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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Integrin Spannung spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Zellfunktionen. Mit einem integrativen Spannung Sensor ist Integrin Spannung mit Pikonewton (pN) Empfindlichkeit kalibriert und mit Submikron Auflösung abgebildet.

Zusammenfassung

Molekulare Spannung übertragen durch Integrin-Ligand-Bindungen ist das grundlegende mechanische Signal in der Integrin-Weg, der bedeutende Rollen in vielen Zellfunktionen und Verhaltensweisen spielt. Zur Kalibrierung und Bild Integrin Spannung mit hoher Kraft Sensibilität und räumliche Auflösung, haben wir einen integrative Spannung Sensor (ITS), ein DNA-basierte fluoreszierende Spannung Sensor entwickelt. Der ITS ist aktiviert, um fluoreszieren, wenn eine molekulare Spannung aufrechterhalten Fluoreszenzsignal auf molekularer Ebene dadurch Kraft umwandeln. Die Spannung Schwelle für ITS-Aktivierung ist einstellbar im Bereich von 10 – 60 pN, die den Dynamikbereich des Integrin-Spannung in den Zellen gut abdeckt. Auf einem Substrat mit einem ITS veredelt ist die Integrin-Spannung von adhärenten Zellen durch Fluoreszenz visualisiert und mit Submikron Auflösung abgebildet. Der ITS ist auch kompatibel mit Zelle strukturelle Bildgebung in lebenden Zellen und festen Zellen. Der ITS hat sich dem Studium der Thrombozyten Kontraktion und Zellwanderung erfolgreich angewendet. Dieses Papier beschreibt das Verfahren für die Synthese und Anwendung von IVS in der Erforschung der zellulären Kraft Integrin-übertragen.

Einleitung

Zellen setzen auf Integrine zu halten und zelluläre Kräfte zur extrazellulären Matrix auszuüben. Integrin-vermittelte Zelle Adhäsion und Kraft Übertragung sind entscheidend für die Zelle verbreiten,1,2, Migration3,4und überleben5,6,7. Auf lange Sicht beeinflusst das Integrin biomechanische Signalisierung auch Zelle Verbreitung8,9,10 und Differenzierung11,12. Forscher entwickelten verschiedene Methoden zur Messung und Karte Integrin übertragbare Mobilfunk Kräfte an der Zellmatrix Schnittstelle. Diese Methoden basieren auf elastischen Substrat13, Array von Micropost14, oder atomic force Microscopy (AFM)15,16. Elastische Substrat und Micropost Methoden beruhen auf der Verformung von Substraten zu berichten die zellulären Stress und haben Einschränkungen in Bezug auf räumliche Auflösung und Empfindlichkeit zu erzwingen. AFM hat hohe Kraftempfindlichkeit, aber es nicht Kraft an mehreren Stellen gleichzeitig erkennen, erschwert das zelluläre Kraft Karte durch Integrine übertragen.

In den letzten Jahren wurden verschiedene Techniken entwickelt, um zelluläre Kraft auf molekularer Ebene zu untersuchen. Eine Sammlung von molekularen Spannung Sensoren basierend auf Polyethylenglykol17,18, Spinne Seide Peptid19und DNA-20,21,22,23 wurden entwickelt, um visualisieren Sie und überwachen Sie Spannung durch molekulare Proteine übertragen. Unter diesen Techniken wurde DNA zuerst angenommen, da die Synthese Material in der Spannung messen Tether (TGT), ein rupturable Linker, der die Obergrenze der Integrin Spannungen in lebenden Zellen22,24moduliert. Später, DNA und Fluoreszenz-Resonanz-Transfertechnik wurden kombiniert, um Haarnadel fluoreszierende Spannung DNA-basierte Sensoren erstellen zuerst nach Chens Gruppe23 und Salaitas Gruppe20. Die Haarnadel DNA-basierte Spannung Sensor berichtet Integrin Spannung in Echtzeit und dem Studium einer Reihe von zellulären Funktionen21erfolgreich angewendet wurde. Danach kombiniert Wangs Lab ein TGT mit dem Fluorophor-Quencher paar Bericht Integrin Spannung. Dieser Sensor ist ein ITS25,26benannt. Der ITS basiert auf doppelsträngige DNA (DsDNA) und hat einen breiteren Dynamikbereich (10-60 pN) für Integrin Spannung Kalibrierung. Im Gegensatz zur Haarnadel DNA-basierte Sensoren ITS meldet keine zelluläre Kraft in Echtzeit sondern zeichnet alle historischen Integrin-Ereignisse wie der Fußabdruck von zellulären Kraft; Dieses Signal Akkumulationsprozess verbessert die Empfindlichkeit für zelluläre Kraft imaging, so dass es möglich ist Bild zellulären Kraft sogar mit einem Low-End Fluoreszenzmikroskop. Die Synthese von IVS ist relativ bequemer, wie es durch Hybridisierung zwei einzelsträngigen DNA (SsDNA) erstellt wird.

