Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion

Zusammenfassung

Hier stellen wir Protokolle zur Herstellung von akuten Hirnscheiben vor, die den lateralen Geniculate-Kern enthalten, und die elektrophysiologische Untersuchung der Funktion retinogenes und kortikogener Synapsen. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, Synapsen mit der hohen Freisetzungs- und Low-Release-Wahrscheinlichkeit in den gleichen akuten Gehirnscheiben zu untersuchen.

Zusammenfassung

Der laterale Geniculate-Kern ist die erste Relaisstation für die visuelle Information. Relay-Neuronen dieses thalamischen Kerns integrieren Deninput aus retinalen Ganglienzellen und projizieren sie auf den visuellen Kortex. Darüber hinaus erhalten Relaisneuronen eine Top-Down-Erregung aus dem Kortex. Die beiden wichtigsten erregerten Eingänge zu den Relaisneuronen unterscheiden sich in mehreren Aspekten. Jedes Relaisneuron erhält Deninput von nur wenigen retinogenen Synapsen, die große Terminals mit vielen Freisetzungsstellen sind. Dies spiegelt sich in der vergleichsweise starken Anregung wider, die die Relaisneuronen von retinalen Ganglienzellen erhalten. Corticogeniculate Synapsen, im Gegensatz dazu, sind einfacher mit wenigen Freisetzungsstellen und schwächere synaptische Stärke. Die beiden Synapsen unterscheiden sich auch in ihrer synaptischen kurzfristigen Plastizität. Retinogene Synapsen haben eine hohe Freisetzungswahrscheinlichkeit und zeigen daher eine kurzfristige Depression. Im Gegensatz dazu haben kortizogene Synapsen eine geringe Freisetzungswahrscheinlichkeit. Corticogeniculate Fasern durchqueren die retikulären thalamischen Kerne, bevor sie in den lateralen Geniculate-Kern gelangen. Die verschiedenen Positionen des retikulären thalamischen Kerns (rostral aus dem lateralen Genulatenkern) und des Optiktraktes (ventro-lateral aus dem lateralen Geniculate-Kern) ermöglichen die anregende Kortikogenesulate oder Retinogene Uuplate-Synapsen getrennt mit extrazellulären Stimulationselektroden. Dies macht den lateralen Geniculate-Kern zu einem idealen Hirnbereich, in dem zwei exzitatorische Synapsen mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften, die auf denselben Zelltyp einwirken, gleichzeitig untersucht werden können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der Aufzeichnung von Relaisneuronen und zur detaillierten Analyse der Retinogenulate- und Kortikogenen-Synapsenfunktion in akuten Hirnscheiben. Der Artikel enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von akuten Hirnscheiben des lateralen Geniculate-Kerns und Schritte zur Aufzeichnung der Aktivität von Relaisneuronen durch separate Stimulierung des Optiktraktes und der kortizogenen Fasern.

Einleitung

Relay Neuronen des lateralen Geniculate-Kerns integrieren und leiten visuelle Informationen an den visuellen Kortex weiter. Diese Neuronen erhalten exzitatorische Eingaben von Ganglienzellen über retinogene Synapsen, die den Haupterregerantrieb für Relaisneuronen darstellen. Darüber hinaus erhalten Relaisneuronen exzitatorische Eingaben von kortikalen Neuronen über kortikogene Synapsen. Darüber hinaus erhalten Relaisneuronen hemmende Inputs von lokalen Interneuronen und GABAergen Neuronen des Kerns reticularis thalami¹. Der Kern reticularis thalami ist wie ein Schild zwischen Thalamus und Kortex vorhanden, so dass Fasern, die von Kortex zu Thalamus und in die entgegengesetzte Richtung projizieren, durch den Kern reticularis thalami²gehen müssen.

Retinogene in- und kortikogene Inputs weisen unterschiedliche synaptische Eigenschaften^{auf 3,4,5,6,7,8}. Retinogene Inputs bilden große Terminals mit mehreren Freisetzungsstellen^9,10. Im Gegensatz dazu zeigen kortizogene Eingänge kleine Terminals mit Single Release-Sites⁷an. Darüber hinaus treiben Retinogene Synapsen effizient Aktionspotenziale von Relaisneuronen an, obwohl sie nur 5 bis 10 % aller Synapsen auf Relaisneuronen^3,8,11ausmachen. Corticogeniculate Synapsen dienen dagegen als Modulator von Retinogenulatenübertragungen, indem sie das Membranpotenzial der Relaisneuronen^12,13steuern.

