Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

Zusammenfassung

Beschrieben ist hier ein Protokoll, um die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssysteme zu untersuchen.

Zusammenfassung

Menschliche Darmmikroorganismen sind in letzter Zeit zu einem wichtigen Ziel der Forschung bei der Förderung der menschlichen Gesundheit und der Prävention von Krankheiten geworden. Daher sind Untersuchungen von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika (z.B. Medikamente und Präbiotika) und Darmmikrobiota zu einem wichtigen Forschungsthema geworden. In-vivo-Experimente mit menschlichen Freiwilligen sind jedoch aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen nicht ideal für solche Studien. Als Ergebnis wurden Tiermodelle verwendet, um diese Wechselwirkungen in vivo zu bewerten. Dennoch sind Tiermodellstudien nach wie vor durch bioethische Überlegungen begrenzt, zusätzlich zu unterschiedlichen Zusammensetzungen und Diversitäten von Mikrobiota bei Tieren und Menschen. Eine alternative Forschungsstrategie ist der Einsatz von Batch-Fermentationsexperimenten, die eine Bewertung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Darmmikrobiota in vitro ermöglichen. Zur Bewertung dieser Strategie wurden bifidobakterielle (Bif) Exopolysaccharide (EPS) als repräsentatives Xenobiotikum verwendet. Anschließend wurden die Wechselwirkungen zwischen Bif EPS und humaner Darmmikrobiota mit verschiedenen Methoden wie dünnschichtige Chromatographie (TLC), kompositorische Analyse der bakteriengemeinschaft mit 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und Gaschromatographie untersucht. von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssystemen vorgestellt. Wichtig ist, dieses Protokoll kann auch geändert werden, um allgemeine Wechselwirkungen zwischen anderen Endobiotika und Darmmikrobiota zu untersuchen.

Einleitung

Gut Mikrobiota spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion des menschlichen Darms und in der Wirtgesundheit. Folglich sind Darmmikrobiota in letzter Zeit ein wichtiges Ziel für die Prävention und Therapie von Krankheiten geworden¹. Darüber hinaus interagieren Darmbakterien mit Wirtsdarmzellen und regulieren grundlegende Wirtsprozesse, einschließlich stoffwechselnder Aktivitäten, Nährstoffverfügbarkeiten, Modulation des Immunsystems und sogar Gehirnfunktion und Entscheidungsfindung^2,3 . Endobiotika haben erhebliches Potenzial, die bakterielle Zusammensetzung und Vielfalt der Darmmikrobiota zu beeinflussen. So, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darm Mikrobiota haben zunehmende Forschungsaufmerksamkeit^{angezogen 4,5,6,7,8,9}.

Es ist schwierig, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und humaner Darmmikrobiota in vivo aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen zu bewerten. Zum Beispiel können Experimente, die die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen, nicht ohne Erlaubnis der Food and Drug Administration durchgeführt werden, und die Rekrutierung von Freiwilligen ist teuer. Daher werden für solche Untersuchungen häufig Tiermodelle verwendet. Die Verwendung von Tiermodellen ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Mikrobiotazusammensetzungen und Diversität in tier- und menschenverbundenen Gemeinschaften begrenzt. Eine alternative In-vitro-Methode zur Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota ist der Einsatz von Batch-Kulturexperimenten.

Exopolysaccharide (EPS) sind Präbiotika, die wesentlich zur Erhaltung der menschlichen Gesundheit beitragen¹⁰. Verschiedene EPS, die aus verschiedenen Monosaccharid-Zusammensetzungen und -Strukturen bestehen, können unterschiedliche Funktionen aufweisen. Frühere Analysen haben die Zusammensetzung der Bif EPS bestimmt, die das repräsentative Xenobiotikum sind, das in der aktuellen Studie¹¹ins Visier genommen wird. Die wirtassoziierten metabolischen Effekte wurden jedoch hinsichtlich der EPS-Zusammensetzung und -Vielfalt nicht berücksichtigt.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet die fäkale Mikrobiota von 12 Freiwilligen, um Bif EPS zu fermentieren. Die Dünnschichtchromatographie (TLC), die 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und die Gaschromatographie (GC) werden dann in Kombination verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen EPS und humaner Darmmikrobiota zu untersuchen. Deutliche Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu In-vivo-Experimenten sind seine niedrigen Kosten und die Vermeidung von störenden Effekten aus dem Stoffwechsel des Wirts. Darüber hinaus kann das beschriebene Protokoll in anderen Studien verwendet werden, die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Hunan University of Science and Engineering (Hunan, China) und der Zhejiang Gongshang University (Zhejiang, China).