Der ITS ist ein 18-Basis gepaart DsDNA konjugiert mit Biotin, ein Fluorophor, einen Quencher (Schwarzloch Quencher 2 [BHQ2])27und eine zyklische Arginylglycylaspartic Säure (RGD) Peptid28 als ein Integrin-Peptid-Liganden (Abbildung 1). Der untere Strang ist mit dem Fluorophor konjugiert (Cy3 in dieser Handschrift, während andere Farbstoffe wie Cy5 oder Alexa-Serie verwendet wird, sind auch möglich in unserem Labor nachgewiesen worden) und das Biotin-Tag, mit denen der ITS wird auf einem Substrat von Biotin-Avidin Bond immobilisiert. Der obere Strang ist konjugiert mit RGD-Peptid und das Schwarzloch Quencher, die Cy3 mit ca. 98 % abschrecken Effizienz26,27stillt. Mit dem Protokoll in diesem Papier präsentiert ist die Beschichtung Dichte des ITS auf einem Substrat um 1.100/µm2. Dies ist die Dichte, die wir zuvor für 18 bp biotinylierte DsDNA auf dem NeutrAvidin funktionalisiert Substrat durch Anschluss an das gleiche Protokoll29Beschichtung beschichtet kalibriert. Wenn Zellen auf das Substrat beschichtet mit dem ITS anhaften, Integrin bindet den ITS durch RGD und überträgt Spannungen an den ITS. Der ITS hat eine bestimmte Spannung Toleranz (TTol) definiert als die Spannung Schwelle, die mechanisch die DsDNA des ITS innerhalb von 2 s22trennt. DER Bruch durch Integrin Spannung führt zur Trennung von der Quencher aus der Farbstoff, der anschließend Fluoreszenz emittiert. Infolgedessen die unsichtbare Integrin-Spannung ist ein Fluoreszenzsignal umgewandelt und die zelluläre Kraft durch Fluoreszenz-Bildgebung abgebildet werden kann.

Um die Anwendung des ITS zu demonstrieren, verwenden wir Fisch auch hier, eine weit verbreitete Zellmodell für Zelle Migration Studie30,31,32CHO-K1-Zelle, eine häufig verwendete nonmotile Zelllinie und NIH-3 t 3-Fibroblasten. Coimaging Integrin Spannung und Zelle Strukturen wird auch durchgeführt.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee (IACUC, 8-16-8333-I) der Iowa State University genehmigt.

