Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Beurteilung der funktionalen synaptischen Mannigfaltigkeit mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten.

Zusammenfassung

In das zentrale Nervensystem bilden ein paar Neuronen oft mehrere synaptischen Kontakte und/oder funktionalen Neurotransmitter Freisetzungsstandorten (synaptische Multiplizität). Synaptische Vielheit ist aus Kunststoff und Änderungen während der Entwicklung und in verschiedenen physiologischen Bedingungen, wird ein wichtiger Faktor für die Effizienz der synaptischen Übertragung. Hier erläutern wir Experimente für die Schätzung des Grades der Vielzahl von Synapsen auf einen bestimmten postsynaptischen Neuron mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten zu beenden. Insbesondere ist Voltage-Clamp-Aufnahme verwendet, um die Differenz zwischen der Amplitude des spontanen exzitatorischen postsynaptischen Ströme (sEPSCs) und Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs) zu vergleichen. Die Theorie hinter dieser Methode ist, dass afferenten Inputs, die Vielfalt zu zeigen große, Aktionspotential-abhängigen sEPSCs durch die synchrone Version angezeigt werden, die bei jedem synaptischen Kontakt auftritt. Im Gegensatz dazu wird Aktionspotential-unabhängige Version (das asynchrone) kleiner Amplitude mEPSCs generieren. Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Experimenten und Analysen, die Existenz der synaptischen Vielheit zu charakterisieren und beschreibt die Anforderungen und Grenzen der Technik. Diese Technik kann angewendet werden, wie verschiedene Verhaltensstörungen, pharmakologische oder ökologischen Eingriffe in Vivo betreffen die Organisation der synaptischen Kontakte in verschiedenen Gehirnregionen zu untersuchen.

Einleitung

Synaptische Übertragung ist ein grundlegender Mechanismus für die Kommunikation zwischen den Neuronen, und daher Gehirnfunktion. Synaptische Übertragung ist auch labil und kann seine Wirksamkeit eine aktivitätsabhängige ebenso wie in Reaktion auf modulierende Signale¹ändern. So wurde das synaptischen Funktion untersuchen ein Schlüsselfokus der neurowissenschaftlichen Forschung. Ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie ist eine vielseitige Technik, die uns zu verstehen, durch Erarbeitung experimenteller Designs und Datenanalysen, detaillierte biophysikalische und molekulare Mechanismen der synaptischen Übertragung ermöglicht. Ein häufig verwendeter Ansatz vielleicht aufgrund der Einfachheit der Technik und Konzept, ist die Messung der Miniatur exzitatorischen/inhibitorischen postsynaptischen Ströme (mE / IPSCs) unter Spannung Klemme Konfiguration^{2,3, 4 , 5 , 6}. einzelne mPSCs repräsentieren den Fluss von Ionen durch Ionotropic postsynaptischen Rezeptoren (z. B. AMPA und GABA-_A -Rezeptoren) in Reaktion auf die Bindung von ihren jeweiligen Neurotransmitter aus den präsynaptischen Terminal ^{7 freigegeben} . Da die Aufnahme im Beisein der Voltage-gated Na⁺ -Kanal-Blocker Tetrodotoxin (TTX) vorliegt, das Release ist Aktionspotential-unabhängig und beinhaltet normalerweise eine einzelne synaptische Vesikel, die Neurotransmitter enthält. Ausgehend von dieser Annahme, ist die durchschnittliche Amplitude der mPSCs allgemein als grobe Schätzung für die Quanten Größe verwendet, die steht für die Anzahl und die Funktionalität der postsynaptischen Rezeptoren gegen eine single-Auskopplung-Website. Auf der anderen Seite gilt als die Frequenz des mPSCs, eine Kombination aus der Gesamtzahl der Synapsen auf der postsynaptischen Zelle und Eintrittswahrscheinlichkeit durchschnittliche Freigabe beenden zu vertreten. Diese Parameter messen jedoch nicht eine weitere Variable Multiplicativity von Synapsen und synaptische Vielfalt – das ist wichtig für die Effizienz der synaptischen Übertragung.

