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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.

Zusammenfassung

Die Parkinson-Krankheit (PD) wird durch Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen an der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im ventralen Mesencephalon (VM) verursacht. Zellersatztherapie hält große Versprechen für die Behandlung von PD. In letzter Zeit haben sich induzierte neuronale Stammzellen (iNSCs) als potenzieller Kandidat für die Zellersatztherapie aufgrund des reduzierten Risikos der Tumorbildung und der Plastizität, die zu regionsspezifische Neuronen und Glia. iNSCs können aus autologen somatischen Zellquellen wie Fibroblasten, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNCs) und verschiedenen anderen Zelltypen umprogrammiert werden. Im Vergleich zu anderen Arten von somatischen Zellen sind PBMNCs ein attraktiver Starterzellentyp, da der Zugriff auf die Kultur erleichtert und erweitert wird. Sendai Virus (SeV), ein nichtintegratives RNA-Virus, das Reprogramming-Faktoren wie humanoct3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC kodiert, hat ein negativ-sinnliches, einsträngiges, nicht segmentiertes Genom, das sich nicht in Wirtsgenom, sondern nur im Zytoplasma infizierter Zellen repliziert, bietet ein effizientes und sicheres Vehikel für die Neuprogrammierung. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll, in dem iNSCs durch Neuprogrammierung von PBMNCs erhalten und durch eine zweistufige Methode in spezialisierte VM-DA-Neuronen differenziert werden. Dann werden DA-Vorläufer in einseitig 6-Hyroxydopamin (6-OHDA)-lsioned PD-Mausmodelle transplantiert, um die Sicherheit und Wirksamkeit für die Behandlung von PD zu bewerten. Diese Methode bietet eine Plattform, um die Funktionen und therapeutischen Wirkungen patientenspezifischer DA-Neuralzellen in vitro und in vivo zu untersuchen.

Einleitung

Parkinson-Krankheit (PD) ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung, verursacht durch Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen an der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im ventralen Mesencephalon (VM), mit einer Prävalenz von mehr als 1% in der Bevölkerung über 60 Jahre alt 1 , 2. In den letzten zehn Jahren hat die Zelltherapie, die darauf abzielt, entweder die degenerativen oder geschädigten Zellen zu ersetzen oder die Mikroumgebung um die degenerierenden Neuronen zu nähren, Potenzial bei der Behandlung von PD3gezeigt. Inzwischen hat die Umprogrammierungstechnologie signifikante Fortschritte gemacht4, die eine vielversprechende zelluläre Quelle für die Ersatztherapie bietet. Es hat sich gezeigt, dass sich humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) und embryonale Stammzellen (ESCs) in DA-Neuralzellen differenzieren können, die überleben, reifen und die motorischen Funktionen verbessern könnten, wenn sie in Ratten- und nichtmenschliche Primaten-PD-Modelle eingepfropft werden5 ,6,7,8. iPSCs stellen einen Meilenstein in der zellulären Reprogrammierungstechnologie dar und haben ein großes Potenzial in der Zelltransplantation; Es besteht jedoch nach wie vor Bedenken hinsichtlich des Risikos einer Tumorbildung durch die unvollständig differenzierten Zellen. Eine alternative zelluläre Quelle für die Zelltransplantation sind abstammungsgebundene adulte Stammzellen, die durch direkte Reprogrammierung gewonnen werden, wie z. B. induzierte neuronale Stammzellen (iNSCs), die aus den instabilen Zwischenprodukten abgeleitet werden können, um die Pluripotenz zu umgehen. Stufe9,10,11.

Sowohl iPSCs als auch iNSCs können aus autologen Zellquellen wie Fibroblasten, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNCs) und verschiedenen anderen Zelltypen12,13,14umprogrammiert werden, wodurch die Immunogenität transplantierter Zellen in hohem Maße. Darüber hinaus sind iNSCs im Vergleich zu iPSCs mit einem reduzierten Risiko für Tumorbildung und liniengebundene Plastizität verbunden, die nur in der Lage sind, sich in Neuronen und Glia zu differenzieren11. In den ersten Studien wurden humane oder Maus-iPSCs und iNSCs aus Fibroblasten aus Hautbiopsien gewonnen, was ein invasives Verfahrenist 14,15. In diesem Zusammenhang sind PBMNCs eine ansprechende Starterzellquelle aufgrund des weniger invasiven Probenahmeprozesses und der Leichtigkeit, eine große Anzahl von Zellen innerhalb einer kurzen Expansionszeit zu erhalten16. Erste Reprogrammierungsstudien verwendeten integrative Abgabesysteme, wie z. B. lentivirale oder retrovirale Vektoren, die in vielen Zelltypen effizient und einfach umzusetzen sind17; diese Abgabesysteme können jedoch Mutationen und Reaktivierung endenvon Resttransgenen, die Sicherheitsprobleme für klinische therapeutische Zwecke darstellen12. Sendai-Virus (SeV) ist ein nicht-integratives RNA-Virus mit einem negativ-sinnlichen, einsträngigen Genom, das sich nicht in das Wirtsgenom integriert, sondern sich nur im Zytoplasma infizierter Zellen repliziert und ein effizientes und sicheres Vehikel für die Neuprogrammierung bietet18 ,19. Rekombinante SeV-Vektoren sind verfügbar, die Reprogrammierungsfaktoren wie menschliche OCT3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC in ihren offenen Leserahmen enthalten. Darüber hinaus können SeV-Virusvektoren durch die Einführung temperaturempfindlicher Mutationen weiter verbessert werden, so dass sie schnell entfernt werden können, wenn die Kulturtemperatur auf 39 °C20angehoben wird. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zum Umprogrammieren von PBMNCs auf iNSCs mithilfe des SeV-Systems.