1. Synthese von der integrativen Spannung sensor

  1. Anpassen und SsDNAs (siehe die Tabelle der Materialien) zu bestellen.
    Hinweis: Die SsDNA-Sequenzen sind wie folgt. Die oberen Strang ist /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. Die unteren Stränge sind wie folgt.
    12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio//5Cy3 /
    23 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT//5Cy3/CCC
    33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
    43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
    54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
    Hier, /5ThioMC6-D / steht für ein Thiol-Modifizierer C6 S-S (Disulfid) am 5'-Ende. /3BHQ_2/ stellt ein Schwarzloch Quencher 2 am 3'-Ende. / 3Bio / / 5Biosg/und /iBiodT/ liegen Biotinylierungen Ende 3', 5'-Ende, und auf die Thymin der interne DNS. /iCy3/ stellt eine Cy3 in das interne Rückgrat der SsDNA eingefügt. Diese Codes werden von den bestimmten kommerziellen Lieferanten verwendet hier verwendet und können in anderen DNA-Unternehmen unterschiedlich sein.
  2. Konjugat RGD Peptid zu SH-SsDNA-Durstlöscher.
    Hinweis: Die verwendeten Reagenzien sind Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC), RGD Peptid und Tris - Sulfosuccinimidyl (2-Carboxyethyl) Phosphin Hydrochlorid, auch bekannt als DÄMMUND-HCl.
    1. Deprotect des Thiol-Modifikators auf der oberen Strang DNA mit DÄMMUND Lösung.
      Hinweis: Thiol-modifizierte DNAs bestellt aus kommerziellen Quellen sind im Lieferumfang in oxidierter Form, die Schwefel-Atome, geschützt durch ein Disulfid-Band, die vor der RGD-DNA Konjugation reduziert werden muss. DÄMMUND ist ein geruchloses Reduktion Reagenz für die Thiol-Deprotection verwendet.
      1. 14,3 mg DÄMMUND-HCl in 300 µL Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert der DÄMMUND Lösung für ~7.2–7.4 mit 1 M NaOH-Lösung (ca. 150 µL), mit pH Testpapiere. Fügen Sie reines Wasser zu einem Endvolumen von 0,5 mL. Die Endkonzentration DÄMMUND beträgt 100 mM.
        Hinweis: Es wird empfohlen, DÄMMUND Lösung für DNA-Thiol Deprotection jedesmal frisch zu machen. Vermeiden Sie Strumpf DÄMMUND Lösung für eine lange Zeit.
      2. Die DÄMMUND Lösung 100 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Säurelösung und 400 µL Wasser hinzufügen.
      3. 20 µL 1 mM Thiol-DNA-BHQ2 in PBS 10 µL der DÄMMUND + EDTA-Lösung hinzufügen. Lassen Sie die Lösung für 30 min bei Raumtemperatur zu reagieren.
        Hinweis: Die Disulfid-Anleihe von 5' Thiol-Modifizierer C6 S-S Konjugation bei diesem SsDNA wird durch DÄMMUND, verlassen die Thiol-Gruppe in den nächsten Schritten bereit für Reaktion mit Maleimide abgespalten. Die DÄMMUND beeinträchtigt nicht die folgenden Thiol-Maleimide-Reaktion; so ist es nicht notwendig, DÄMMUND nach diesem Schritt passiviert.
    2. Konjugieren Sie RGD-NH2 mit Sulfo-SMCC.
      1. Lösen Sie 5 mg RGD-NH2 in 100 µL PBS, 11 mM RGD-NH2zu erhalten.
      2. Fügen Sie 200 µL des reinen Wassers in das Röhrchen mit 2 mg Sulfo-SMCC (abgemessene durch den Lieferanten). Smash die Sulfo-SMCC fest mit einer Pipettenspitze und kräftig pipette zur gleichen Zeit zu erleichtern, die SMCC im Wasser auflösen. Die Konzentration von Sulfo-SMCC werden 23 mM.
        Hinweis: Da die NHS-Ester in Sulfo-SMCC unterliegt der Hydrolyse und eine Lebensdauer von ein paar Minuten hat, sollte dieser auflösenden Schritt innerhalb von 1 min. zur Vermeidung übermäßigen Verlust von der NHS-Ester durch Hydrolyse ausgeführt werden. Verwenden Sie reines Wasser Sulfo-SMCC aufzulösen, da seine Löslichkeit in PBS oder anderen Puffer schlecht ist.
      3. Die 100 µL RGD-NH2 Lösung 40 µL Sulfo-SMCC-Lösung hinzufügen und 20 min inkubieren.
        Hinweis: Die NHS-Ester in Sulfo-SMCC der Amingruppe RGD-NH2, bilden eine Amid-Bindung, die Links RGD und Sulfo-SMCC reagiert mit.
    3. Konjugieren Sie RGD-SMCC mit der SH-SsDNA-Quencher.
