + penicillin-streptomycin reicht aus, um eine einzige 10 cm Schale zu beschichten (1 mL dieser Kellermembranmatrix-Beschichtungslösung reicht aus, um eine Brunnenschale einer Sechs-Brunnen-Schüssel zu beschichten). Alternativ, wenn die Zellen fixiert und immunbefleckt oder für Thioflavin gefärbt werden sollen, Kulturzellen auf Glaskofenlippen in 24-Brunnen-Kulturgerichten.
   1. Halten Sie die Medien und die Matrix-Beschichtung kalt vor und während Sie sie zu Kulturgerichten hinzufügen. Die Kellermembranmatrixbeschichtung zu Kulturschalen hinzufügen und die Gerichte 1 Stunde lang in einen Inkubator (bei 37 ° C) legen. Für eine optimale Beschichtung sollte die Kellermembranmatrix nicht mehr als 1 h inkubieren. Nach 1 Stunde die Kellermembranmatrixbeschichtung aus den Zellkulturen-Geschirr absaugen. Vergewissern Sie sich, dass dies mit der Vorbereitung der NSCs zusammenfällt.
      NOTE: Wenn die Zellen nicht aus tiefgefrorenen Vorräten aufgetaut werden, überspringen Sie den Schritt 3.2 und fahren Sie mit Schritt 3.3 fort.
2. Wenn Zellen aus gefrorenen NSC-Vorräten aufgetaut werden, nehmen Sie eine Ampulse gefrorener Zellen und wärmen sie in einem Wasserbad, das auf 37 ° C erhitzt wird, indem Sie die Ampullen im Wasser hin und her bewegen. Nach dem Auftauen die Ampullen mit 70% Ethanol besprühen und in eine Zellkulturhaube geben. Übertragen Sie die Zellen auf ~ 10 ml DMEM/F12 + penicillin-Streptomycin-Medien und zentrifugen Sie das Rohr bei Raumtemperatur bei 1.000 x g für 5 Minuten. Aspirieren Sie die Medien und erneuern Sie die Zellen in NSC-Medien.
3. Verdünnen Sie die Zellen in den NSC-Medien, um die entsprechende Saatdichte für das verwendete Zellkulturgefäß zu erhalten.
   NOTE: Werden zum Beispiel NSCs auf eine Sechs-Brunnen-Platte geplatzt — eine Quelle auf einer Sechs-Brunnen-Kulturschale eine Fläche von 9 cmhat — werden 900.000 bis 1.350.000 Zellen zum Saatgut benötigt. So kann eine Ampulle, die 1.000.000 Zellen enthält, in 2 ml Medien wiederbelebt und zu einem einzigen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Schüssel hinzugefügt werden.
4. Fügen Sie genügend Zellen hinzu, die in den NSC-Medien aufgehängt sind, um die Kellermembranen Matrix-beschichtete Kulturspeisen (100.000 Cells/2) zu säen und die Medien jeden zweiten Tag zu verändern (wenn Sie einen gefrorenen Vorrat verwenden, ändern Sie die Medien am Tag nach der Beschichtung und alle zwei Tage danach). Wachsen Sie die Zellen, bis sie 75% – 80% zusammenfließend sind.
   NOTE: Die Zellen werden wahrscheinlich 75% – 80%-Zusammenfluss kurz nach der Beschichtung erreichen, aber dies kann länger dauern, wenn eingefrorene Bestände verwendet werden.
5. Sobald die NSCs 75% – 80% zusammenWichtiger sind, beginnen Sie mit der neuronalen Differenzierung, indem Sie die NSC (+) bFGF-Medien entfernen und durch NSC (-) bFGF-Medien ersetzen. Kultur die Zellen in diesen Medien (die die Medien jeden zweiten Tag ersetzen) für mindestens 4 Wochen.
   NOTE: Die Zellen werden sich nach dem Entzug von bFGF noch einige Tage teilen; Daher können die Zellen 90 – 100% zusammenwirken. Nach einer 4 Wochen kultivierten Zellen ein neuronales Schicksal und sind bereit für die Behandlung von Linsenviren.