Diese beiden wichtigsten erregenden Inputs für Relais-Neuronen sind auch funktional unterschiedlich. Ein deutlicher Unterschied ist die kurzfristige Depression von retinogenen Synapsen und die kurzfristige Erleichterung von Kortikogenen Synapsen^3,5,8. Kurzfristige Plastizität bezieht sich auf ein Phänomen, bei dem sich die synaptische Stärke ändert, wenn die Synapse innerhalb eines Zeitraums von wenigen Millisekunden bis zu mehreren Sekunden wiederholt aktiv ist. Die synaptische Freisetzungswahrscheinlichkeit ist ein wichtiger Faktor, der der kurzfristigen Plastizität zugrunde liegt. Synapsen, mit einer geringen anfänglichen Freisetzungswahrscheinlichkeit, zeigen kurzfristige Erleichterungen aufgrund des Aufbaus von Ca²⁺ in der Presynapse und folglich eine Erhöhung der Freisetzungswahrscheinlichkeit wird bei wiederholter Aktivität beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigen Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit in der Regel eine kurzfristige Depression aufgrund der Erschöpfung der fertig enveasierbaren Vesikel¹⁴. Darüber hinaus trägt die Desensibilisierung postsynaptischer Rezeptoren zur kurzfristigen Plastizität in einigen Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit^{bei 8,15}. Hohe Freisetzungswahrscheinlichkeit und Desensibilisierung von Rezeptoren für die Freisetzung von N-Amino-3-Hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure (AMPA) tragen zur prominenten kurzfristigen Depression von Retinogenitätssynapsen bei. Im Gegensatz dazu liegt die geringe Freisetzungswahrscheinlichkeit der kurzfristigen Erleichterung von kortikogenen Synapsen zugrunde.

Bei Mäusen gelangt der Optische Trakt von der caudolateralen Stelle in den dorsalen lateralen Geniculate-Kern (dLGN), während kortizogene Fasern rostroventral in den dLGN eindringen. Der Abstand zwischen den beiden Eingängen ermöglicht die Untersuchung der individuellen Eigenschaften von zwei sehr unterschiedlichen erregerten Eingaben, die auf dieselbe Zelle einschlagen. Hier bauen wir auf einer zuvor beschriebenen Seziermethode auf und verbessern sie, bei der Retinogene und kortikogene Fasern in akuten Hirnscheiben konserviert werden³. Wir beschreiben dann die elektrophysiologische Untersuchung von Relaisneuronen und die Stimulation von Retinogenkulat- und Kortikogenulatefasern mit extrazellulären Stimulationselektroden. Schließlich stellen wir ein Protokoll zur Befüllung von Relaisneuronen mit Biocytin und anschließender anatomischer Analyse zur Verfügung.

Protokoll

Alle Experimente wurden vom Landeskontrollgremium für Tierversuche rheinland-pfalz genehmigt.

1. Lösungen

1. Dissektionslösung
   1. Um die Exzitotoxizität zu reduzieren, bereiten Sie eine Cholin-basierte Lösung vor, die während der Sezieren verwendet werden soll, wie hier dargestellt (in mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 Cholinchlorid, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl_2, und ₂₅ Glukose. Bereiten Sie die Sezierlösung weniger als 1 Woche vor dem Experiment vor.
2. Aufnahmelösung
   1. Bereiten Sie eine künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) Lösung vor, die (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂und 25 Glucose enthält. Fügen Sie 50 M D-APV und 10 M SR 95531 Hydrobromid hinzu, um N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) bzw. GABA-A-Rezeptoren zu blockieren.
3. Intrazelluläre Lösung
   1. Bereiten Sie eine intrazelluläre Lösung vor, die (in mM) 35 Cs-Gluconat, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA und 0,1 D-600 (Methoxyverapamilhydrochlorid) enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit CsOH auf 7,3 ein. Filtern, aliquot, und lagern Sie die Lagerlösung bei -20 °C bis zur Verwendung.