      1. Mischen Sie die Lösungen, die in den Schritten 1.2.1 und 1.2.2 vorbereitet und inkubieren Sie die Mischung für 1 h bei Raumtemperatur. Verschieben Sie die Lösung auf einen Kühlschrank bei 4 ° C und lassen Sie es über Nacht weiter reagieren. Die Thiol konjugiert auf der oberen Strang DNA wird mit Maleimide auf Sulfo-SMCC, Bildung einer Thioether Gruppe, die mit den oberen Strang DNA RGD links reagieren.
    4. Führen Sie Ethanol Niederschlag RGD SsDNA Durstlöscher aus nicht umgesetztes Sulfo-SMCC, RGD und DÄMMUND zu reinigen.
      1. Kühlen Sie 10 mL 100 % Ethanol in einem 15 mL konische Rohr in einem Gefrierschrank-20 ° C für mindestens 30 min.
      2. Mischen Sie eine 3 M NaCl-Lösung, DNA-Lösung und gekühlte Ethanol ein Volumenverhältnis von 01:10:25. Halten Sie die gemischte Flüssigkeit in einem Gefrierschrank-20 ° C für 30 Minuten oder bis die DNA ausgefällt wird.
      3. Zentrifuge die Flüssigkeit bei 10.000 X g für 30 min. verwerfen den überstand.
      4. Das DNA-Pellet PBS hinzufügen. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektrometer.
    5. (Optional) Führen Sie DNA Elektrophorese um eine höhere RGD-SsDNA Reinheit zu erlangen.
      Hinweis: Mit dem oben genannten Protokoll wird etwa 70 – 90 % der der SsDNA mit RGD konjugiert werden. Wenn höherer Reinheit gewünscht wird, kann auch DNA Elektrophorese durchgeführt werden, um konjugierte DNA von unconjugated DNA zu trennen.
      1. Montieren Sie eine vertikale Elektrophorese-System.
      2. Bereiten Sie eine 10 % Polyacrylamid-Gel-Lösung durch das Mischen von 50 mL reines Wasser, 20 mL 40 % Acrylamid Gel, 8 mL 10 x Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer und 800 µL 10 % Ammonium Bleichen (APS).
      3. Die Gel-Lösung 80 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) hinzufügen. Gießen Sie die Lösung in der Glas-Kammer der Elektrophorese-System. Legen Sie einen Single-Well Kamm um einen Brunnen auf dem Gel zu erstellen. 10 min. warten Sie, bis das Gel vernetzt ist.
      4. Mischen Sie die DNA-Lösung mit 100 % Glyzerin in einem Volumenverhältnis von 1:1. Entfernen Sie den Kamm und laden Sie die DNA-Lösung für das Gel gut.
      5. Führen Sie das Gel mit einer Spannung von 200 V. beobachten zwei DNA-Bänder in denen die Verzögerung einer konjugierten DNA ist.
      6. Die Gel-Band mit der konjugierten DNA abgeschnitten und in kleine Stücke würfeln.
      7. Sammeln Sie die gewürfelte Gel in zwei 1,5 mL Zentrifuge Röhren mit Filtern. Jedes Rohr 500 µL PBS hinzufügen.
      8. Setzen Sie die PBS-getränkten Gel an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur für 1 Tag. DNA wird aus dem Gel in die PBS diffundieren.
      9. Sammeln Sie die DNA-Lösung durch die Rohre bei 1.000 X g für 2 min zentrifugieren.
      10. Führen Sie eine weitere Runde von Ethanol Niederschlag (Schritt 1.2.4), die DNA zu sammeln.
  3. Den ITS durch Hybridisierung RGD SsDNA Quencher und Farbstoff-SsDNA-Biotin zu synthetisieren.
    1. Die Lösungen von den oberen Strang und der untere Strang DNA in einem molaren Verhältnis von 1.1:1 zu mischen. Halten Sie die Mischung bei 4 ° C über Nacht zu den ITS durch DNA-Hybridisierung zu produzieren.
      Hinweis: Einem Molverhältnis von 1.1:1 für die DNA-Hybridisierung wird anstelle von 1:1 verwendet. Übermäßige RGD-SsDNA-Löscher wird verwendet, um sicherzustellen, dass alle Farbstoff-SsDNA-Biotin mit RGD SsDNA Quencher hybridisieren wird. RGD-SsDNA-Durstlöscher ohne Hybridisierung wird während der Oberflächenbeschichtung, abgewaschen werden die ITS Oberflächenbeschichtung Qualität nicht beeinträchtigt wird.
    2. Aliquoten und laden die ITS-Lösung bei-20 ° C für langfristige Lagerung.
      Hinweis: Der Speicher-Puffer ist PBS und die Speicher-Konzentration sollte in der Regel über 10 µM. Für den regelmäßigen Gebrauch kann seine Lösung für ein paar Wochen ohne merkliche Verschlechterung bei 4 ° C aufbewahrt werden.