Viele Studien haben die Ableitung von DA-Neuronen von menschlichen ESCs oder iPSCs mit verschiedenen Methoden6,8,21berichtet. Es gibt jedoch einen Mangel an Protokollen, die die Differenzierung von DA-Neuronen von iNSCs im Detail beschreiben. In diesem Protokoll beschreiben wir die effiziente Generierung von DA-Neuronen von iNSCs mit einer zweistufigen Methode. Die da neuronalen Vorläufer können zur Sicherheit und Wirksamkeit in das Striatum von PD-Mausmodellen transplantiert werden. Dieser Artikel wird ein detailliertes Protokoll vorstellen, das verschiedene Stadien von der Generierung induzierter neuronaler Stammzellen durch Sendai-Virus, der Differenzierung von iNSCs in DA-Neuronen, der Etablierung von Maus-PD-Modellen bis hin zur Transplantation von DA-Vorläufern in das Striatum abdeckt. der PD-Modelle. Mit diesem Protokoll kann man iNSCs von Patienten und gesunden Spendern generieren und DA-Neuronen ableiten, die sicher, standardisierbar, skalierbar und homogen für Zelltransplantationszwecke sind, oder zur Modellierung von PD in einer Schale und zur Untersuchung der Mechanismen Grunderkrankungsbeginn und -entwicklung.

Protokoll

Alle Verfahren müssen den Leitlinien der Ethikkommission für die institutionelle Menschliche Forschung folgen. Vor der Blutentnahme muss die informierte Zustimmung von Patienten oder gesunden Probanden eingeholt werden. Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission für Humanforschung der Institution genehmigt und gemäß den Richtlinien der Institution für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt.