4. Transduktion und Pflege der neuronalen Kulturen

1. Um Neuronen mit Lintivirus zu transzifieren, verwenden Sie eine Titer-Zählung von 3,4 x 10 5 transproduzierbaren Units/Zelle (eine 100% zusammenfließende 10 cm Schüssel enthält ~ 10 Millionen Neuronen). Die transproduzierbaren Einheiten auf die notwendige Konzentration in Zellkulturmedien verdünnen und in die Zellen einfügen (verwenden Sie das normale Medienvolumen für die Zellkulturschale). Zwei Tage nach dem Hinzufügen des Lintivirus waschen Sie die Zellen 1x mit frischen (-) bFGF-Medien (ohne Lintivirus) und kultivieren Sie wie gewohnt in (-) bFGF-Medien weiter.
2. Für die postlenvirale Behandlung werden die übertragenen Neuronen täglich durch die Veränderung der Zellkulturmedien ([-] bFGF-Medien) geerntet. Halten Sie die Zellen ca. 8 Wochen nach der Transduktion. Visualisieren Sie die Zellen routinemäßig unter einem Lichtmikroskop, um die Lebensfähigkeit zu gewährleisten.
   NOTE: Sparsamkeit oder dendritische Bruchstellen sind Anzeichen dafür, dass die Zellen nicht mehr lebensfähig sind.

5. Bildgebung der Zellen

1. Live-Zell-Bildgebung
   1. Nach der Transduktion (4 Tage nach dem Zusatz von Linsenvirus), beobachten Sie YFP-Signale unter einem fluoreszierenden Mikroskop, das in der Lage ist, Live-Zell-Bildgebung. Nehmen Sie die Zellkulturgerichte aus dem Inkubator heraus und sorgen Sie dafür, dass die Kulturbrunnen steril bleiben, indem Sie den Deckel auf den Kulturgerichten halten. Visualisieren Sie die Zellen mit einem 10x-Objektiv mit einer Anregungswellenlänge von ~ 514 nm und einem Emissionsfilter von ~ 527 nm.
      NOTE: Aggregate sind in der Regel in übertragenen Zellkulturen 6 – 8 Tage nach der Anwendung des Linsenvirus sichtbar.
2. Festzellenfärbung (β-Tulbulin-III-Kennzeichnung und Thioflavin-Färbung)
   1. Um die Zellen in Paraformaldehyd (PFA) zu fixieren, entfernen Sie die Kulturmedien von übertragenen Neuronen, die auf Glaskissen angebaut werden. Die Zellen 1x mit PBS waschen, die Wäsche entfernen und bei Raumtemperatur 300 – 500 μL (bei Verwendung von 24-well-Platten) von 4% PFA (verdünnt in PBS) zu den Kessellippen hinzufügen. Die PFA entfernen und die Coverslips 2x mit PBS waschen.
   2. Bereiten Sie eine Blockadsolution vor, die aus PBS, 3% Rinder-Serum Albumin (BSA) und 0,3% Triton X-100 besteht. 300 – 500 μL der Lösung zu den Brunnen geben und die Koverslips 2 h bei 4 ° C inkubieren. Nach 2 Stunden verdünnen Sie die primären Antikörper (bei einer Antikörperkonzentration von 1:500) in der Blockadösung und fügen Sie 300 – 500 μL primärer Antikörper-Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Legen Sie die Platte über Nacht bei 4 ° C auf eine schaukelnde oder rotierende Plattform (bei niedriger Geschwindigkeit).
   3. Am nächsten Tag die primäre Antikörper-Lösung entfernen und die Coverslips 3x für je 5 min mit PBS waschen. Verdünnen Sie sekundäre Antikörper in einer Blockpufferlösung (bei einer Konzentration von 1:1000) und fügen Sie jedem Brunnen sekundäre Antikörper-Lösung hinzu. Wählen Sie den passenden sekundären Antikörper aus, indem Sie ein Fluoreszenz-Tag verwenden, das sich nicht mit dem YFP-Signal überschneidet (CY-3 zum Beispiel). Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 2 h auf einer schaukelnden oder rotierenden Plattform. Nach 2 Stunden die sekundäre Antikörperlösung entfernen und die Coverslips 3x für je 10 min mit PBS waschen.
   4. Die Koverslips in doppeldeionisiertem Wasser (DDW) für 10 min waschen. Entfernen Sie die DDW und fügen Sie 300 μL/gut von 0,15% Thioflavin-S in 50% Ethanol für 10 min verdünnt. Entfernen Sie die Thioflavin-Lösung und waschen Sie die Coverslips 2x für 4 min mit je 50% Ethanol, gefolgt von einem 4 min Mit 30% Ethanol und zwei Waschungen für je 5 min mit je 30% Ethanol waschen. Die Coverslips 1x mit DDW vor der Montage waschen.
      NOTE: Die im Schritt 5.2.4 beschriebene Thioflavin-Färbung ist optional.
   5. Um die Koppeln zu Glasrutschen zu montieren, legen Sie einen einzigen Tropfen Montagebresum auf die "+"-Seite einer Glasrutsche. Entfernen Sie alle Flüssigkeit aus dem Brunnen, der den Glaskückenlip enthält, und entfernen Sie mit feinen Zangen sorgfältig die Glaskappe, wobei der Überblick bleibt, welche Seite die kultivierten Zellen hat.
   6. Drücken Sie sanft die Kante des Keillippes gegen einen Kimwipe, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Noch die Koppel mit feinen Zangen greifen, berühren Sie die Kante (mit der Zellseite zum Tropfen des Montagebogens) der Coppel auf die Montagebräger, und dann, sanft platzieren Sie die Koppel auf die Montagebmedien (Platzierung der kultivierten Zellen in die Montage Medien und Sandwicheln zwischen der Kitzelung und der Glasscheibe). Lassen Sie die Montagemedien vor der Bildgebung 30 Minuten lang verhärten. Die Dias können für den zukünftigen Einsatz bei-20 ° C gespeichert werden.
   7. Stellen Sie die Zellen mit einem fluoreszierenden Mikroskop und den entsprechenden Erreduktionsspektren (YFP = ~ 514/527 m, CY-3 = ~ 55568 nm, und Thioflavin S = ~ 390/426 nm).

