Natürliche Produktentdeckung mit LC-MS/MS Diagnostic Fragmentierungs-Filterung: Anwendung für die Mikrocystist-Analyse

Zusammenfassung

Die in MZmine implementierte Diagnostik-Fragmentierungsfilterung ist ein eleganter, nach der Übernahme eingesetzter Ansatz, um LC-MS/MS-Datensätze für ganze Klassen bekannter und unbekannter Naturprodukte zu überprüfen. Dieses Tool sucht MS/MS-Spektren nach Produkt-Ionen und/oder neutralen Verlusten, die der Analyst als diagnostisch für die gesamte Klasse von Verbindungen definiert hat.

Zusammenfassung

Natürliche Produkte werden oft als Mischungen strukturell ähnlicher Verbindungen und nicht als eine einzige Verbindung biosynthetisiert. Aufgrund ihrer gemeinsamen Strukturmerkmale durchlaufen viele Verbindungen innerhalb der gleichen Klasse eine ähnliche MS/MS-Fragmentierung und haben mehrere identische Produktideonen und/oder neutrale Verluste. Der Zweck der diagnostischen Fragmentierungsfilterung (DFF) ist es, alle Verbindungen einer bestimmten Klasse in einem komplexen Extrakt effizient zu erkennen, indem nicht gezielte LC-MS/MS-Datensätze für MS/MS-Spektren geprüft werden, die klassenspezifische Produktzionen und/oder neutrale Verluste enthalten. Diese Methode basiert auf einem DFF-Modul, das innerhalb der Open-Source-MZmine-Plattform implementiert wird und Probenextrakte durch datenabhängige Erfassung eines hochauflösenden Massenspektrometers wie Quadrupole Orbitrap oder Quadrupole Flugmasse analysiert. Analysatoren. Die Haupteinschränkung dieses Ansatzes ist, dass der Analyst zunächst definieren muss, welche Produktzionen and/oder neutrale Verluste spezifisch für die angestrebte Klasse von Naturprodukten sind. Die DFF ermöglicht die anschließende Entdeckung aller verwandten Naturprodukte innerhalb einer komplexen Probe, einschließlich neuer Verbindungen. In dieser Arbeit zeigen wir die Wirksamkeit der DFF, indem wir Extrakte von Microcystis aeruginosa, einer prominenten schädlichen Algenblüte, die Cyanobakterien verursacht, für die Herstellung von Mikrozystinen untersuchen.

Einleitung

Die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) ist eine weit verbreitete Massenspektrometrie-Methode, bei der ein Vorläuferion isoliert und durch die Anwendung von Aktivierungsenergie wie kollisionsbedingte Dissoziation (CID)1 eine Fragmentierung induziert wird. Die Art und Weise, wie ein Ionenfragmente eng mit seiner molekularen Struktur verbunden ist. Natürliche Produkte werden oft als Mischungen strukturell ähnlicher Verbindungen und nicht als eine einzige einzigartige Chemikalie²biosynthetisiert. Als solche teilen strukturell verwandte Verbindungen, die zur gleichen biosynthetischen Klasse gehören, oft wichtige MS/MS-Fragmentierungsmerkmale, einschließlich gemeinsamer Produktzionen und/oder neutraler Verluste. Die Fähigkeit, komplexe Proben auf Verbindungen zu untersuchen, die klassenspezifische Produkt-Ionen and/oder neutrale Verluste^besitzen, ist eine leistungsfähige Strategie, um ganze Klassen von Verbindungen zu erkennen, was möglicherweise zur Entdeckung neuer natürlicher Produkte führt 3^{, 4 , 5 , 6}. Massenspektrometrie-Methoden wie das neutrale Verlustscannen und das Vorläuferkonten von Ionen, die auf Instrumenten mit niedriger Auflösung durchgeführt werden, lassen seit Jahrzehnten Ionen mit den gleichen neutralen Verlust-oder Produktzonen erkennen. Die spezifischen Ionen oder Übergänge mussten jedoch vor der Durchführung der Experimente definiert werden. Da hochauflösende Massenspektrometer in Forschungslabors immer beliebter geworden sind, werden komplexe Proben heute häufig mit nicht zielgerichteten, datenabhängigen Akquisitionsmethoden (DDA) untersucht. Im Gegensatz zum traditionellen neutralen Verlust-und Vorläuferkonten lassen sich durch die Nachbeschaffungsanalyse 7 strukturbezogene Verbindungen^{identifizieren}. In dieser Arbeit zeigen wir eine Strategie, die wir als diagnostische Fragmentierungsfilterung (DFF) 5^{, 6 entwickelt}haben, einen geradlinigen und benutzerfreundlichen Ansatz, um ganze Verbindungen in komplexen Matrizen zu erkennen. Dieses DFF-Modul wurde in der Open-Source-Plattform MZmine 2 implementiert und ist über den Download von MZmine 2.38 oder neueren Versionen verfügbar. DFF ermöglicht es Nutzern, DDA-Datensätze für MS/MS-Spektren, die Produkt-Ionen (s) and/oder neutrale Verluste (es) enthalten, die für ganze Klassen von Verbindungen diagnostiziert sind, effizient zu durchsuchen. Eine Begrenzung der DFF sind charakteristische Produktideonen und/oder neutrale Verluste für eine Klasse von Verbindungen muss vom Analytiker definiert werden.