2. Dissektion

1. Bereiten Sie zwei Scheibenkammern vor, von denen eine mit 100 ml der Sezierlösung und die andere mit 100 ml Aufnahmelösung gefüllt ist. Die beiden Becher in ein Wasserbad (37 °C) geben und die Lösungen mit Carbogen mindestens 15 min vor der Zerlegung blasen.
2. Füllen Sie einen Kunststoffbecher mit 250 ml nahezu eiskalter (aber nicht gefrorener) Sezierlösung. Blase mit Carbogen mindestens 15 min vor Gebrauch.
3. Füllen Sie eine Kunststoff-Petrischale (100 mm x 20 mm), in der die Hirnsektion durchgeführt wird, mit der kalten Dissektionslösung. Legen Sie ein Stück Filterpapier in den Deckel der Petrischale.
4. Kühlen Sie die Sezierkammer des Vibratome ab.
5. Anästhetisieren Sie eine Maus mit 2,5% Isofluran, z.B. im Mauskäfig. Sobald die Maus nicht auf eine Schwanzprise reagiert, enthaupten Sie die Maus in der Nähe der Zervix-Medulla und tauchen Sie den Kopf in die eiskalte Dissektionslösung in der Basis der Petrischale ein.
6. Schneiden Sie die Haut des Kopfes von kaudal zu nasal und halten Sie es seitlich mit den Fingern, um den Schädel zu belichten. Um das Vorhirn herauszunehmen, schneiden Sie zuerst den Schädel zusammen mit der hinteren vorderen Mittellinie, und schneiden Sie dann zwei weitere Male durch die koronare Naht und Lambdoid Naht (Abbildung 1A).
7. Entfernen Sie den Schädel zwischen der koronalen Naht und der Lambdoid-Naht so, dass das Großhirn freigelegt wird. Schneiden Sie die Olfaktor-Glühbirne und trennen Sie das Vorderhirn vom Mittelhirn mit einer feinen Klinge (Abbildung 1B). Entfernen Sie das Gehirn mit einem dünnen Spachtel aus dem Schädel und legen Sie es auf das Filterpapier im Deckel der Petrischale.
   HINWEIS: Die Schritte 2.6 und 2.7 sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, um den Zelltod zu reduzieren.
8. Um die Integrität der sensorischen und kortikalen Eingänge in die dLGN in der Hirnscheibe zu erhalten, trennen Sie die beiden Hemisphären mit einem parasagittalen Schnitt mit einem Winkel von 3 bis 5° (Abbildung1C,D). Trocknen Sie die mediolateralen Ebenen der beiden Hemisphären, indem Sie sie auf das Filterpapier legen und dann auf die Schnittstufe mit einem Winkel von 10 bis 25° von der horizontalen Ebene kleben (Abbildung 1E).
9. Legen Sie die Bühne in die Mitte der Metallpufferschale und gießen Sie den Rest der eiskalten Dissektionslösung vorsichtig in die Pufferschale. Führen Sie diesen Schritt sorgfältig durch, da ein starker Guss das eingefügte Gehirn entfernen könnte (Abbildung 1F).
10. Legen Sie die Pufferschale in die eisgefüllte Schale, was hilft, die niedrige Temperatur während der Zerlegung aufrechtzuerhalten. Schneiden Sie 250 m Scheiben mit einer Rasierklinge mit einer Geschwindigkeit von 0,1 mm/s und einer Amplitude von 1 mm.
11. Die Scheiben in der Haltekammer mit sauerstoffhaltiger Dissektionslösung bei 34 °C ca. 30 min aufbewahren und die Scheiben dann bei 34 °C weitere 30 min in der Aufnahmelösung erholen lassen.
12. Nach der Bergung die Scheibenhaltekammer aus dem Wasserbad entfernen und Scheiben bei Raumtemperatur (RT) aufbewahren, bis sie in Experimenten verwendet werden.

