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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir legen ein Protokoll vor, um die mRNA-Übersetzungsverordnung in poxvirus-infizierten Zellen zu untersuchen, die in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter Assay verwendet werden. Der Test kann für das Studium der Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente einer mRNA verwendet werden, einschließlich 5 '-unübersetzter Region (UTR) und 3 '-UTR. Mit dieser Methode können auch verschiedene Übersetzungsinitiationsmodi untersucht werden.

Zusammenfassung

Jedes Poxvirus mRNA, das nach der viralen DNA-Replikation transkribiert wurde, hat einen evolutionär konservierten, nicht temperierten 5 '-poly (A)-Anführer im 5 '-UTR. Um die Rolle des 5 '-Poly (A)-Anführers in der mRNA-Übersetzung während der Poxvirus-Infektion zu zerlegen, haben wir einen in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Test entwickelt. Dieser Reporter-Test besteht aus vier Kernschritten: (1) PCR zur Verstärkung der DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription; (2) In-vitro-Transkription zur Erzeugung von mRNA mit T7-RNA Polymerase; (3) Transfection zur Einführung in vitro transkribierte mRNA in Zellen; (4) Erkennung der Luciferase-Aktivität als Indikator für die Übersetzung. Der hier beschriebene RNA-basierte Luciferase-Reporter-Test umgeht Probleme der Plasmid-Replikation in poxvirusinfizierten Zellen und kryptischer Transkription aus dem Plasmid. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente in einer mRNA zu bestimmen, einschließlich 5 '-UTR und 3 '-UTR in anderen Systemen als poxvirus-infizierten Zellen. Darüber hinaus können mit dieser Methode verschiedene Arten der Übersetzungsinitiation wie kappenabhängig, kappenunabhängig, Wiederinitiation und interne Initiation untersucht werden.

Einleitung

Nach dem zentralen Dogma fließt genetische Information von der DNA zur RNAund schließlich zudem Protein 1,2. Dieser Fluss von genetischen Informationen ist auf vielen Ebenen stark reguliert, einschließlich der mRNA-Übersetzung3,4. Die Entwicklung von Reporteranalysen zur Messung der Regulierung der Genexpression wird das Verständnis der in diesem Prozess involvierten Regulierungsmechanismen erleichtern. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der mRNA-Übersetzung mit einem in vitro transkribierten RNA-basierten Luciferase-Reporter-Test in poxvirus-infizierten Zellen.

Poxviren umfassen viele hochgefährliche menschliche und tierische Krankheitserreger 5. Wie alle anderen Viren setzen Poxviren bei der Proteinsynthese6,7,8ausschließlich auf Wirtszell-Maschinen. Um virale Proteine effizient zu synthetisieren, entwickelten Viren viele Strategien, um zelluläre Übersetzungsmaschinen zu entführen, um sie für die Übersetzung von viralen mRNAs7,8umzuleiten. Ein häufig von Viren verwendeteter Mechanismus ist es, cis-wirkende Elemente in ihren Transkripten zu verwenden. Bemerkenswerte Beispiele sind die interne Ribosome Entry Site (IRES) und cap-independent translation enhancer (CITE)9,10,11. Diese cis-Elementemachen die viralen Transkripte zu einem translationalen Vorteil, indem sie translationale Maschinenüberverschiedene Mechanismen 12, 13,14anziehen. Mehr als 100 poxvirus mRNAs haben ein evolutionär konserviertes cis-wirkendes Element in der 5 '-unübersetzten Region (5 '-UTR): Ein 5 '-Poly (A) Führer (A) an den ganz 5 ' Enden dieser mRNAs15,16. Die Längen dieser 5 '-poly (A)-Führer sind heterogen und werden durch das Verrutschen der poxviruskodierten RNA-Polymerase während der Transkription17,18erzeugt. Wir und andere haben vor kurzem herausgefunden, dass der 5 '-poly (A)-Führer einem mRNA in Zellen, die mit dem Impfinien-Virus (VACV) infiziert sind, einen Übersetzungsvorteil verleiht, demprototypischen Mitglied von Poxviren 19,20.