Basierend auf der Quanten Theorie der synaptischen Übertragung^7,8,9, die Stärke einer gegebenen Verbindung zwischen zwei Neuronen ist abhängig von drei Faktoren: die Anzahl der funktionellen Synapsen (N), die postsynaptischen Reaktion auf die Veröffentlichung einer einzigen synaptischen Vesikel (Quanten Größe; Q) und die Wahrscheinlichkeit der Freisetzung von Neurotransmittern (P-_R). Synaptische Multiplizität ist äquivalent zu N. Die Entwicklung der synaptischen Vielheit oder das Beschneiden der multiplikativen Synapsen ist Kunststoff während der Entwicklung und in anderen Krankheit Staaten^3,4,6,10. Aus diesem Grund hat Charakterisierung synaptischen Vielzahl wichtige Implikationen für die Effizienz der synaptischen Übertragung in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Techniken, wie z. B. Elektronenmikroskopie können strukturelle Beweise der synaptischen Multiplizität identifizieren, indem er erkennt mehrere synaptischen Kontakte mit Ursprung aus dem gleichen Axon auf der gleichen postsynaptischen Neuron-^{11,12, 13,14}. Diese strukturell identifizierten Multisynapses kann jedoch funktional Stille^15,16. Genaue funktionelle Untersuchung des N erfordert technisch anspruchsvolle elektrophysiologische Ansätze wie gekoppelten ganz-Zell-Aufnahmen, die erkennen, ob eine bestimmte Verbindung mehrerer Standorte der funktionalen Release hat und minimale Stimulation-Ansätze, die darauf abzielen, ein einziges vermeintliche Axon zu rekrutieren.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für die Schätzung der synaptischen Vielfalt durch die Annahme einer Methode, die ursprünglich von Hsia Et al.²entwickelt. Diese Technik beinhaltet die Messung der spontanen PSCs (sPSCs) und mPSCs mit ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, was uns erlaubt, die Schätzung des synaptischen Vielfalt über alle Eingaben für ein bestimmtes Neuron.  Da zuvor definierten, synaptische Mannigfaltigkeit die Anzahl der Synapsen zwischen eines bestimmten Prä- und postsynaptischen Neurons widerspiegelt. Wenn mehrere Synapsen synchron durch ein Aktionspotential rekrutiert werden, werden mit hoher Wahrscheinlichkeit zeitliche Summierung der einzelnen (d.h. Quanten) EAP, erzeugen eine größere Amplitude PSC.  MPSC Aufnahmen (in denen Aktionspotentiale durch TTX blockiert sind), die Wahrscheinlichkeit der zeitliche Summierung der einzelnen (nicht-synchrone) mPSCs ist gering. Mit dieser Begründung, werden synaptische Multiplizität abgeschätzt durch den Vergleich der sPSC Amplitude (mit Aktionspotential-abhängige Version) auf die mPSC Amplitude.