3. Elektrophysiologie

1. Ziehen Sie Pipetten mit Borosilikatglaskapillaren und einem Filamentzieher. Halten Sie den Widerstand der Aufnahmepipetten bei 3 x 4 Mio. € aufrecht. Ziehen Sie stimulierende Pipetten mit dem gleichen Protokoll, aber brechen Sie die Spitze leicht nach dem Ziehen, um den Durchmesser zu erhöhen. Füllen Sie die Aufnahmepipetten mit der intrazellulären Lösung und Biocytin, während Sie stimulierende Pipetten mit der Aufnahmelösung füllen.
2. Legen Sie die Scheiben in die Aufnahmekammer und durchdringen Sie die Scheiben kontinuierlich mit sauerstoffhaltiger Aufnahmelösung bei RT. Überprüfen Sie alle Scheiben und wählen Sie die Scheiben aus, die einen intakten Optiktrakt aufweisen.
3. Visualisieren Sie die Scheibe und zellen mit einem aufrechten Mikroskop, das mit Infrarot-Differentialinterferenzkontrast (IR-DIC) Videomikroskopie ausgestattet ist.
   HINWEIS: Relaisneuronen unterscheiden sich von Interneuronen durch ihre größere Somagröße und mehr primäre Dendriten (Zweige, die aus dem Soma hervortreten). Interneurons zeigen bipolare Morphologie mit einem kleineren Soma.
4. Legen Sie die stimulierende Pipette auf die Scheibe, bevor Sie die Zelle mit der Aufnahmepipette flicken. Um retinogene Synapsen zu untersuchen, legen Sie die stimulierende Pipette direkt auf den Optiktrakt, wo die Axonfasern aus retinalen Ganglienzellen gebündelt werden (Abbildung 2A). Um kortikogene Synapsen zu analysieren, legen Sie die stimulierende Elektrode auf den Nukleus reticularis thalami, der rostroventral an die dLGN angrenzt (Abbildung 2B).
5. Sobald die Aufnahmepipette in die Aufnahmelösung eingetaucht ist, wenden Sie einen 5 mV Spannungsschritt an, um den Pipettenwiderstand zu überwachen. Stellen Sie das Haltepotential auf 0 mV ein und brechen Sie das Offsetpotential ab, sodass der Haltestrom 0 pA beträgt.
6. Nähern Sie sich der Zelle mit der Aufnahmepipette, während Sie positiven Druck ausüben. Wenn die Pipette in direktem Kontakt mit der Zellmembran ist, lassen Sie den positiven Druck los und stellen Sie das Haltepotenzial auf -70 mV ein. Wenden Sie einen leichten Unterdruck an, damit sich die Zellmembran an der Glaspipette so anheften kann, dass sich eine Gigaohm-Dichtung bildet (Widerstand >1 G"). Kompensieren Sie die Pipettenkapazität und öffnen Sie die Zelle durch Anwendung von Unterdruckimpulsen.
7. Um die synaptische Funktion zu untersuchen, wenden Sie 0,1 ms Stromimpulse (ca. 30 A) über die Stimulationspipette an. Wenn keine synaptischen Reaktionen beobachtet werden, müssen die stimulierenden Pipetten möglicherweise ersetzt werden. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die stimulierenden Pipetten an eine andere Position bringen, so dass die aufgezeichnete Zelle nicht verloren geht.
   HINWEIS: In den in Abbildung 2gezeigten Beispielaufzeichnungen wurde die synaptische Kurzzeitplastizität untersucht, indem der Optische Trakt oder kortikogene Fasern zweimal mit 30 ms Interstimulus-Intervallen angeregt wurden. Das gepaarte Pulsverhältnis (PPR) wurde berechnet, indem die Amplitude des zweiten exzitatorischen postsynaptischen Stroms (EPSC) durch das des ersten EPSC (EPSC₂/EPSC₁₎dividiert wurde. Jedes Stimulationsprotokoll wurde 20 Mal wiederholt. Die EPSC-Amplitude wurde anhand der Durchschnittsströme der 20 Sweeps gemessen. Das Zeitintervall zwischen jeder Wiederholung betrug mindestens 5 s, um eine kurzfristige Plastizität zu vermeiden, die durch die Wiederholungen induziert wurde.
8. Überwachen Sie den Serienwiderstand kontinuierlich, indem Sie einen 5-mV-Spannungsschritt anwenden. Verwenden Sie nur die Zellen mit einem Reihenwiderstand von weniger als 20 Mio. € für die Analyse.

4. Biocytin-Etikettierung

1. Halten Sie die Ganzzellkonfiguration für mindestens 5 min aufrecht, um die Diffusion von Biocytin in die distalen Dendriten zu ermöglichen.
2. Entfernen Sie nach der Aufnahme vorsichtig die Pipette aus der Zelle, damit das Soma nicht zerstört wird.
   HINWEIS: Wenn mehr als eine Zelle auf einem Segment aufgezeichnet wird, sollten ihre Somas ausreichend von ihren benachbarten Zellen entfernt sein. Stellen Sie sicher, dass die Dendriten aus verschiedenen Zellen sich während der Bildgebung nicht gegenseitig stören.
3. Bereiten Sie eine 24-Well-Zellkulturplatte vor. Füllen Sie jeden Brunnen mit 300 l 4% Paraformaldehyd (PFA). Achten Sie darauf, nichts mit PFA zu verunreinigen, das in Kontakt mit den zu erfassenden Scheiben ist.
4. Die Scheiben aus der Aufnahmekammer mit einer Gummipipette auf die PFA-haltige Platte übertragen und über Nacht fixieren. Stellen Sie sicher, dass die Pipette immer vor einer PFA-Kontamination gehindert wird.
   VORSICHT: Tragen Sie bei der Manipulation von PFA immer Handschuhe und eine chemische Kapuze.
5. Nachdem Sie die Scheiben über Nacht in PFA fixiert haben, ersetzen Sie PFA durch phosphatgepufferte Saline (PBS). Bewahren Sie die Scheiben in PBS bei 4 °C für die zukünftige Verarbeitung (weniger als 2 Wochen) auf.
6. Waschen Sie die Scheiben mit frischen PBS 3 mal (10 min jeder Wäsche).
7. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie die Scheiben in der Blockierlösung (0,2% nichtionisches Tensid und 5% Rinderserumalbumin in PBS) für 2 h bei RT auf einem Orbitalshaker inkubieren.
8. Verwerfen Sie die Blockierungslösung. Inkubieren Sie die Scheiben mit Streptavidin-Alexa 568 in die Blockierlösung (1:1.000) bei 4 °C über Nacht auf einem Orbital-Shaker verdünnt.
9. Entsorgen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie Die Scheiben 3 mal mit PBS für 10 min bei RT auf einem Orbital-Shaker. Waschen Sie die Scheiben vor der Montage mit Leitungswasser.
10. Legen Sie die Scheiben von einer Maus auf eine Glasrutsche. Stellen Sie sicher, dass sich die gebeizten Zellen auf der Oberseite der Scheiben befinden. Das Wasser um die Scheiben mit Geweben aufnehmen und die Scheiben dann ca. 15 min trocknen lassen.
11. Tragen Sie zwei Tropfen Montagemedium auf jede Scheibe auf. Montieren Sie einen Deckelschlupf auf der Rutsche, ohne Luftblasen zu erzeugen.
12. Bewahren Sie die beschrifteten Scheiben nach der Visualisierung mit einem konfokalen Mikroskop bei 4 °C auf.