Zum Beispiel, jedes der mehr als 60 verschiedenen Fumonisin Mykotoxineidentifiziert 8,9^besitzen eine trikarballylische Seitenkette,die ein m/157.0142 (C₆H 5 O₅-) Produkt-Ion erzeugt auf Fragmentierung der [M-H]^-Ion 4. Daher können alle vermeintlichen Fumonisine einer Probe mit DFF durch das Screening aller MS/MS-Spektren in einem DDA-Datensatz, die das markante m/157.0142-Produkt enthalten, erkannt werden. In ähnlicher Weise können sulvated Verbindungen durch das Screening von DDA-Datensätzen auf MS/MS-Spektren, die einen diagnoseinen-neutralen Verlust von 79.9574 Da (SO₃)³enthalten, nachgewiesen werden. Dieser Ansatz wurde auch erfolgreich angewendet, um neue zyklische Peptide 5 und Naturprodukte zu entdecken, die Tryptophan oder Phenylalanin-Rückstände6 enthalten.

Um die Wirksamkeit der DFF und ihre Benutzerfreundlichkeit innerhalb der MZmine-Plattform¹⁰zu demonstrieren, haben wir diesen Ansatz bei der Analyse von Mikrozystinen (MCs) angewandt; Eine Klasse von über 240 strukturell verwandten Giftstoffen, die von Süßwassercyanobakterien^11,12,13produziert werden.

Die am häufigsten gemeldeten Cyanotoxine sind MCs, wobei die MC-LR (Leucine [L]/Arginin [R]) kongener am häufigsten untersucht wird (Abbildung1). Die MCs sind monozyklische nicht-ribosomale Heptapeptide, biosynthetisiert durch mehrere Cyanobakterien-Gattungen , darunter Microcystis, Anabaena, Nostoc und Planktothrix^12,13. Die MCs bestehen aus fünf gemeinsamen Rückständen und zwei variablen Positionen, die mit L-Aminosäuren belegtwerden. Fast alle MCs besitzen eine charakteristische β-Aminosäure 3amino-9-Methoxy-2, 6, 8-Trimethyl-10-Phenyldezen-4,6-Dieno-Säure (Adda) Rückstände an Position 5^11.  Die MS/MS-Fragmentierungswege der MCs sindgut beschrieben 14^,15; Die Adda-Reste sind verantwortlich für das prominente MS- /MS-Produkt Ion, m/135.0803⁺ (C 9 H 11 O⁺⁾sowie andere Produktzionen wie m/163.1114 + (C₁₁H 15⁾ . O⁺) (Abbildung 2). Mit diesen diagnostischen Ionen können nicht zielgerichtete DDA-Datensätze von Microcystis aeruginosa-Kellinextrakten für alle vorhandenen Mikrocystine untersucht werden, sofern die Mikrozystine eine Adda-Rückstände aufweisen.