Um die Existenz der Multiplizität untersuchen beschreiben wir vier Experimente und ihre Analysen mit glutamatergen EPSCs als Beispiel. Jedoch kann der gleiche Ansatz verwendet werden, für die schnelle Übertragung der GABAergen/glycinergen (IPSCs). Eine kurze Begründung für jedes Experiment wird nachfolgend beschrieben. Zunächst, wie oben erläutert, synaptische Multiplizität abgeschätzt werden durch den Vergleich der Amplitude der sEPSCs zu mEPSCs. Es gibt zwei Anforderungen für diesen Ansatz; (1) präsynaptischen Axone müssen eine ausreichende Anzahl von Aktionspotentialen Feuer, während der Aufnahme, und (2) P_R muss hoch sein, so dass mehrere Synapsen Neurotransmitter bei der Ankunft ein Aktionspotenzial freigeben. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, sEPSCs sind zuerst aufgenommen in niedrigen Ca^{2 +} künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS), und dann in der Gegenwart eine niedrige Konzentration von K⁺ -Kanal-Antagonisten, 4-Aminopyridine (4-AP) Aktion erhöhen möglichen Zündung und P_R. Dann feuern Aktionspotential TTX und Pr sank um ein Voltage-gated Ca^{2 +} -Kanal-Blocker Cd^{2 +}wehrt. Die Amplitude der sEPSCs (mit 4AP) ist im Vergleich zu der mEPSC (mit 4AP, TTX und Cd^{2 +}). Im zweiten Experiment ist Ca^{2 +} äquimolaren Sr^{2 +} in der ACFS, Vesikel Release Synchronisierung abgelöst. Als Ca^{2 +} für die synchrone Version von Vesikeln erforderlich ist, sollte Ersatz mit Sr^{2 +} großer Amplitude sEPSCs beseitigen, die Vielheit bezeichnend sind. Drittens, mechanistisch, Multiplizität kann ergeben sich aus entweder mehrere synaptischen Kontakte gleichen postsynaptischen Neuron oder multivesicular Version (d. h. mehrere Bläschen innerhalb einer einzigen synaptischen Kontakt freigegeben)^17,18. Um zwischen den beiden Arten der Vielheit zu unterscheiden, verwendet das dritte Experiment eine geringe Affinität, schnelle trennendem kompetitiver Antagonist des AMPA-Rezeptoren, γ-D-Glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 , um festzustellen, ob groß sEPSC sind das Ergebnis der zeitliche Summation der unabhängigen Synapsen oder multivesicular Version, die auf einer überlappenden Bevölkerung der postsynaptischen Rezeptoren. Im Falle großer Amplitude Veranstaltungen von multivesicular Release werden γ-DGG weniger effektiv bei der Hemmung größer im Vergleich zu kleineren sEPSCs während der großen sEPSCs, die durch die zeitliche Summierung von mehreren synaptischen Kontakte entstehen in ähnlicher Weise betroffen sind Γ-DGG. Im vierten Versuch ist eine physiologische Methode zum Aktionspotential brennen, nämlich afferenten synaptic Stimulation zu erhöhen. Platzt der synaptischen Aktivität können vorübergehend erhöhen/die spontane Aktionspotential abfeuern und Freigabe Wahrscheinlichkeit angeregten Afferenzen erleichtern. Dieser Ansatz ermöglicht daher Multiplizität in physiologischer Weise manifestieren.

Das folgende Protokoll beschreibt die Methode für die Durchführung dieser Experimente im Hypothalamus Gewebe Maus. Insbesondere werden Corticotropin releasing Hormon (CRH) Neuronen des Nucleus paraventrikulären des Hypothalamus (PVN) verwendet. Wir beschreiben die Verfahren für die Durchführung der gesamten Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie und erläutern die spezifischen Experimente für synaptische Vielheit zu testen.

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Protokoll

Alle Tierversuche werden von Animal Care Committee der University of Western Ontario im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitlinien (AUP #2014-031) genehmigt.

(1) Lösungen

1. Slicing Lösung
   1. Die Zusammensetzung der Slice-Lösung finden Sie unter Tabelle 1 .
   2. Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
   3. Lösen Sie für 1 X Schneid-Lösung Nahco3₃, Glukose und Saccharose in DdH₂O und zugeben Sie 20 X Brühe. Sicherzustellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 315-320 mOsm und speichern Sie die Lösung für nicht mehr als 1 Woche bei 4 ° C.
   4. Füllen Sie zwei Becher mit 100 mL Lösung aufschneiden und mit Parafilm abdecken. Entspannen Sie die Lösung in einer Tiefkühltruhe, bis die Lösung (ca. 20 min bei-80 ° C Gefrierschrank) teilweise gefroren wird. Mit einem Gas-Verteilerrohr, Blase beide Becher des Schneidens Lösung mit 95 % O₂5 % CO₂ für 20 min auf Eis.

	Lösungskonzentrationen (mM)
	Schneiden	Normale ACFS	Niedrige Ca2 + ACFS	SR+ ACFS	Pipette/interne
NaCl	87	126	126	126	-
KCl	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl2	0,5	2.5	0,5	-	-
SrCl2	-	-	-	2.5	-
MgCl2	7	1.5	2.5	1.5	2
NaH2PO4	1.25	1.25	1.25	1.25	-
Nahco33	25	26	26	26	-
Glukose	25	10	10	10	-
Saccharose	75	-	-	-	-
K-Gluconat	-	-	-	-	116
Na-Gluconat	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
Na3GTP	-	-	-	-	0,3

Tabelle 1: Die Zusammensetzung der verschiedenen Lösungen.