1. Sammlung, Isolierung und Erweiterung von PBMNCs

  1. Sammlung von PBMNCs
    1. Sammeln Sie 10-20 ml peripheres venöses Blut des Spenders durch Venipunktion mit einer Natrium-Heparin-Konservierungsmittel-Durchstechflasche.
      HINWEIS: Blutproben sollten bei Raumtemperatur (RT) gelagert oder versendet werden. Verarbeiten Sie die Blutproben innerhalb von 24 h.
  2. Vorbereitung des Kulturmediums
    1. Bereiten Sie serumfreies Medium (SFM) vor, indem Sie die folgenden Komponenten kombinieren: 245 ml des modifizierten Dulbecco-Mediums (IMDM), 240 ml von Hams F-12, 5 ml Insulin-Transferrin-Selen-X-Ergänzung (ITS-X), 5 ml 100x Glutamin-Stammlösung(Tabelle Materialien),5 ml chemisch definiertes Lipidkonzentrat, 2,5 g fetales Rinderserum, 0,025 g Ascorbinsäure und 9 l 1-Thioglycerol. Filtern Sie das Medium und lagern Sie es bei 4 °C.
      VORSICHT: Ascorbinsäure und 1-Thioglycerol sind durch Hautkontakt und Inhalation giftig.
    2. Zur Herstellung des mononukleären Zellmediums (MNC) ergänzen Sie das SFM-Medium mit 10 ng/ml humanem Interleukin 3 (IL-3), 2 U/mL Erythropoietin (EPO), 100 ng/ml Humanstammzellfaktor (SCF), 40 ng/ml humanem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1), 100 g/ml Holo-Transferrin und 1 M Dexamethason. Filtern Sie das Medium und lagern Sie es bei 4 °C.
      HINWEIS: Bereiten Sie das Medium unmittelbar vor der Verwendung vor.
  3. Isolierung von PBMNCs
    1. Ultraviolett-sterilisieren Sie eine saubere Bank vor der Verwendung. Sterilisieren Sie alle Oberflächen und Geräte mit 75% Alkohol. Sterilisieren Sie alle Tipps mit einem Autoklaven.
    2. Übertragen Sie das periphere Blut (PB) in ein 50 ml konisches Rohr und verdünnen Sie den PB mit einem gleichen Volumen steriler Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (D-PBS).
    3. Bereiten Sie 15 ml sterilisiertedichteDichte Gradientmedium (Tabellen der Materialien) in einem anderen 50 ml konischen Rohr.
      HINWEIS: Halten Sie den Dichtegradienten medium und PB bei RT, um eine bessere Isolierung von PBMNCs zu ermöglichen.
    4. Neigen Sie das konische Rohr, das das Dichtegradientenmedium enthält, in einem 45°-Winkel und legen Sie dann langsam und vorsichtig 30 ml verdünntes PB auf das Dichtegradientenmedium.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, und lassen Sie die PB langsam die Seite des konischen Rohres auf die Dichte Gradienten mittlere Schicht laufen. Rote Blutkörperchen werden sich an der Unterseite der Röhre ablagern. Neigen Sie das Rohr sorgfältig, um Störungen der Schichtschnittstelle zu minimieren.
    5. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 800 x g für 15 min bei RT mit der Zentrifugebremse in "aus" Position. Die gelbe, obere Plasmaschicht ansaugen und entsorgen. Übertragen Sie dann die weiße, trübe Dünnschicht mit MNCs mit einer 10 ml Pipette auf ein neues 50 ml konisches Rohr.
      HINWEIS: Das Ausschalten der Zentrifuge ist wichtig für die Isolierung von MNCs.
    6. 30 ml D-PBS mit MNCs und Zentrifuge bei 600 x g für 10 min bei 4 °C in die Röhre geben. Verwerfen Sie den Überstand, und fügen Sie dann 45 ml D-PBS hinzu, um die Zellen erneut auszusetzen. Zentrifuge bei 400 x g für 10 min bei 4 °C.
      HINWEIS: Hierfür und die folgenden Zentrifugationsschritte sollte die Zentrifugenbremse eingeschaltet werden. Da die Zellpellets dicht sind, fügen Sie 1-2 ml D-PBS hinzu, um die Pellets vorsichtig wieder aufzuhängen, und fügen Sie dann D-PBS zu 45 ml hinzu.
    7. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 5 ml D-PBS erneut aus, und zählen Sie die lebenden Zellen mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode.
    8. Nachdem Sie die für die Erweiterung erforderlichen MNCs beiseite gelegt haben, frieren Sie die verbleibenden Zellen für die zukünftige Verwendung ein.
      HINWEIS: Mindestens 5 x 106 MNCs können in einer Durchstechflasche mit 1 ml Gefriermedium eingefroren werden (Materialtabelle). Das Protokoll kann hier angehalten werden.
  4. Ausbau von MNCs
    1. Am Tag -14 werden MNCs mit einer Dichte von 2-3 x 106 Zellen pro Milliliter in einem Brunnen mit sechs Wellplatten mit 1,5 ml vorgewärmtem (37 °C) MNC-Medium aussaat. Bei 37 °C inkubieren, 5% CO2 für 2 Tage.
    2. Am Tag -11 die Zellen und das Medium mit einer sterilisierten Pipette sammeln und in ein neues 15 ml konisches Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml vorgewärmtem (37 °C) MNC-Medium wieder auf.
    3. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau. Samen Sie die MNCs mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen pro Milliliter in einem vorgewärmten MNC-Medium und inkubieren Sie bei 37 °C, 5% CO2 für 3 Tage.
      HINWEIS: Es wird erwartet, dass die Gesamtzahl der Zellen am Tag -11 abnehmen kann.
    4. Wiederholen Sie am Tag -8 die Schritte 1.4.2-1.4.3 und bekultigen Sie die Zellen für 3 Tage.
    5. Wiederholen Sie am Tag -4 die Schritte 1.4.2-1.4.3 und bekultigen Sie die Zellen für 3 Tage.
      HINWEIS: Nach 14 Tagen Kultur sollte eine gleiche oder größere Anzahl von MNCs in der Kultur verbleiben.