Protokoll

1. Vorbereitung der nicht zielgerichteten Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS Datensätze

Hinweis: Die DFF kann mit jedem hochauflösenden Massenspektrometer und Analysemethode durchgeführt werden, die für eine Zielklasse von Analyten optimiert sind. MC-optimierte LC-MS/MS-Bedingungen auf Orbitrap-Massenspektrometer sind in der Materiallisteaufgeführt.

1. Download von MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
   Hinweis: Beispieldaten CPCC300.raw finden Sie auf https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.
   1. Unter dem Drop-Down-Menü von Raw wählen Sie die Option " Raw-Datenimport ".
   2. Wählen Sie die zu analysierenden Daten aus. Einzelne oder mehrere Dateien können importiert werden.
2. (Optional) Wenn das Datenformat des Anbieters nicht von MZmine unterstützt wird, verwenden Sie Proteowizard¹⁶ , um zentroidierte .mzmml-Dateien zu erzeugen.
   1. Wählen Sie den Peak Picking Filter, um den von Heranern gelieferten Zentroiding-Algorithmus anzuwenden.

2. Diagnostische Fragmentierung Filterung von importierten DDA-Dateien

1. Mit dem Cursor wählen Sie die Datendatei (n) in der Spalte Raw-Dateien des Hauptbildschirms MZmine aus.
2. Wählen Sie im Menü Visualisierung Drop-Down-Menü die Option Diagnostische Fragmentierung .
3. In der DFF-Dialogbox, die erscheint (Abbildung 3), geben Sie folgende Optionen ein:
   1. Die Aufbewahrungszeit – die Auto-Reichweite verwenden oder den Bereich der Aufbewahrungszeiten in Minuten festlegen, in denen die angestrebte Klasse von Analyten ausläuft.
   2. Vorläufer m/-verwenden Sie den Autobereich oder definieren Sie den m/z-Bereich der angestrebten Klasse von Analyten, einschließlich der Möglichkeit für mehrere geladene Verbindungen, wenn es angebracht ist.
   3. m/z Toleranz – Die erreichbare MS/MS-Massengenauigkeit des MSinstruments einfügen; 0,01 m/oder 3.0 ppm ist für eine Orbitrap-Plattform geeignet. Wenn nur diagnostische Produkt-Ionen untersucht werden, Eingabe 0,0 in die Option Diagnostik-neutraler Verlustwert (Da) . Umgekehrt, wenn nur diagnostische neutrale Verluste untersucht werden, Eingabe 0,0 in die Option Diagnostik-Produkt Ionen (m/z) .
   4. Diagnostik-Produkt-Ionen (m/z) – geben Sie das klassenspezifische Produkt Ion (s) m/z. Trennen Sie mehrere Produkt-Ionen mit einem Komma.
      Hinweis: Das Einfügen mehrerer Produkt-Ionen visualisiert Spektren, die alle aufgeführten Produkt-Ionen enthalten.
   5. Diagnostisch-neutraler Verlustwert (Da) – geben Sie den klassenspezifischen neutralen Verlust (es) ein. Trennen Sie mehrere neutrale Verluste mit einem Komma.
      Hinweis: Die Einfügen mehrerer neutraler Verluste wird Spektren visualisieren, die alle aufgeführten neutralen Verluste enthalten. Die Eingabe von Diagnostik-Ionen und Neutralverlusten wird Spektren visualisieren, die alle Kriterien erfüllen.
   6. Minimale diagnostische Ionenintensität (% Basisspitze) – Als% des Basisgipfels der MS/MS-Spektren, definieren Sie die minimale Intensität für diagnostische Produkt-Ionen and/oder neutrale Verluste zu berücksichtigen.
   7. Peaklist-Ausgabedatei – Wählen Sie einen Pfad und Dateinamen aus, um die Ergebnisse auszugeben.
   8. Klicken Sie auf den OK-Button, um die DFF-Analyse zu starten. Eine DFF-Plot erscheint nach erfolgreichem Abschluss der oben genannten Schritte
      Hinweis: Es werden zwei .csv-Dateien erzeugt. {Peaklist output file} .csv contains the vorsor m/z, scan numbers, and Retentionszeiten of the scans. Dies kann in bestehenden MZmine-Modulen verwendet werden, einschließlich Rohdatenmethoden > Peak-Erkennung > gezielte Peak-Erkennung zur Erzeugung von extrahierten Ionenchromatogrammen von Vorläufern, die die definierten DFF-Kriterien erfüllten. {Peaklist output file} _ data.csv contains the preursor m/z, product ion m/z and Retentimes to allow generation of DFF-plots outside of MZmine.