Der in vitro transkribierte RNA-basierte Luciferase-Reporter-Test wurde ursprünglich entwickelt,umdie Rolle des 5 '-poly (A)-Anführers in der mRNA-Übersetzung währendder Poxvirus-Infektion 19,21zuverstehen. Obwohl Plasmid-DNA-basierte Lluciferase-Reporter-Assays weit verbreitet sind, gibt es mehrere Nachteile, die die Ergebnisinterpretation in poxvirus-infizierten Zellen erschweren. Zunächst können Plasmide in VACV-infizierten Zellen 22 vermehren. Zweitens kommt die kryptische Transkription häufig von Plasmid-DNA18,23, 24. Drittens erzeugt VACV-Promoter-getriebene Transkription Poly (A)-Führer heterogener Längen, was es schwierig macht, die Poly-(A)-Anleiterlänge in einigen Experimenten 18 zu kontrollieren. Ein in vitro transkribierter RNA-basierter Luciferase-Reporter-Test umgeht diese Probleme und die Dateninterpretation ist einfach.

Es gibt vier Schlüsselschritte in dieser Methode: (1) Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um die DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription zu erzeugen; (2) In-vitro-Transkription zur Erzeugung mRNA; (3) Transfektion zur Lieferung mRNA in Zellen; Und (4) Erkennung der Luciferase-Aktivität als Indikator für die Übersetzung (Abbildung1). Das daraus resultierende PCR-Amplizium enthält folgende Elemente in 5 ' bis 3 ' Richtung: T7-Promoter, Poly (A) Leader oder gewünschte 5 '-UTR-Sequenz, firefly luciferase open reading frame (ORF), gefolgt von einem Poly (A) Schwanz. PCR-Ampliver wird als Vorlage verwendet, um mRNA durch In-vitro-Transkription mit T7-Polymerase zu synthetisieren. Bei der In-vitro-Transkriptionwird m 7 G-Kappe oder andere Kappenanaloge in neu synthetisierte mRNA integriert. Die gekappten Transkripte werden in nicht infizierte oder VACV-infizierte Zellen transferiert. Das Zelllysat wird zum gewünschten Zeitpunkt nach der Transfektion gesammelt, um die Aktivitäten der Luciferase zu messen, die auf die Proteinproduktion aus der transfektiven mRNA hinweisen. Dieser Reporter-Test kann verwendet werden, um die Übersetzungsregulierung durch cis-element zu untersuchen, das in 5 '-UTR, 3 '-UTR oder anderen Regionen einer mRNA vorhanden ist. Darüber hinaus kann der in vitro transkribierte RNA-basierte Test verwendet werden, um verschiedene Mechanismen der Übersetzungsinitiation zu untersuchen, einschließlich kap-abhängiger Initiation, kap-unabhängiger Initiation, Wiederinitiation und interner Initiation wie IRES.