2. Umprogrammierung von PBMNCs auf iNSCs durch SeV-Infektion

  1. Vorbereitung von Lösungs- und Kulturmedium
    1. Bereiten Sie eine Poly-D-Lysin (PDL) Stofflösung vor, indem Sie 100 mgPDL mit 100 ml H2 O auf eine Konzentration von 1 mg/ml auflösen. Bei -20 °C in 1 ml Aliquots lagern.
    2. Bereiten Sie eine Insulin-Stammlösung vor, indem Sie 100 mg Insulin in 20 ml von 0,01 N HCl auf eine Konzentration von 5 mg/ml auflösen. Bei -20 °C in 1 ml Aliquots lagern.
    3. Um 200 ml iNSC Basalmedium vorzubereiten, kombinieren Sie 96 ml DMEM-F12 und 96 ml Basismedium (Materialtabelle) mit 2 ml 100x Glutamin-Stammlösung, 2 ml nicht essentieller Aminosäure (NEAA), 2 ml N2-Ergänzung und 2 ml B27-Ergänzung. Fügen Sie vor der Anwendung 10 ng/ml rekombinanten humanen Leukämie-Hemmfaktor, 3 M CHIR99021 und 2 M SB431542 hinzu. Filtern Sie das Medium und lagern Sie es bei 4 °C.
      HINWEIS: Verwenden Sie das Medium innerhalb von 2 Wochen. Fügen Sie den rekombinanten humanen Leukämie-Hemmfaktor CHIR99021 und SB431542 unmittelbar vor der Anwendung hinzu.
  2. Neuprogrammierung von PBMNCs auf iNSCs durch SeV-Infektion
    1. Ultraviolett-sterilisieren Sie eine saubere Bank vor der Verwendung. Sterilisieren Sie alle Oberflächen und Geräte mit 75% Alkohol. Sterilisieren Sie alle Tipps mit einem Autoklaven.
    2. Am Tag 0 die Zellen im MNC-Medium sammeln und in ein 15 ml konisches Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 1 ml vorgewärmtem MNC-Medium wieder auf.
    3. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau. Die Zellen mit vorgewärmten (37 °C) MNC-Medium auf eine Konzentration von 2 x 105 Zellen pro Brunnen in 24-Well-Platten wieder aufhängen.
    4. Nachdem Sie die SeV-Rohre aus der Lagerung von -80 °C entfernt haben, die SeV-haltigen Rohre in 37 °C Wasserbad für 5-10 s auftauen lassen und sie dann bei RT auftauen lassen. Nach dem Auftauen sofort auf Eis legen.
    5. Fügen Sie die SeV-Codierung humanKlf4, Oct3/4, SOX2 und c-MyC zu den Brunnen, bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10. Zentrifugenzellen mit Platten bei 1.000 x g für 30 min, um die Befestigung von Zellen zu erleichtern. Lassen Sie die Zellen und Überstand in den Platten. Legen Sie die Platten im Inkubator bei 37 °C, 5%CO2.
      VORSICHT: Alle Verfahren mit SeV müssen in einem Sicherheitsschrank durchgeführt werden, und alle Spitzen und Schläuche sollten vor der Entsorgung mit Ethanol oder Bleichmittel behandelt werden.
    6. Übertragen Sie am ersten Tag das Medium und die Zellen in ein 15 ml Zentrifugenrohr. Spülen Sie den Brunnen mit 1 ml MNC Medium. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und die Zellen mit 500 l frischem vorgewärmtem MNC-Medium in 24-Well-Platten wieder aufhängen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine 24-Well-Platte mit niedriger Befestigung, um die Befestigung von Zellen zu verhindern, bevor Sie PDL/Laminin plattieren.
    7. Am 2. Tag 1 ml 1 mg/ml PDL mit 19 ml D-PBS auf eine Konzentration von 50 g/ml verdünnen. 6-Well-Platten mit 50 g/ml PDL für mindestens 2 h bei RT beschichten.
    8. Verdünnen Sie 200 l 0,5 mg/ml Laminin mit 20 ml D-PBS auf eine Konzentration von 5 g/ml. Aspirieren Sie PDL in den 6-Well-Platten und trocknen Sie auf der vertikalen sauberen Bank.
    9. 6-Well-Platten mit 5 g/ml Laminin beschichten und für 4-6 h bei 37 °C inkubieren. Waschen Sie vor der Anwendung mit D-PBS.
    10. Am 3. Tag die in Schritt 2.2.6 in iNSC-Medium erhaltenen Transduced-Zellen auf PDL/lamininbeschichteten 6-Well-Platten.
      HINWEIS: Bewegen Sie die Platten bei Bedarf vorsichtig, nachdem die Zellen auf PDL/Laminin-beschichteten Platten platziert wurden, um die Befestigung der Zellen nicht zu stören.
    11. Am 5. Tag 1 ml vorgewärmtes (37 °C) iNSC-Medium in jedem Brunnen in 6-Well-Platten sanft hinzufügen.
      HINWEIS: Es wird erwartet, dass die Zellen einen drastischen Tod erleiden (>60%).
    12. Am 7. Tag 1 ml vorgewärmtes (37 °C) iNSC-Medium in jedem Brunnen in 6-Well-Platten sanft hinzufügen.
    13. Ersetzen Sie vom 9. bis zum 28. Tag täglich ein frisches vorgewärmtes (37 °C) iNSC Medium. Überwachen Sie die Entstehung von iNSC-Kolonien. Wählen und übertragen Sie iNSC-Klone zur Erweiterung in ca. 2-3 Wochen. Nehmen Sie Kolonien mit entsprechender Morphologie mit verbrannten Glaspipetten auf, ausgenommen eventuell kontaminierende Zellen, und saugen Sie die Kolonien mit 200 L-Spitzen an.
      HINWEIS: Die charakterisierten iNSCs können für die zukünftige Verwendung mit 2-5 Kolonien in einer Durchstechflasche eingefroren werden. Das Gefriermedium umfasst serumfreies Basalmedium (Materialtabelle) und Dimethylsulfoxid, das im Verhältnis 9:1 gemischt wird und unmittelbar vor Gebrauch zubereitet werden sollte. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