2. ACFS (für Slice Wiederherstellung und Wartung)
   1. Finden Sie in Tabelle 1 die Zusammensetzung der ACFS.
   2. Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
   3. Lösen Sie für 1 X ACFS Nahco3₃ und Glukose im DdH₂O auf und zugeben Sie 20 X Brühe. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 298-300 mOsm. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.
3. ACFS (niedrige Ca^{2 +} für die Aufnahme)
   1. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des niedrigen Ca^{2 +} ACFS.
   2. Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
   3. Für 1 x niedrig Ca^{2 +} ACFS, auflösen, Nahco3₃ und Glucose in ddH2O und fügen Sie 20 x (CaCl₂ und MgCl₂ frei) Lager, CaCl₂ und MgCl₂ angegebenen Konzentrationen. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 298-300. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.
4. ACFS (Sr^{2 +} für die Aufnahme)
   1. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des Sr^{2 +} ACFS.
   2. Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
   3. Für 1 x Sr^{2 +} ACFS, auflösen, Nahco3₃ und Glukose im DdH₂O und fügen Sie 20 x (CaCl₂ und MgCl₂ frei) Lager, SrCl₂ und MgCl₂ angegebenen Konzentrationen. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 298-300. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.
5. Interne Lösung
   1. Die Zusammensetzung der K-Gluconat basierte interne Lösung finden Sie unter Tabelle 1 .
   2. Fügen Sie 15 mL Molekularbiologie Grade Wasser um 20 mL der internen Lösung zu machen hinzu, eine 50 mL-Tube. Führen Sie die folgenden Schritte auf dem Eis.
   3. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor der Zeit 1 M Lager Konzentrationen in der molekularen Biologie Klasse Wasser. Hinzufügen (in mL): 2,32 K-Gluconat, 0,24 Na-Gluconat, 0,20 HEPES, 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl₂ bis 50 mL-Tube.
   4. 100 µL von 0,3 M Na₃GTP hinzufügen.
   5. Wiegen Sie 44,08 mg K₂ATP in einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch und fügen Sie 1 mL Molekularbiologie Grade Wasser dann fügen Sie 50 mL-Tube hinzu.
   6. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2-7,4 mit 1 M KOH. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 283-289 mOsm.