Protokoll

1. Vorbereitung der DNA-Vorlage durch PCR für In-Vitro-Transkription

  1. Zur Vorbereitung der DNA-Vorlage durch PCR, Design-Primer. Bei der Konstruktion von Primern beachten Sie entscheidende Eigenschaften wie Primerlänge, Glühtemperatur (Tm), GC-Gehalt, 3 ' Ende mit G oder C etc.
    NOTE: In dieser Literatur 25,26,27ausführlich diskutiert.
  2. Design-Primer zur Generierung von PCR-Amplizium, das die folgenden Elemente in 5 ' bis 3 ' Richtung enthält: T7-Promoter, Poly (A) Anführer, firefly luciferase ORF und ein Poly (A) Schwanz, der im Folgenden als T7_12A-Fluc bezeichnet wird. Design-Primer (Forward and Reverse), um alle zusätzlichen Elemente, die nicht in der Vorlage DNA vorhanden sind (Abbildung 2A).
    NOTE: Die Reihenfolge aller Elemente finden Sie in Tabelle 1.
  3. Fügen Sie mehrere zusätzliche Nukleotide in vordere Grundierung (5 '-3') 28, gefolgt von T7-Promoter, Poly (A) Leader oder gewünschte 5 '-UTR-Sequenz und etwa 20 Nukleotide, passen Sie auf Tm, entsprechend dem 5 ' Ende des Reporter-Gens ' s Orf. Stellen Sie sicher, dass die entsprechende Region in der Grundierung identisch ist mit dem Sinnesstrang (+ Strang) des Gens.
    NOTE: Synthies für lange 5 '-UTR, synthetisieren Sie zwei DNA-Fragmente: Eines mit T7-Promoter, gefolgt von langen 5 '-UTR und das zweite mit dem ORF des Reporter-Gens. Schließen Sie sich diesen beiden Fragmenten mit der Überlappung der PCR29an.
  4. Design Reverse-Primer (5 '-3 '), um Poly (A) Schwanz und etwa 20 Nukleotide, Anpassung auf Tm, die dem 3 ' Ende des Reporter-Gens ORF entspricht. Stellen Sie sicher, dass die entsprechende Region in der Grundierung identisch ist mit dem Anti-Sinse-Strang (-Strang) des Gens und ein In-Frame-Stop-Codon vor dem Poly (A) Schwanz vorhanden ist.
    NOTE: Die gewünschte Länge von A es in einem Poly (A) Leader oder Poly (A) Schwanz kann in den Primern angepasst werden. Zum Beispiel, um 50 A es in den Poly-Schwanz (A) hinzuzufügen, sollte die umgekehrte Grundierung 50 T es enthalten. In ähnlicher Weise, um 20 A es in der Poly (A) Führer hinzuzufügen, sollte der Vorwärts-Primer 20 A es enthalten.
  5. Für die interne Steuerung, entwerfen Sie eine weitere Reihe von Primern, die die folgenden Elemente in 5 ' bis 3 ' Richtung enthalten: T7 Promoter, eine zufällige 5 '-UTR-Codierungssequenz, die Kozak-Sequenz, Renilla luciferase ORF und Poly (A) Schwanz im Folgenden als T7_ bezeichnet wird. Kozak-Rluc.
  6. Fügen Sie in einem PCR-Rohr die Reagenzien in folgender Reihenfolge hinzu: DNasfreies Wasser, 2x hochtrabende DNelität-DNA-Polymerase, Primer und sequenzbestätigte Luciferase-Vorlage DNA (Tabelle 2).
    NOTE: Die Anzahl der einzelnen Komponenten im Gemisch sollte je nach Reaktionsvolumen angepasst werden.
  7. Verwenden Sie einen Standard-3-stufigen PCR-Zyklus (Denaturation, Annealing, Extension), um eine DNA-Vorlage zu erzeugen, wie in Tabelle 3gezeigt.
    NOTE: Die Glühtemperatur X ° C hängt von der verwendeten Grundierung ab, und die Verlängerungszeit T min hängt von der PCR-Amplizium-Größe und der verwendeten DNA-Polymerase ab.
  8. Erkennen Sie das PCR-Produkt, indem Sie 5-10% der PCR-Reaktion in 1% agarose Tris-Acetate-EDTA (TAE) Gel-Elektrophorese (mit 0,1 μg/ml-Ethidium Bromid) zusammen mit handelsüblichen molekularen Gewichtsstandard ausführen. Visualisieren Sie das Gel unter einem UV-Beleuchter, um die Größe des PCR-Produktes zu bestimmen.
  9. Nach der Bestimmung der korrekten Größe des PCR-Produktes, ~ 1.7 kb für T7_12A-Fluc und ~ 1.0 kb für T7_Kozak-Rluc, reinigen Sie es mit einem handelsüblichen PCR-Reinigungssatz. Die DNA mit 100 μL Nuklease-freiem Wasser auslöschen (Abbildung 2B).
  10. Sobald die DNA gereinigt ist, überprüfen Sie die Konzentration der DNA mit einem Spektrophotometer und bestimmen Sie das A260/A280 Verhältnis (~ 1,8-2.0 ist akzeptabel).
  11. Die gereinigte DNA bei-20 ° C speichern oder für die In-vitro-Transkription sofort verwenden.