3. Differenzierung von iNSCs zu dopaminergen Neuronen

  1. Vorbereitung von Lösungs- und Kulturmedium
    1. Bereiten Sie 200 ml iNSC Differenzierung Basalmedium durch Kombination von 192 ml DMEM-F12 mit 2 ml 100x Glutamin-Lagerlösung, 2 ml NEAA, 2 ml N2-Ergänzung und 2 ml B27-Ergänzung.
      HINWEIS: Verwenden Sie das Medium innerhalb von 2 Wochen.
    2. Bereiten Sie iNSC Differenzierungsstufe I Medium vor, indem Sie das iNSC-Differenzierungs-Basalmedium mit 1 'M SAG1 und 100 ng /mL FGF8b ergänzen.
      HINWEIS: Verwenden Sie das Medium innerhalb von 2 Wochen.
    3. Vorbereiten der iNSC-Differenzierungsstufe II Medium durch Ergänzung des iNSC-Differenzierungsbasalmediums mit 0,5 mM zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP), 0,2 mM Ascorbinsäure, 10 M DAPT, 10 ng/mL gehirnabgeleitetem neurotrophen Faktor (BDNF), 10 ng/ml glial abgeleitet neutrophischen Faktor (GDNF) und 1 ng/ml transformierender Wachstumsfaktor III (TGF-III).
      HINWEIS: Verwenden Sie das Medium innerhalb von 2 Wochen.
  2. Beschichtung der Kulturgerichte
    1. Ultraviolett-sterilisieren Sie eine saubere Bank vor der Verwendung. Sterilisieren Sie alle Oberflächen und Geräte mit 75% Alkohol. Sterilisieren Sie alle Tipps mit einem Autoklaven.
    2. Bei PDL-Beschichtung mindestens einen Tag vor der Neubeschichtung der Zellen 1 ml 1 mg/ml PDL mit 19 ml D-PBS auf eine Konzentration von 50 g/ml verdünnen. Mantel 12 mm Glas abdeckunglippen, die mit 75% Alkohol in den 24-Well-Platten mit 50 'g/mL PDL bei RT für mindestens 2 h sterilisiert wurden.
    3. Bei Lamininbeschichtung 200 l 0,5 mg/ml Laminin mit 20 ml D-PBS auf eine Konzentration von 5 g/ml verdünnen. PDL aspirieren und die Brunnen in der sauberen Bank trocknen. Die 12 mm Abdeckungen mit 5 g/ml Laminin beschichten und für 4-6 h bei 37 °C inkubieren. Waschen Sie vor der Anwendung mit D-PBS.
  3. Durchgangszellen zur Differenzierung.
    1. Wenn der Zusammenfluss von kultivierten iNSCs 70-90% erreicht, aspirieren Sie das Medium von der Kulturplatte und fügen Sie 1 ml D-PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. Fügen Sie 1 ml vorgewärmtes (37 °C) Zelldissoziationsreagenz (Materialtabelle) pro Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 3 min, um die Zellen zu dissoziieren.
    2. Nach der Inkubation für 3 min sind die Zellen halbschwebend geworden; Fügen Sie 3 ml vorgewärmte (37 °C) DMEM-F12 Medium pro Bohrkörper und Pipettenzellen nach oben und unten hinzu, um Zellpellets in einzelne Zellen zu dissoziieren.
    3. Übertragen Sie Zellen in ein 15 ml konisches Rohr und Zentrifugen bei 250 x g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen mit dem entsprechenden Volumen des vorgewärmten (37 °C) iNSC Mediums entsprechend der Anzahl der Zellen wieder auf.
    4. Zählen Sie die Zellen mit der Trypan Blue-Ausschlussmethode. Platte 5 x 103 Zellen pro 12 mm Glasabdeckung in 24-Well-Platten und inkubieren bei 37 °C, 5% CO2 .
  4. Unterscheiden Sie iNSCs in dopaminerge Neuronen.
    1. Beginnen Sie die Differenzierung 24 h nach der Neubeschichtung der Zellen auf PDL/lamininbeschichtete Abdeckungen. Aspirieren Kulturmedium, waschen Zellen einmal mit D-PBS, und fügen Sie dann 600 l vorgewärmte Differenzierung Stufe I Mittel proBrunnen in 24-Well-Platten und inkubieren bei 37 °C, 5% CO2 .
    2. Wechseln Sie das Medium jeden Tag von Tag 1 bis Tag 10 während der ersten Stufe der Differenzierung.
    3. An Tag 10, aspirieren Sie das Kulturmedium, und waschen Zellen einmal mit D-PBS. Fügen Sie 600 l vorgewärmte (37 °C) Differenzierungsstufe II medium pro Brunnen in 24-Well-Platten hinzu und brüten bei 37 °C, 5%CO2.
    4. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag von Tag 11 auf Tag 25 während der zweiten Stufe der Differenzierung. Die differenzierten Zellen können durch Paraformaldehyd zu verschiedenen Zeitpunkten für die Analyse fixiert werden.
    5. Für immunfluoreszierende Färbung die Zellen mit D-PBS dreimal sanft zu ausgewählten Zeitpunkten innerhalb des Differenzierungstages 11 bis 25 waschen.
    6. Pipette 300 l des nichtionischen Tensids(Materialtabelle) in 100 ml PBS, um ein 0,3% nichtionisches Tensid in PBS herzustellen.
      VORSICHT: Nichtionisches Tensid ist durch Hautkontakt und Inhalation giftig.
    7. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 min bei RT. Dann mit 0,3% in PBS dreimal waschen.
      VORSICHT: Paraformaldehyd ist durch Hautkontakt und Inhalation giftig.
    8. Blockieren Sie die Zellen um 3% Eselserum für 2 h bei RT.
    9. Den primären Antikörper in 1% Eselserum in einer angemessenen Konzentration verdünnen und sanft trituieren, um es zu mischen. Fügen Sie 300 l der primären Antikörperlösung zu jedem Brunnen der 24-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C über Nacht. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,3% nichtionischem Tensid in PBS.
    10. Den sekundären Antikörper in 1% Eselserum in einer angemessenen Konzentration verdünnen und sanft trituieren, um es zu mischen. Fügen Sie 300 l der sekundären Antikörperlösung zu jedem Brunnen der 24-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei RT für 2 h, vor Licht geschützt.
    11. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,3% nichtionischem Tensid in PBS. 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) mit PBS mit 1:500 Verdünnung verdünnen. Inkubieren Sie die Zellen in jeder Bohrung der 24-Well-Platte mit 300 l verdünntem DAPI für 15 min bei RT, geschützt vor Licht. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,3% nichtionischem Tensid in PBS.
    12. Nehmen Sie vorsichtig die Abdeckungen aus den Brunnen der Platten mit Zange. Trocken im Dunkeln über Nacht am RT. Mount unter einem Fluoreszenzmikroskop.