2. Vorbereitung der Oberflächen durch Immobilisierung des ITS auf Glasboden-Petrischalen

Hinweis: Die verwendeten Reagenzien sind biotinylierte Rinderserumalbumin (BSA-Biotin), Protein Avidin und ITS. Alle Reagenzien und PBS-Puffer auf ca. 0 ° C mit einem Eiskübel auf Eis abkühlen.

  1. 200 µL von 0,1 mg/mL BSA-Biotin mit PBS-Puffer auf dem Brunnen ein Glasboden-Petrischale (29 mm Durchmesser, mit einem 14 mm auch) zu laden. Bei 4 ° C im Kühlschrank 30 min inkubieren. BSA-Biotin ist physisch auf der Glasoberfläche adsorbiert.
  2. Saugen Sie die Lösung aus dem gut mit einer Pipette und fügen Sie 200 µL PBS zurück zum Brunnen, um die Oberfläche zu waschen. Wiederholen Sie diese 3 X um die Wäsche zu vervollständigen.
  3. Inkubieren Sie 200 µL 50 µg/mL Avidin Protein in den Brunnen für 30 min bei 4 ° c Waschen Sie ihn 3 X mit PBS. Nach diesem Schritt das Protein Avidin bindet an die BSA-Biotin und wird auf der Glasoberfläche immobilisiert.
  4. Inkubieren Sie 200 µL von 0,1 µM ITS in den Brunnen für 30 min bei 4 ° c Waschen Sie die Schüssel mit 3 X mit PBS. Lassen Sie PBS in den Brunnen, bis die Zelle-Beschichtung. Nach diesem Schritt der ITS mit dem Tag Biotin bindet an das Protein Avidin und wird auf der Oberfläche immobilisiert.
    Hinweis: Eine Vorsichtsmaßnahme für seine Beschichtungsqualität und Homogenität in der ITS-Immobilisierung von entscheidender Bedeutung ist, nie die Petrischale Oberfläche austrocknen lassen. Alle Reagenzien und PBS auf 4 ° C oder auf Eis mit einem Eiskübel hilft, die Wasser-Verdunstung während der Waschschritte zu reduzieren um 0 ° C zu halten, wird als PBS aus dem Brunnen abgesaugt.