2. Slice-Vorbereitung

1. Werkzeuge vorzubereiten
   1. Die Recovery-Kammer (gebaut von einem 250 mL-Becherglas mit 4 Brunnen und Netting) 200 mL ACFS hinzu, und legen Sie die Recovery-Kammer in einem Wasserbad (35 ° C).
   2. Die Kammer mit einer Paraffin-Folie abdecken und Blase ständig der ACFS mit 95 % O₂5 % CO₂ mit einer Glas-Verteilerrohr für mindestens 20 Minuten.
   3. Die Zerlegung durch das Einrichten der Werkzeuge (Skalpell, abgewinkelte feine Schere, Pinzette, feine Pinsel, Plastiklöffel) vorbereiten.
   4. Füllen Sie eine 60 mL-Spritze mit ca. 15 mL der eiskalte slicing Lösung aus Schritt 1.1.4.
   5. Bereiten Sie die Dissektion Plattform, indem ein Filterpapier auf den Deckel des well-Platte.
   6. Bereiten Sie die Slice Kammer indem du es in die Schale und das Tablett mit Eis füllen.
   7. Richten Sie die Vibratome durch die Sicherung einer Einweg Klinge in den Klingenhalter.
   8. Machen Sie eine Transferpipette durch die Spitze einer Pasteurpipette brechen und platzieren ein Gummiball über die gebrochene Ende.
2. Gehirn der Maus zu sezieren
   1. Betäuben Sie das Tier in einer Kammer mit 4 % Isofluran gesättigt, bis spinale Reflexe fehlen.
   2. Das Tier mit einer Guillotine enthaupten und schnell das Gehirn zu entfernen.
      1. Machen Sie einen Mittellinie Einschnitt mit einer Skalpellklinge Nr. 22 von rostral zur kaudalen.
      2. Schälen Sie die Kopfhaut seitlich auf jeder Seite des Kopfes.
      3. Verwendung feine Schere, schneiden Sie den Schädel auf der einen Seite von kaudalen rostral (darunter auch die Seite der Stirnbeine), Verwendung Vorsicht nicht auf das Gehirn schädigen.
      4. Verwendung Zangen, heben Sie das Stück Schädel aus Gehirn und schnell abkühlen das Gehirn mit 15 mL eiskaltes slicing-Lösung mit der Spritze aus Schritt 2.1.4.
      5. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel.
      6. Ort des Gehirns in einem der Becher gefüllt mit eiskalten slicing-Lösung (aus Schritt 1.1.4) sprudelte mit 95 % O₂5 % CO₂.
3. Scheiben von Maus Hypothalamus vorbereiten
   1. Das Gehirn für die gewünschte Hirnareal zu blockieren und Schnittwinkel (z. B. für koronalen Hypothalamus Scheiben schneiden Sie das Gewebe rostral zur optischen Chiasmus und caudale, der Pons mit einer Klinge und der kaudalen Block hat eine flache Oberfläche senkrecht auf der Basis des Gehirns zu gewährleisten).
   2. Mit einer geschnittenen Stück Filterpapier, das Gehirn von der vorderen Seite holen und die hintere Seite das Halteblech mit Sekundenkleber verkleben.
   3. Schnell das Halteblech in das slicing Kammer und füllen Sie die Kammer mit slicing Lösung aus den zweiten Becher im Schritt 1.1.4.
   4. Das Slice Kammer und Eis Fach auf der Vibratome zu sichern.
   5. Definieren Sie den Schneid Bereich (Front- und Seitenzahnbereich zum Gehirn) und beginnen Sie, 250 µm Dicke koronalen Scheiben schneiden. Empfohlene Parameter: 0.10 mm/s, Amplitude Geschwindigkeit 2 mm.
   6. Schneiden Sie die Scheiben auf die entsprechende Größe für die gewünschte Hirnareal.
   7. Die Scheiben bei 35 ° C für 30-45 min zu erholen. Dann entfernen Sie die Recovery-Kammer aus dem wärmenden Bad und ermöglichen die Scheiben bei Raumtemperatur für eine zusätzliche 30 min. halten Scheiben bei Raumtemperatur für den Rest des Tages erholen und weiterhin das Bad ständig mit 95 % O₂5 % Blase CO₂ .

(3) Whole-Cell Patch ClampRecording

1. Ziehen Sie die Patch-Pipetten
   1. Mit den vorgeschlagenen Parametern für die Aufnahme aus der Pipette Abzieher Handbuch ganz-Zelle ziehen Sie Patch Pipetten aus dicken Mauern umgebene Glas eine Pipette Widerstand von 3-5 MΩ.
   2. Mit Hilfe einer Microsyringe (kommerzielle oder hausgemachte), Füllung einer Pipettenspitze mit gefilterten interne Lösung. Eine Microsyringe machen, brennen die Spitze eine 1 mL Spritze und ermöglichen die Spitze zu schaffen fallen eine lange feine Spitze.
2. Die ganz-Zell Konfiguration zu erhalten
   1. Legen Sie die Aufnahme Pipette direkt über die Scheibe und Offset Pipette in Klammer Spannungsmodus aktuell. Leichten positiven Druck auf die Pipette und sperren den Absperrhahn.
   2. Wählen Sie eine gesunde Zelle mit einer intakten Membrane und nähern Sie sich die Zelle mit der Pipette. Der Überdruck sollte dazu führen, dass eine leichte Störung im Gewebe (z. B. eine langsame Welle im Gewebe bei der Eingabe).
   3. Weiterhin langsam auf die Zelle mit diagonalen Bewegungen, bis die Pipette ein kleines Grübchen auf der Zelloberfläche bildet die Pipette näher zu bringen.
   4. Die Überdruck-Sperre. Die Zelle beginnt, eine Dichtung zu bilden und der Widerstand steigt über 1 GΩ. In Spannung Klemme, halten die Zelle am-68 mV.
   5. Ziehen Sie leicht weg von der Zelle diagonal, Überdruck aus der Zelle zu entfernen.
   6. Für die schnellen und langsamen Pipette Kapazität zu kompensieren.
   7. Anwenden einer kurzen Absaugung durch das Rohr an der Pipette Halter zu brechen durch die Zelle ganz-Zell Konfiguration angeschlossen.
   8. Umstellung auf Zelle Modus auf der Membran testen Fenster in eine Elektrophysiologie Datenerfassung und Analyse-Software (z.B., Clampex).
   9. Durchführen Sie vor jeder Spannung Klemme Aufnahme einen Membran-Test mit der gleichen Software und erfassen Sie die relevanten Parameter in einem Labor-Buch (Membran Widerstand, Zugang Widerstand und Kapazität).
   10. Behalten Sie die Temperatur des Bades Aufnahme bei 27-30 ° C und die Durchflussmenge bei 1,5-2,0 mL/min für spätere Experimente.