3. Beispiel für die Mikrocystin-Analyse der DFF

1. Probenvorbereitung
   1. Sterilisieren 250 mL Erlenmeyer-Flaschen, die 30 mL steriler MA-Medien 17 oder andere Cyanobakterien-Wachstumsmedien (BG-11) enthalten, die mit einem Schaumstopper ausgestattet sind.
   2. Sterilisierte Wachstumsmedien mit einer Cyanobakterien-Kultur auf etwa 5 × 10^{5 Zellen} mL-¹ unter aseptischen Bedingungen. Die Zelldichte mit einem Hämozytometer überwachen. In diesem Beispiel wachsen M . aeruginosa Stamm CPCC300 photoautotrophisch bei 27 ° C, beleuchtet mit kühlem weißem Leuchtstofflicht (30 μE m^{-2 s-1} ) mit einem 12 h Licht: 12 h dunkles Regime. Wirbeln Sie die Zellen einmal täglich.
   3. Trennen Sie die Zellen nach 26 Tagen durch Vakuumfiltration durch Vakuumfiltration mit GF/C-Glasfaserfilterpapieren mit einem Durchmesser von 47 mm.
   4. Fügen Sie 3 ml 80% Methanol _(aq) in 14 mL-Reagenzglas (n) zu den geernteten Zellen hinzu.
   5. Die Reagenzgläser, die Zyanobakterien-Zellen für jeweils 30 s enthalten, wirbel und anschließend sondieren. Bewahren Sie die Reagenzgläser bei-20 ° C für 1 Stunde auf.
   6. Wiederholungsschritt 3.1.5 zwei zusätzliche Male, um die Zellen effektiv zu lärmen.
   7. Filtern Sie die daraus resultierenden Cyanobakterien-Zellextrakte (n) durch einen 0,22 μm PTFE-Spritzenfilter (n).
   8. Trockenextrakt (n) mit einem Verdampfer bei einer Temperatur von 30 ° C mit einem sanften Strom von Stickstoffgas. Bewahren Sie den Extrakt trocken bei-20 ° C bis zur LC-MS/MS-Analyse.
   9. Die getrockneten Rückstände mit 500 μL von 90% Methanol _(aq) und Wirbel für 30 s in einer Bernstein-HPLC-Vial vor der Analyse neu aufrichten.
2. Analysieren Sie den Cyanobakterien-Extrakt mit einer DDA-Akquisitionsmethode auf einem hochauflösenden Massenspektrometer.
   Hinweis: Die hier verwendeten optimierten LC-MS-Bedingungen für die MC-Analyse sind in der Materialtabelleaufgeführt.
3. Bereiten Sie die DDA-Datafile vor und importieren Sie in MZmine nach den Schritten 1.1 und 1.2.
4. Wählen Sie die Datenblätter aus und starten Sie die DFF-Module nach den Schritten 2.1-2.2.
5. Für die MC-Analyse verwenden Sie die folgenden Einstellungen innerhalb des DFF-Moduls (Abbildung 3).
   1. Aufbewahrungszeit – Geben Sie die Reichweite von 2,00 bis 6.00 min ein.
   2. Vorläuferin m/– Input m/z-Bereich von 430,00 bis 1200.00.
   3. m/z Toleranz – Die Toleranztoleranz von 0,01 m/oder 3,0 ppm.
   4. Diagnostikprodukt-Ionen (m/z ) – Input m/@ @
   5. Diagnostisch-neutraler Verlustwert (Da) – Input 0.0 , um zu definieren, dass keine diagnostischen neutralen Verluste verwendet werden.
   6. Minimale Diagnostik-Ionenintensität (% Basisspitze ) – Verwendung 15,00 als Mindestintensitätsschwelle
   7. Peaklist-Ausgabedatei – Definieren Sie die Ausgabedatei als putative _ MCs.csv.
6. Klicken Sie auf den OK-Button, um die DFF-Analyse zu starten. Eine DFF-Handlung (Abbildung 4) erscheint nach erfolgreichem Abschluss der oben genannten Schritte