3. Zelle Beschichtung auf den Oberflächen

  1. Kultur Fisch Keratozyten.
    Hinweis: Hier, Goldfisch (Carassius Auratus) dient als Beispiel, aber andere Fischarten können auch funktionieren.
    1. Zupfen Sie ein Stück von Fischschuppen als ein Fisch mit einer flachen Spitze Pinzette. Drücken Sie vorsichtig die Skala auf dem Brunnen ein Glasboden-Petrischale mit der inneren Seite der Skala, die Kontaktaufnahme mit dem Glas. Warten Sie ca. 30 s für die Fischschuppen die Glasoberfläche des Tellers einzuhalten.
    2. Fügen Sie 1 mL der Iscove Dulbecco Medium (IMDM) komplette Medium um die Fischschuppen in vollem Umfang abdecken geändert. Die Petrischale in einer dunklen und feuchten Box für 6-48 h bei Zimmertemperatur aufbewahren.
      Hinweis: IMDM komplette Medium enthält 79 % IMDM + 20 % fetalen bovine Serum (FBS) + 1 % Penicillin. Keine zusätzliche Versorgung mit Sauerstoff oder CO2 ist erforderlich. Ein paar Tissue-Papier-Rollen, die mit Wasser getränkt können im Feld weiterhin hohen Luftfeuchtigkeit in der Box bleiben. Fisch Keratozyten werden nach ein paar Stunden aus der Fisch-Skala als einem Blatt von Zellen migrieren. Dies kann mit einer Gewebekultur Mikroskop beobachtet werden. Die Zellen sind in der Regel lebensfähig in 48 h.
  2. Lösen und die Platte der Keratozyten Zellen auf ITS Oberflächen.
    1. Entfernen Sie das Medium aus der Petrischale, in denen die Fischschuppen kultiviert wurde. Waschen Sie gut 1 X mit Zelle trennen Lösung, und fügen Sie trennen Lösung zur Deckung der Fischschuppen und 3 min inkubieren.
      Hinweis: Das Rezept für die Zelle trennen EDTA Lösung lautet wie folgt: 10 x Hanks' Balanced Salz Lösung (HBSS) + 10 mL 1 M HEPES (pH 7.6) 100 mL + 10 mL von 7,5 % Natriumbicarbonat + 2,4 mL 500 mM EDTA + 1 L H2O. Der pH-Wert wird auf 7,4 eingestellt.
    2. Saugen Sie alle Zelle Lösung trennen und fügen Sie IMDM komplette Medium. Verteilen Sie die Keratozyten durch sanfte pipettieren. Passen Sie die Zelldichte Lösung auf das gewünschte Niveau (1 x 104– 1 x 105/mL). Platte die Zellen auf der ITS-Oberfläche (zubereitet nach Abschnitt 2). Inkubation der Zellen bei Raumtemperatur für 30 min vor Bildgebung.
      Hinweis: Zellzählung kann mit einem Hemocytometer erfolgen nach Abnehmen der Zellen mit Lösung abnehmen. Die Zelle Dichte Beschichtung ist relativ gering, so dass die Keratozyten viel Fläche haben zu migrieren.
  3. Platte CHO-K1 und NIH-3 t 3-Zellen auf den Oberflächen.
    Hinweis: Das Medium für CHO-K1 Zellen ist 89 % Ham F12 + 10 % FBS + 1 % Penicillin. Das Medium für NIH-3 t 3-Zellen ist 89 % Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) + 10 % Kalb Rinderserum (CBS) + 1 % Penicillin. Die Kulturbedingungen sind 37 ° C und 5 % CO2.
    1. Kultur CHO-K1 oder NIH-3 t 3-Zellen zu 80 – 100 % Einmündung in eine Petrischale (oder Kultur-Kolben).
    2. Die Zelle trennen Lösung und Kulturmedium auf 37 ° c warm
    3. Entfernen Sie alle Kulturmedium in der Petrischale mit einer Pipette. Waschen Sie die Zellen 1 X mit Zelle trennen Lösung. Decken Sie die Zellen mit Lösung abnehmen und bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
    4. Pipettieren, um die Zellen zu verteilen. Die Zelle-Lösung zu sammeln und bei 300 X g für 3 min zentrifugieren.
    5. Saugen Sie des Überstands aus und fügen Sie kompletten Medium oder serumfreien Medium hinzu.
    6. Passen Sie die Zelldichte Lösung auf das gewünschte Niveau (1 x 105 – 1 x 106/mL). Platte die Zellen auf der ITS-Oberflächen (zubereitet nach Abschnitt 2). Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 1 – 2 h vor dem bildgebenden oder 30 min vor der video-Aufzeichnung.