4. Vielfalt Experimente

1. Experiment 1: Schätzung Multiplizität mit 4-AP
   1. In Spannung Klemme, halten die Zelle am-68 mV. Mit der gleichen Software, Aufzeichnen der sEPSCs während das Bad mit niedrigen Ca^{2 +} ACFS Vorrichtung. Rekord für mindestens 5 Minuten nach dem Start des ganz-Zell Konfiguration um eine stabile Basislinie Aufnahme zu gewährleisten, da die synaptische Aktivität kurz nach dem Durchbruch der Membran hoch sein kann.
   2. Mit einer Mikropipette hinzu der ACFS 4-AP und Bad gelten 30 µM 4-Fewo Datensatz sEPSCs für mindestens 10 Minuten bis die volle Wirkung zu erhalten.
   3. Der ACFS mit 4-AP fügen Sie 0,5 µM TTX und 10 µM Cd^{2 hinzu +} und zeichnen Sie der mEPSCs mindestens 10 min lang auf.
   4. Verwenden Sie für offline-Analyse die letzten 1 min Baseline unmittelbar vor der Anwendung von 4-AP (in niedrigen Ca^{2 +} ACFS), 10. min 4-AP-Anwendung und der 10. min TTX Anwendung.
2. Experiment 2: Synchronisierung Vesikel Version mit Sr^{2 +}
   1. Während das Bad mit normalen Ca^{2 +} ACFS (das gleiche wie das Bad ACFS) Rekord sEPSCs für mindestens 5 min Vorrichtung.
   2. Wechseln Sie von der normalen Ca^{2 +} ACFS und beginnen Sie Vorrichtung Sr^{2 +} ACFS (aus Schritt 1.4) und Rekord sEPSCs.
   3. Vergleichen Sie für offline-Analyse um festzustellen, ob die große Amplitude sEPSCs durch die synchrone Freisetzung von Vesikeln sind, die letzten 1 min Baseline (im normalen ACFS) in^{der 10 Minute Sr2 + ACFS Anwendung} .
3. Experiment 3: test für multivesicular Version Γ- DGG
   1. In niedrigen Ca^{2 +} ACFS Rekord sEPSCs mindestens 5 min lang.
   2. Der ACFS durch die Perfusion System 30 µM 4-AP hinzufügen. Rekord sEPSCs mindestens 10 min lang.
   3. Der ACFS mit 4-AP 200 µM γ-DGG hinzu und zeichnen Sie der sEPSCs mindestens 10 min lang auf.
   4. Wie ein Kontrollexperiment in einer eigenen Zelle führen Sie Schritte 1-3, aber gelten eine niedrige Konzentration (125 nM) des DNQX anstelle von γ-DGG.
   5. Analysieren Sie für offline-Analyse die letzte min jeder Droge-Anwendung.
4. Experiment 4: Stimulieren Sie afferenten Inputs um Aktionspotential abfeuern zu erhöhen.
   1. Rekord sEPSCs in normalen Ca^{2 +} ACFS.
   2. Stimulieren Sie die Afferenzen mit einer monopolaren Glaselektrode gefüllt mit ACFS mit einer Rate von 20 Hz für 2 s und wiederholen Sie 10-Mal mit einem Inter Platzen Intervall von 20 sec.
   3. Für die Analyse 5.000 ms vor dem ersten Impuls als Grundlage zu verwenden und im Vergleich zu den 10-300 ms nach der endgültigen Reiz und dann die durchschnittliche Veränderung der Amplitude und Frequenz über 10 Versuche.