4. Etablierung einseitiger 6-Hyroxydopamin (6-OHDA)-lesioned PD-Mausmodelle

  1. Um PD-Mausmodelle für die Zelltransplantation zu generieren, verwenden Sie erwachsene männliche SCID-beige-Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g für eine 6-OHDA-Injektion.
  2. Vorbereitung von Medikamenten für die Chirurgie
    1. Bereiten Sie eine 0,2% Ascorbinsäurelösung vor, indem Man 0,2 g Ascorbinsäure in 100 ml sterilisierte Saline auflöst (0,9%) und bei -80 °C bis zur Verwendung lagern. Am Tag der Operation 0,2% Ascorbinsäurelösung um das 10-fache verdünnen, um eine 0,02% Ascorbinsäurelösung zu erhalten.
      HINWEIS: Ascorbinsäure wird zugesetzt, um die Oxidation von 6-OHDA in eine inaktive Form zu verhindern.
    2. Um eine 6-OHDA-Lösung vorzubereiten, wiegen Sie die entsprechende Menge von 6-OHDA in ein sterilisiertes 1 ml-Rohr und fügen Sie dann ein Volumen von 0,02 % Ascorbinsäure hinzu, um eine Lösung mit 5 g/l 6-OHDA herzustellen. Wirbeln Sie die Mischung, bis sie gelöst wird. Legen Sie den 6-OHDA bis zum Gebrauch auf Eis.
      HINWEIS: 6-OHDA ist temperatur- und lichtempfindlich. Achten Sie darauf, die Lösung vor Licht zu schützen und sie vor dem Gebrauch auf Eis zu halten.
  3. Bereiten Sie sterilisierte chirurgische Geräte durch Autoklavieren vor der Operation vor. Reinigen Sie alle Geräte und Oberflächen mit Ethanol, wenn Sie den stereotaxic Rahmen einrichten. Richten Sie einen Mausrückgewinnungskäfig unter einer Heizlampe ein.
  4. Führen Sie eine Operation durch, um einseitige 6-OHDA-litionsed Mausmodelle zu etablieren.
    1. Wiegen Sie jede Maus, erfassen Sie das Gewicht und berechnen Sie die Menge des Medikaments, das verabreicht werden muss. Jede Maus erhält 0,5 mg/kg Atropin 20 min vor dem Betrieb. Anästhesisieren Sie die Maus mit 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin.
    2. 0,5 mg/kg Atropin durch intraperitoneale Injektion verabreichen.
    3. Anästhetisieren Sie die Maus mit 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin durch intraperitoneale Injektion 20 min nach Verabreichung von Atropin.
    4. Setzen Sie die Maus in eine geschlossene Kammer. Nach 3-5 min wird die Maus tief beästhetisiert, ohne auf hintere Bein-Pinch zu reagieren.
      HINWEIS: Es wird erwartet, dass die Maus, die Anästhesie erhalten hat, eine Erregungsphase erleben würde.
    5. Rasieren Sie den Kopf der Maus und wenden Sie Erythromycin Augensalbe auf die Augen der Maus zum Schutz vor der Entwicklung von Hornhautgeschwüren.
    6. Legen Sie die Maus auf das stereotaxic Gerät. Fixieren Sie die Maus mit Schneidezähnen zuerst. Legen Sie die Ohrmuscheln richtig ein, um den Mauskopf in einer flachen und sicheren Position zu machen.
    7. Sterilisieren Sie den Kopf der Maus mit Povidon Jod und Isopropylalkohol. Schneiden Sie einen sagittalen Schnitt (ca. 1,5 cm) auf der Kopfhaut mit einer Skalpellklinge und setzen Sie den Schädel frei. Stellen Sie die Schneidezähne und Die Ohrenstäbe ein, um den Höhenunterschied zwischen Bregma und Lambda auf weniger als 0,1 mm zu reduzieren.
      HINWEIS: Die Maus bregma befindet sich an der Kreuzung von koronalen und sagittalen Nähten, und Lambda ist an der Kreuzung von Lambdoid und sagittal Nähte.
    8. Bewegen Sie sich langsam und senken Sie die Spitze der Nadel in Richtung Bregma und behandeln Sie das Bregma als Nullpunkt. Bewegen Sie die Spitze an eine Position mit Koordinaten von A/P +0,5 mm, M/L -2,1 mm relativ zu Bregma. Ziehen Sie die Spitze zurück und markieren Sie den Punkt. Graben Sie ein kleines Loch in den Schädel.
    9. Extrahieren Sie 2 l von 5 g/l 6-OHDA-Lösung in die Mikrospritze (Materialtabelle). Bringen Sie die Nadel an den markierten Punkt zurück, und legen Sie die Nadel auf D/V -3,2 mm ein.
    10. Injizieren Sie 2 l von 5 g/l 6-OHDA-Lösung (insgesamt 10 g) mit einer Rate von 1 l/min. Nachdem die Injektion von 6-OHDA abgeschlossen ist, lassen Sie die Nadel für weitere 5 min an Ort und Stelle. Ziehen Sie dann die Injektionsnadel langsam zurück.
    11. Schließen Sie den Schnitt mit Nähten und wenden Sie Erythromycin Augensalbe auf die Augen der Maus. 0,5 ml Salin subkutan liefern, um Austrocknung zu verhindern, und eine Antibiotikumsalbe direkt auf die genähte Haut auftragen.
    12. Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaxic Apparat und legen Sie sie in den Wiederherstellungskäfig. Setzen Sie die Maus zurück und ermöglichen Sie den Zugang zu Nahrung und Wasser, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt. Behandeln Sie die Maus mit Schmerzmittel in Trinkwasser täglich nach der Operation für 2-3 Tage, und eine empfohlene Dosierung von Ibuprofen ist 0,03 mg/g Körpergewicht pro Tag.
    13. Überprüfen Sie die Maus täglich nach der Operation.