Ergebnisse

Das DFF-Grundstück, das nach der Analyse von M. aeruginoosa CPCC300 erstellt wurde, wird in Abbildung4 gezeigt. Die x-Achse dieses Diagramms ist das m/z der Vorläufer-Ionen, die die definiertenDFF-Kriterien erfüllt haben, während die y--Achse den m/z aller Produktzionen innerhalb der MCs MS/MS-Spektren zeigt. Für diese Analyse wurden Vorläufer-Ionen im m/Bereich von 440-1200, Aufbewahrungszeiten zwischen 2,...

Diskussion

Die DFF ist eine einfache und schnelle Strategie zur Erkennung ganzer Klassen von Verbindungen, die insbesondere für die Entdeckung von Naturprodukten relevant sind. Der wichtigste Aspekt der DFF ist die Festlegung der spezifischen MS-MS-Fragmentierungskriterien für die angestrebte Klasse von Verbindungen. In diesem repräsentativen Beispiel wurde DFF verwendet, um alle Adda-Reste zu erkennen, die MCs enthalten, die in einem M. Aeruginosa-Kellagerextrakt vorhanden sind. Obwohl die überwiegende Mehrheit der MC...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanobacteria
Microcystis aeruginosaCPCC300	CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE	CPCC300	https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
Software
Proteowizard (software)		software	http://proteowizard.sourceforge.net/
Mzmine 2		software	http://mzmine.github.io/
LC-MS
Q-Exactive Orbitrap	Thermo	-	Equipped with HESI ionization source
1290 UHPLC	Agilent		Equipped with binary pump, autosampler, column compartment
C18 column	Agilent	959757-902	Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm)
Solvents
Optima LC-MS grade Methanol	Fisher	A456-4
OptimaLC-MS grade Acetonitrile	Fisher	A955-4
OptimaLC-MS grade Water	Fisher	W6-4
LC-MS grade Formic Acid	Fisher	A11710X1-AMP
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Centrifuge Sorvall Micro 21	Thermo Scientific	75-772-436
Other
Amber HPLC vials 2 mL/caps	Agilent	5182-0716/5182-0717
0.2-μm PTFE syringe filters	Pall Corp.	4521
Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters	Sigma-Aldrich	WHA1820047
Media
MA media (pH 8.6) ( quantity / L)			Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
Ca(NO3)·4H2O, 50 mg	Sigma-Aldrich	C2786
KNO3, 100 mg	Sigma-Aldrich	P8291
NaNO3, 50 mg	Sigma-Aldrich	S5022
Na2SO4, 40 mg	Sigma-Aldrich	S5640
MgCl2·6H20, 50 mg	Sigma-Aldrich	M2393
Sodium glycerophosphate, 100 mg	Sigma-Aldrich	G9422
H3BO3, 20 mg	Sigma-Aldrich	B6768
Bicine, 500 mg	Sigma-Aldrich	RES1151B-B7
	P(IV) metal solution, 5 mL
Bring the following to 1 L with ddH2O
NaEDTA·2HO	Sigma-Aldrich	E6635
FeCl3 ·6H2O	Sigma-Aldrich	236489
MnCl2·4H2O	Baker	2540
ZnCl2	Sigma-Aldrich	Z0152
CoCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Na2MoO4·2H2O	Baker	3764
Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution	Sigma-Aldrich	C3061-500mL