5. Analyse

1. Analysieren Sie sEPSCs und mEPSCs mit einem Programm, die erkennt und analysiert synaptische Ströme (z. B. Mini-Analyse-Software).
   1. Mit dieser Software, verwenden Sie die empfohlene Erkennung Parameter zur Erkennung von AMPA-Rezeptor-EPSCs (oder GABA-Rezeptor-EPSCs bei hemmende Strömungen einer Aufnahme).
   2. Verwenden Sie die Nonstop Analysefunktion , um EPSCs in der Aufnahme zu erkennen.
   3. Manuell scannen jede Aufnahme um sicherzustellen, das Programm wird jedes Ereignis genau erkennen (z. B. sorgen Veranstaltungen werden nicht verpasst oder doppelt gezählt).
   4. Exportieren Sie die Ereignisdaten zu, indem Sie Sie in die Zwischenablage kopieren und fügen Sie ihn in ein Daten-Management-Software (z. B. Excel)
   5. Berechnen Sie die durchschnittliche Frequenz oder Amplitude für jede medikamentöse Behandlung und durchzuführen Sie relevanten statistische Analysen.

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Ergebnisse

Das obige Protokoll beschreibt eine Methode für die Verwendung von ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, um den Grad der synaptischen Vielfältigkeit, mit der Maus Hypothalamus Neuronen als Beispiel zu untersuchen. Diese Scheibe Präparationstechnik sollte gesunde vitaler Zellen ergeben, die nicht über eine geschwollene Membran oder Kern (Abbildung 1). Jeder Schritt im Protokoll ist wichtig für die Gesundheit des Gewebes und der Qualität der Aufnahmen.

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Diskussion

Eine wichtige Voraussetzung für eine erfolgreiche Patch Clamp Elektrophysiologie Experiment ist gesunde Scheiben/Zellen erhalten. Unsere beschriebenen Protokoll ist optimiert für Hypothalamus Scheiben, die PVN Neuronen enthalten. Anderen Gehirn benötigten Bereichen modifizierte Lösungen und slicing Methoden^21,22,23,24. Für die Aufnahme ist es wichtig, stabile Aufnahmen akzeptieren nur durc...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309659
10 blade	Fisher Scientific/others	35698
22 blade	VWR/others	21909-626
22 μM syringe filters	Milipore	09-719-000
Adson foreceps	Harvard Instruments	72-8547
Angled sharp scissors	Harvard Instruments	72-8437
Clampex	Molecular Devices	pClamp 10
Double edge blade	VWR	74-0002
Filter paper	Sigma/others	1001090
Fine paintbrush	Fisher/various	15-183-35/various
Gas Dispersion Tube	VWR	LG-8680-120
Isoflurane	Fresenius Kabi/others	M60303
Krazy glue	various	various
Mini analysis	Synaptosoft	MiniAnalysis 6
Osmomoter	Wescor Inc	Model 5600
Parafilm	Sigma	PM-996
Pasteur pipette	VWR	14672-200
ph meter	Mettler Toledo	FE20-ATC
Rubber bulb	VWR	82024-550
Scalpel handle No. 3	Harvard Instruments	72-8350
Scalpel handle No. 4	Harvard Instruments	72-8356
Single edge blade	VWR	55411-050
Vibratome slicer	Leica	VT1200S
Water Purification System	Millipore	Milli-Q Academic A10
Well plate lid	Fisher/various	07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP	Sigma	275875
BAPTA	molecular probes	B1204
CaCl2*2H2O	Sigma	C7902
CdCl2	sigma	202908
DNQX	Tocris	189
EGTA	Sigma	E3889
glucose	Sigma	G5767
HEPES	Sigma	H3375
K2-ATP	Sigma	A8937
KCl	Sigma	P9333
K-gluconate	Sigma	G4500
MgCl2*6H2O	Sigma	M2670
Molecular biology grade water	Sigma	W4502-1L
Na3GTP	Sigma	G8877
NaCl	Bioshop	SOD001.1
Na-gluconate	Sigma	S2054
NaH2PO4	Sigma	71504
NaHCO3	Sigma	S6014
Picrotoxin	sigma	P1675
SrCl	Sigma	255521
sucrose	Bioshop	SUC507.1
TTX	Alamone Labs	T-550
yDGG	Tocris	6729-55-1