5. Verhaltensbeurteilung nach einseitiger 6-OHDA-Läsion

  1. Zwei bis drei Wochen nach der Operation, führen Sie Verhaltensbeurteilung, um PD-Symptome zu schätzen. Wiegen Sie jede Maus, erfassen Sie ihr Gewicht und berechnen Sie die Menge des Medikaments, das verabreicht werden sollte (0,5 mg/kg Apomorphin vor der Bewertung).
  2. 0,5 mg/kg Apomorphin vor der Bewertung mit subkutaner Injektion verabreichen und die Maus in einen Glaszylinder geben.
  3. Zählen Sie nach einer 5-minütigen Gewöhnungszeit die Anzahl der kontralateralen und ipsilateralen Rotationen relativ zur Läsionsseite pro Minute und zeichnen ihre Aktivität mit einer Videokamera auf.
  4. Mäuse mit kontralateralen Minus ipsilateralen Rotationen >7 U/min gelten als erfolgreich läsioniert und werden als Kandidaten für Zelltransplantationsexperimente ausgewählt. Bringen Sie die Mäuse nach einer 30-min-Pause in die Gehäusekäfige zurück.
    HINWEIS: Wenn die Maus erfolgreich läsioned wurde, zeigt 6-OHDA injizierte Maus eine größere Neigung beim Wenden in Richtung kontralaterale Seite, da der DA-Agonist das überempfindliche denervierte Striatum der läsionierten Seite überwiegend aktiviert.
  5. Führen Sie die Verhaltensbeurteilung eine Woche vor und 2, 4, 6, 8, 12, 16 Wochen nach der Zelltransplantation durch.