6. Optionale Methoden

1. Alle 2 Tage konditionierte Medien aus den Kulturen sammeln und bei-20 ° C speichern, um zukünftige Analysen von Tau-Arten zu erhalten, die von den Kulturen freigesetzt werden.

Ergebnisse

Tau-RDLM-YFP-übertragene Neuronen wurden fluoreszierend mit YFP versehen, und RDLM-übertragene Kulturen zeigten Aggregate nach der Transduktion. Diese Einschlüsse befleckten positiv für Thioflavin (Abbildung 1). Wie Abbildung 1 zeigt , produziert dieses Protokoll neuronale Kulturen, die Thioflavin-positive Tau-Aggregate aufweisen. Für erste Experimente wird empfohlen, dass die neuronale Differenzierung durch die Immunolabeling des neuronenspezifischen Marke...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Generierung eines In-vitro-Modells menschlicher Tauopathie, das silberfarbene Flecken positive Aggregate und Thioflavin-positive neurofibrilläre Tangles (NFTs) aufweist. Darüber hinaus weisen die übertragenen Zellen tau-induzierte Pathologien wie morphologische Defekte, eine reduzierte Synaptogenese und ein erhöhtes lysosomales Volumen auf. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es ein zugängliches und kostengünstiges Modell der neuronalen Tauopathie bietet, das sowoh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm culture dishes	Thermofisher	12556002
15 mL tubes	Biopioneer	CNT-15
16% paraformaldehyde	Thermofisher	50-980-487
24 well culture plates	Thermofisher	930186
50 mL tubes	Biopioneer	CNT-50
70% ethanol in spray bottle	Various sources	NA
B27 supplement	Thermofisher	17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
Cell culture incubator	Various sources	NA
Centrifuge	Various sources	NA
DMEM-F12 culture media with glutamine	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% concentration or higher)	Various sources	NA
Flourescently labeled secondary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Fluorescent microscope	Various sources	NA
Glass coverslips	Thermofisher	1254581
Glass slides	Thermofisher	12-550-15
Human neural stem cells	Various sources	NA
Lentiviral vectors	Various sources	custom order
Mounting media	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphate buffered saline	Thermofisher	14190250
Primary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Rocking or rotating platform	Various sources	NA
Sterile cell culture hood	Various sources	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Water bath	Various sources	NA