4. Bildgebung, video-Aufnahme und Echtzeit-Integrin Spannung Mapping

  1. Echtzeit-Bildgebung der Integrin-Spannung in lebenden Zellen
    1. Keratozyten auf den Oberflächen (zubereitet nach Abschnitt 2) für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren oder CHO-K1 oder NIH-3 t 3-Zellen für 1 h auf den Oberflächen in einem Inkubator bei 37 ° c inkubieren
    2. Montieren Sie die Petrischale auf einer Fluoreszenz-Mikroskop-Bühne. Durchführen von zellulären Kraft Bildgebung mit einer Belichtungszeit von 1 s. Die Vergrößerung ist 40 X oder 100 X.
    3. Nehmen Sie eine Video von seiner Bilder mit einem Frame-Intervall von 20 s für Keratozyten oder 1 – 2 min. für CHO-K1 oder NIH-3 t 3-Zellen.
    4. Verwenden Sie MATLAB oder ein anderes Bild-Analyse-Tool um zu einen vorherigen Frame des ITS Videos aus einem aktuellen Frame der ITS Signal neu produzierte im aktuellen Frame Intervall berechnen zu subtrahieren. Die neuproduzierten ITS-Signal stellt die Integrin-Spannung erzeugt im aktuellen Frame Intervall, damit die zelluläre Kraft in gewissem Sinne Echtzeit Berichterstattung.
  2. Coimaging der Integrin-Spannung und Zellstruktur in Immunostained Zellen
    1. Führen Sie nach 3.2.2 oder Schritt 3.3.6 Immunostaining anlässlich der strukturellen Zielproteine.
      Hinweis: Verwenden Sie verschiedene Farbstoffe, um die Fluoreszenz-Übersprechen zwischen Integrin Spannung Bildgebung und Zelle strukturelle Bildgebung zu vermeiden. In diesem Manuskript wurde Cy5 Fluorophor für Phalloidin und Alexa 488 für Vinkulin Färbung verwendet wurde. Die Konzentration von primären und sekundären Antikörper ist 2,5 µg/mL. Die Konzentration für Phalloidin beträgt 1,5 Einheiten/µL.
    2. Führen Sie multifluorescent Kanal imaging ein Integrin Spannung Karte und Zelle strukturelle Bildgebung zu erwerben.

Ergebnisse

Mit dem ITS wurde die Integrin-Spannung-Karte von Fisch Keratozyten gefangen genommen. Es zeigt, dass eine auch migriert und Integrin Spannung an Kraft zweigleisig (Abbildung 2A erzeugt). Die Auflösung der Karte Kraft war so kalibriert, dass 0,4 µm (Abb. 2 b) werden. Hohen Integrin Spannung konzentriert sich am hinteren Rand (Abb. 3A). Der ITS zeigt auch unterschiedliche spezifische Muster der vers...

Diskussion

Der ITS ist eine hochverfügbare, aber dennoch leistungsfähige Technik für zellulares zwingen Zuordnung im Hinblick auf die Synthese und Anwendung. Mit allen Materialien bereit kann der ITS innerhalb 1 Tages synthetisiert werden. Während der Experimente sind nur drei Schritte der Oberflächenbeschichtung vor der Zelle Beschichtung erforderlich. Vor kurzem haben wir weiter vereinfacht Coating-Verfahren für einen Schritt durch direkte Verknüpfung des ITS zu Rinderserumalbumin, ermöglicht direkte physikalische Adsorpt...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Gründerfonds zur Verfügung gestellt von der Iowa State University und durch das National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
BSA-biotinSigma-AldrichA8549
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
StreptavidinThermo Fisher Scientific434301
upper strand DNAIntegrated DNA TechnologiesN/ACustomer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNAIntegrated DNA TechnologiesN/ACustomer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCCThermo Fisher ScientificA39268
Cyclic peptide RGD with an amine groupPeptides InternationalPCI-3696-PI
IMDMATCC‎62996227
FBSATCC302020
Penicillingibco15140122
TCEPSigma-AldrichC4706
200 uL petri dishCellvisD29-14-1.5-N
NanoDrop 2000Thermo ScientificN/Aspectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis UnitHoeferSE410-15-1.5Device for electroporesis
CHO-K1 cell lineATCCCCL-61
NIH/3T3 cell lineATCCCRL-1658
Anti-Vinculin AntibodyEMD Millipore90227Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA28175Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogenA22287
Eclipse TiNikonN/Amicroscope

Referenzen

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