5. Zelluläre Bildgebung und Rekonstruktion

1. Scannen Sie Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop und verwenden Sie die zugehörige Software für die Analyse.
2. Erregen Sie die Fluoreszenz bei 561 nm.
3. Bild die Scheiben mit 0,7 numerische blende (NA), Öl-Immersion-Objektiv.
4. Passen Sie die Zielzelle in der Mitte der Ansicht an, und wenden Sie eine 2,5-fache Vergrößerung an.
5. Rendern Sie die Z-Stack-Datasets, um das gesamte Neuron mit den folgenden Parametern zu scannen: Format = 2.550 x 2.550 Pixel, Scanfrequenz = 400 Hz, z Zahl = 40.Voxel Größe war um 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 m3.
6. Die Neuronen werden halbautomatisch mit einer neuronalen Rekonstruktionssoftware (z.B. NeuronStudio) nachverfolgt. Ein Beispiel für ein 3D-verfolgtes Relaisneuron ist in Abbildung 3Bdargestellt.

Ergebnisse

Die Scheibenzubereitung von dLGN, die die Retinogenkulat- und Kortikogenuspfade enthält, wird unter einem 4x Objektiv gezeigt (Abbildung 2). Axone von retinalen Ganglienzellen bündeln sich im Optiktrakt (Abbildung 2). Die stimulierende Pipette wurde auf den optischen Trakt gelegt, um retinogenes Synapsen-vermittelten Strom zu induzieren (Abbildung 2A) und auf Dennukle reticularis thalami, um kortik...

Diskussion

Wir beschreiben ein verbessertes Protokoll auf der Grundlage einer zuvor veröffentlichten Methode³, die die Untersuchung der hohen Wahrscheinlichkeit der Freisetzung von Retinogenusat synapsen und geringe Wahrscheinlichkeit der Freisetzung corticogeniculate Synapsen aus der gleichen Scheibe ermöglicht. Dies ist von großer Bedeutung, da diese beiden Eingänge miteinander interagieren, um die visuelle Signalübertragung zu modulieren: Retinogene Inputs sind der Haupterregerantrieb von Relaisneuro...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261-250MG
CaCl2	EMSURE	1.02382.1000
choline chloride	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
CsCl	EMSURE	1.02038.0100
Cs-gluconate	Self-prepared		Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG	methoxyverapamil hydrochloride
D-APV	Biotrend	BN0085-100	NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope	Olympus	XM10
EGTA	SERVA	11290.02
Forene	Abbvie	2594.00.00	isoflurane
Glucose	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	ROTH	9105.2
High Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A385
KCl	EMSURE	1.04936.1000
MgCl2	EMSURE	1.05833.0250
Micromanipulators	Luigs & Neumann	SM7
Miroscope	Olympus	BX51
mounting medium	ThermoFisher Scientific	P36930	Prolong Gold Invitrogen
NaCl	ROTH	3957.1
NaH2PO4	EMSURE	1.06346.1000
NaHCO3	EMSURE	1.06329.1000
Pipette	Hilgenberg	1807502
Puller	Sutter	P-1000
razor blade	Personna	60-0138
Semiautomatic Vibratome	Leica  Biosystems	VT1200S
SR 95531 hydrobromide	Biotrend	AOB5680-10	GABAA-receptor antagonist