6. Zelltransplantation von DA-Vorläufern

  1. Bereiten Sie die Zellsuspension für die Transplantation vor. Für die Zellentransplantation 2 x 105 DA-Vorläufer, gemischt mit D10- und D13-DA-Vorläufern, im Verhältnis 1:7 in 4 l von 5 gL-1 Glukose in ausgewogener Salzlösung(Materialtabelle)des Transplantationspuffers aussetzen.
  2. Führen Sie eine Zelltransplantationsoperation nach den in Abschnitt 4.4 beschriebenen Verfahren durch, mit der Ausnahme, dass 6-OHDA durch DA-Vorläuferzellsuspension oder Puffer ersetzt wird.
  3. Führen Sie die Verhaltensbeurteilung 2, 4, 6, 8, 12, 16 Wochen nach der Zelltransplantation von DA-Vorläufern nach den in Abschnitt 5 beschriebenen Verfahren durch. Zählen Sie die Anzahl der apomorphininduzierten kontralateralen Rotationen relativ zur Läsionsseite pro Minute und zeichnen Sie ihre Aktivität mit einer Videokamera auf.
    HINWEIS: Nach der Transplantation deutet eine reduzierte Rate kontralateraler Rotationen auf eine verbesserte Motorfunktion hin.
  4. Bei 4, 8 ,12 und 16 Wochen nach der Zelltransplantation, durchdringen Sie die Maus unter tiefen Anästhesie mit 4% Paraformaldehyd, bis der Körper der Maus steif wird und die Leber der Maus blass wird.
  5. Trennen Sie das Gehirn der Maus sanft und setzen Sie das Gehirn in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C über Nacht.
  6. Am zweiten Tag, setzen Sie das Gehirn in 30% Saccharose für Dehydrierung, bis das Gehirn sinkt auf den Boden.
  7. Schneiden Sie die Gehirne mit einer Dicke von 40 m mit einem gefrierenden Mikrotom.
  8. Führen Sie eine Immunfärbung durch, wie in den Schritten 3.4.5-3.4.12 beschrieben.

Ergebnisse

Hier berichten wir über ein Protokoll, das verschiedene Stadien der iNSC-DA-Zelltherapie zur Behandlung von PD-Modellen abdeckt. Erstens wurden PBMNCs isoliert und erweitert und durch SeV-Infektion in iNSCs umprogrammiert. Eine schematische Darstellung der Prozeduren mit PBMNC-Erweiterung und iNSC-Induktion ist in Abbildung 1dargestellt. Am Tag -14 wurden PBMNCs mit einem Dichtegradientenmedium (Materialtabelle )isoliert. Vor der Zentrifugation wurden mit PBS und dem Dichte...

Diskussion

Hier präsentierten wir ein Protokoll, das verschiedene Stadien der iNSC-DA-Zelltherapie für PD-Modelle abdeckte. Zu den kritischen Aspekten dieses Protokolls gehören: (1) Isolierung und Erweiterung von PBMNCs und Umprogrammierung von PBMNCs in iNSCs durch SeV-Infektion, (2) Differenzierung von iNSCs zu DA-Neuronen, (3) Etablierung einseitiger 6-OHDA-verleumderter PD-Mausmodelle und Verhaltens- und (4) Zelltransplantation von DA-Vorstufen und Verhaltensbeurteilung.

In diesem Protokoll umfass...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), Municipal Beijing Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Support Project of High-Level Teachers in Beijing Municipal Universities in the period of 13th Five-year Plan (CIT & TCD20180333), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Beijing Municipal Health Commission Fund (PXM 2018_026283_000002), Beijing One Hundred, Thousand, and Ten Thousand Talents Fund (2018A03), Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201706) Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
15-ml conical tubeCorning430052
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145Toxic for inhalation and skin contact
24-well plateCorning3337
50-ml conical tube Corning430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
6-well plateCorning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01Cell dissociation reagent
ApomorphineSigma-AldrichA4393
Ascorbic acidSigma-AldrichA92902Toxic with skin contact 
B27 supplement Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparinBD367871
BSAyisheng36106es60Fetal bovine serum
cAMPSigma-AldrichD0627Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2ZENOAQ100mlUsed as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrateInvitrogen11905031
CHIR99021Gene Operation04-0004
CoverslipFisher25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
DexamethasoneSigma-AldrichD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
Donkey serumJackson017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UGHuman Erythropoietin
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P=1.077, density gradient medium
GDNFPeprotech450-10Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAXInvitrogen21051024100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factorMillporeLIF1010
Human recombinant SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UGHuman insulin-like growth factor 
IL-3Peprotech200-03-10UGHuman interleukin 3
IMDMGibco215056-023Iscove's modified Dulbecco's medium
InsulinRoche 12585014
ITS-XInvitrogen51500-056Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacementGibco10828028Serum free basal medium
LamininRoche 11243217001
MicrosyringeHamilton7653-01
N2 supplement Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050Non-essential amino acid
NeurobasalGibco10888Basic medium
PDLSigma-AldrichP7280Poly-D-lysine
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542Gene Operation04-0010-10mgStore from light at -20?
Sendai virusLife TechnologiesMAN0009378
Sucrosebaiaoshengke
TGFβ?Peprotech100-36ETransforming growth factor  β?
TransferrinR&D Systems2914-HT-100G
Triton X 100baiaoshengkeNonionic surfactant
Trypan blueGibcoT10282
XylazineSigma-AldrichX1126

Referenzen

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