2. Erzeugen mRNA von In Vitro Transkription

  1. Synthesize-RNA aus dem PCR-Produkt in vitro, mit einem In-vitro-Transkriptsatz (Abbildung 3A).
    Hinweis:     T7_12A-Fluc und T7_Kozak-Rluc werden verwendet, um 12A-Fluc bzw. Kozak-Rluc mRNAs zu synthetisieren.
    1. Dazu nehmen Sie ein Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge hinzu: DNase-RNase freies Wasser, NTP Buffer Mix, Cap Analog, Template PCR Product, T7-RNA Polymerase Mix (Tabelle 4).
      NOTE: Andere Deckelsysteme können auch verwendet werden, um RNA nach der In-vitro-Transkription nach der Anleitung des Herstellers sequenziell zu kappen.
    2. Gut mischen und bei 37 ° C für 2 Stunden inkubieren.
    3. Gehen Sie zur Reinigung der synthetisierten RNA mit einem RNA-Reinigungssatz.
  2. Führen Sie gereinigte RNA in 1,5% agarose Tris-borate-EDTA (TBE) Gel (mit 0,5 μg/mL Ethidium Bromid), um die RNA zu überprüfen. Das Gel unter einem UV-Beleuchtungsgerät (Abbildung 3B) visualisieren.
  3. Überprüfen Sie die Konzentration der RNA mit Hilfe eines Spektrophotometers und bestimmen Sie das Verhältnis A260/A280 (~ 1,8-2,0 ist akzeptabel).
  4. Die gereinigte RNA ausrichten und bei-80 ° C lagern.

3. Transfect mRNA to Cells

  1. Saatgut-HeLa-Zellen in einer 24-Well-Platte (ca. ~ 80-90% am nächsten Tag konfluent) und Inkubat über Nacht in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO2.
  2. Infizieren Sie HeLa-Zellen mit einem Impfstoffvirus (VACV) bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 5 oder halten Sie nicht infizierte HeLa-Zellen zum Vergleich.
    NOTE: MOI ist die Zahl der infektiösen Viruspartikel pro Zelle.
  3. MOI von X = {[(Anzahl der Zellen * X)/Virus Titer] * 1000} μl des Virus pro 1 mL Medium.
  4. Nach der gewünschten h Post-Infektion (hpi) (in diesem Experiment bei 10-12 hpi), transfect mRNA (500 ng der gesamten mRNA pro Brunnen von 24-well-Platten) mit einem kationischen Lipid-Transfection Reagenz, wie in Abbildung 3Cgezeigt.
    1. Für einen Brunnen einer 24-Well-Platte, mischen 480 ng von 12A Sequenz mit firefly luciferase (12A-Fluc) mRNA und 20 ng Kozak-Sequenz mit Renilla luciferase (Kozak-Rluc) mRNA in einem Mikrozentrifugenrohr. In einem weiteren mikrozentrifugen Rohr werden 1,1 μL kationisches Lipidtransfektionsreagenz hinzugefügt.
    2. In beiden Röhren 55 μL reduziertes Serummedium hinzufügen. Mischen Sie und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
    3. Nach 5 Minuten Inkubation, fügen Sie 55 μL kationisches Fetttransfektionsreagenz mit reduziertem Serummedium in mRNA mit Schlauch.
    4. Mischen Sie sanft, aber gründlich, und inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min.
    5. Während der Inkubation das Zellkulturmedium entfernen und 400 μL reduziertes Serummedium pro Brunnen von 24-Brunnen-Platten hinzufügen.
    6. Nach der Inkubation 100 μL der Mischung droptisch und gleichmäßig zu einer gut 24-Brunnen-Platte geben.

4. Maß Luciferase-Aktivitäten

  1. Fünfstündige Post-Co-Transfektion von 12A-Fluc und Kozak-Rluc mRNA, messen luciferase-Aktivität mit einem Luciferase-Assay-System in der Lage, zwei Reporter-Assays (z. B. Dual Luciferase Reportage-Kit) durchzuführen.
  2. Entfernen Sie das reduzierte Serummedium und lysern Sie die Zellen, indem Sie 150 μL 1x Lysepuffer, ein Bestandteil des Luciferase-Assay-Bausatzes, hinzufügen.
  3. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur sammeln Sie das Lysat, indem Sie die Zellen verschrotten und in ein Mikrozentrifugenrohr überführen.
  4. Zentrifuge das Lysat bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C, um Pelletzellschutt zu erhalten.
  5. Fügen Sie 30 μL Supernatant in undurchsichtige 96 gut weiße Assay-Platte mit einem festen Boden.
  6. Messen Sie die Dual-Lumineszenz mit dem Luciferase-Assay-Kit und einem Multimode-Plattenleser-Leuchtmesser.
  7. Führen Sie die Messung mit Hilfe der Kinetik-Funktion (auf pro-well-Basis) mit den Einstellungen, die in Tabelle5 beschrieben sind.
    NOTE: Die Lektüre kann auch mit einem manuellen Leuchtenmesser erfolgen. Fügen Sie ein gleichmäßiges Volumen von Lysat und Substrat für Fluc in einer Cuvette hinzu. Warten Sie auf 2 s und messen Sie auf 10 s mit Leuchtometer. Nach der Fluc-Messung schnell die Cuvette aus dem Leuchtometer herausnehmen und für Rluc manuell ein gleichmäßiges Volumen des Substrats hinzufügen. Warten Sie wieder auf 2 s und messen Sie 10 s mit Leuchtometer.
  8. Exportieren Sie die Lumineszenz-Lesdaten in ein wünschenswertes Dateiformat.
  9. Bestimmen Sie die relative Übersetzungsrate von 12A-Fluc mRNA in nicht infizierten und VACV-infizierten HeLa-Zellen, indem Sie den Fluc-Wert durch interne Kontrolle Rluc-Wert teilen.
    NOTE: Ergänzende Abbildung 1 zeigt die schrittweise Analyse von Rohdaten, um eine relative Fluc-Aktivität zu erhalten.

Ergebnisse

Die vier Schritte des in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Anenstehens: PCR zur Erzeugung von DNA-Schablonen für In-vitro-Transkription, In-vitro-Transkription zur Erzeugung mRNA, mRNA-Transfektion und Luciferase-Messung, sind im schematischen Diagramm zu sehen ( Abbildung 1). Die Entwarf von Primern sowohl für DNA-Vorlagen (Fluc und Rluc) als auch für das allgemeine Schema der Überhangverlängerung PCR...

Diskussion

Alle Vierkernschritte sind entscheidend für den Erfolg des in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Sassay. Besonderes Augenmerk sollte auf das Grundierdesign gelegt werden, insbesondere für die T7-Promoter-Sequenz. Die Transkription von T7-RNA beginnt mit der Transkription des unterstrichenen ersten G (GGG-5 '-UTR-AUG-) im T7-Promoter, der vor der 5 '-UTR-Sequenz hinzugefügt wurde. Obwohl die Transkription Startplatz (TSS) beginnt von der ersten G am 5 '-Ende, sank die Zahl der G es weniger ...

Offenlegungen

Die Autoren möchten keine konkurrierenden finanziellen Interessen erklären.

Danksagungen

Das Projekt wurde von den National Institutes of Health (AI128406 www.nih.gov) an ZY und teilweise vom Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) in Form des Graduate Student Summer Stipend to PD gefördert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master mixNew England BiolabsM0492High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England BiolabsS1411LAnti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplateCorning3693Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1960Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOMEGA BIO-TEKD6492PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate LuminometerPromegaGM2010Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis KitNew England BiolabsE2050SIn Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000Thermo Fisher ScientificND-2000Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Reduced serum media
Purelink RNA Mini KitThermo Fisher Scientific12183018ARNA purification kit
Vaccinia Capping SystemNew England BiolabsM2080Capping system

Referenzen

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