1. Herstellung von Bakterien

1. Zubereitung von Bifidobacterium mittlerer Brühe
   1. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in 950 ml destilliertem Wasser: Fleischextrakt, 5 g/L; Hefeextrakt, 5 g/L; Casein-Pepton, 10 g/L; Soytone, 5 g/L; Glukose, 10 g/L; K₂HPO₄, 2,04 g/L; MgSO₄7H₂O, 0,22 g/L; MnSO₄. H₂0, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 ml; Salzlösung, 40 ml (CaCl₂.2H₂O, 0,25 g/l; KH₂PO₄, 1 g/L; NaHCO₃, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); und Resazurin, 0,4 ml (2,5 mg/L). Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 2 M NaOH ein.
   2. Autoklav bei 121 °C für 15 min und lassen Sie die Brühe auf Raumtemperatur (RT) unter anaeroben Bedingungen abkühlen (10% H₂, 10% CO₂, 80% N₂). Filtersterilisiertes Cystein-HCl (0,5 g/L) und Mupirocin (5 mg/L) zum Medium hinzufügen.
2. Fügen Sie ein Aliquot (50 l) gefrorenes Bifidobacterium longum zu einem Kulturrohr mit 5 ml Bifidobacterium-Mediumbrühe unter anaeroben Bedingungen hinzu, dann Kultur in einem anaeroben Inkubator für 24 h bei 37 °C.

2. Herstellung von bifidobakteriellen EPS

1. Vorbereitung des PYG-Agarmediums
   1. Kombinieren Sie folgendes: Pepton, 20 g/L; Hefeextrakt, 10 g/L; Glukose, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl₂, 0,008 g/L; MgSO₄7H₂O, 0,008 g/L; K₂HPO₄, 0,04 g/l; KH₂PO₄, 0,04 g/l; NaHCO₃, 0,4 g/L; Agar, 12 g/L. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 7,2 ein.
   2. Autoklavieren Sie das Medium bei 121 °C für 15 min und kühlen Sie auf 50 °C. Dann, pro 1 L Medium, 0,5 ml filtersterilisierte Vitamin K₁ Lösung (1 g Vitamin K₁ gelöst in 99 ml 99% Ethanol), 5 ml Häminlösung (0,5 g Hämin gelöst in 1 ml 1 mol/L NaOH , dann bis zu 100 ml mit destilliertem Wasser) und 0,5 g Cystein-HCl.
   3. Vor dem Gießen der PYG-Platten, fügen Sie filtersterilisierte 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-D-Galactopyranosid (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl-3H_{2 O}(5,7 g/L) und Mupirocin (5 mg/L) auf das Medium.
      HINWEIS: X-Gal und LiCl.3H₂O ermöglichen die Identifizierung von B. LongumKolonien auf Platten über Färbungsänderungen.
2. 20 L B. Longum-Stämme (Schritt 1.2) auf PYG-Platten impfen und 72 h bei 37 °C in einen anaeroben Inkubator geben.
3. Sammeln Sie Mukoid-Bakterienkolonien aus den PYG-Platten mit einem Wägelöffel, dann vollständig in 10 ml Phosphat-gepufferter Kochsaline (PBS) mit einem Wirbeloszillator wieder aufsetzen.
   HINWEIS: Die Bakteriellen und EPS-Mischungen sollten vollständig durch Wirbeln oder Pipettieren nach oben und unten wiederholt resuspendiert werden, bis die Fasern vollständig in PBS gelöst sind.
4. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 6.000 x g für 5 min.
5. Die Überstande vorsichtig auf ein neues Zentrifugenrohr übertragen und durch wiederholte Inversion und Mischung vollständig mit drei Volumen kaltem 99% Ethanol vermischen.
6. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 6.000 x g für 5 min und entfernen Sie die Überräube vollständig.
7. Entfernen Sie die Ausscheide aus den Zentrifugenrohren, indem Sie die EPS-Extrakte über Nacht mit einem Geschwindigkeitsvakuum kratzen und trocknen.

3. Herstellung des Fermentationsmediums

1. Vorbereitung des Grundkulturmediums VI
   1. Kombinieren Sie folgendes: Pepton, 3 g/L; Trypton, 3 g/L; Hefeextrakt, 4,5 g/L; Mucin, 0,5 g/L; Gallensalze Nr. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl₂bei 6H₂O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl₂.6H₂O, 0,2 g/L; KH₂PO₄, 0,4 g/l; MgSO₄bei 7H₂O, 3,0 g/L; MnCl₂4H₂O, 0,32 g/L; FeSO₄7H2O, 0,1 g/L; CoSO₄7H₂O, 0,18 g/L; CaCl₂2 H₂O, 0,1 g/L; ZnSO₄bei 7H₂O, 0,18 g/L; CuSO₄bei 5H₂O, 0,01 g/L; und NiCl₂6H₂O, 0,092 g/L. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 mit 1 M HCl ein.
   2. Bereiten Sie Hämin und Cystein wie in Abschnitt 2.1 getan und nach dem Autoklavieren und Kühlen hinzufügen.
2. Bereiten Sie Kulturmedien vor, die verschiedene Kohlenstoffquellen enthalten, mit einem VI-Basismedium. Vor dem Autoklavieren 8 g/L Bif EPS-Fasern zu Medium VI hinzufügen, bestehend aus Gruppe VI_Bif. Fügen Sie außerdem 8 g/L Stärke zu Medium VI hinzu, um Die Gruppe VI_Starch darzustellen. Schließlich wird Medium VI ohne Zugabe einer Kohlenstoffquelle als Steuerung verwendet (Gruppe VI).
   HINWEIS: Bif EPS und Stärke werden zunächst in heißem Wasser mit einem magnetischen Rührer gelöst und dann mit vorbereitetem VI-Medium gemischt.
3. Alle Medien bei 121 °C für 15 min autoklavieren und auf RT abkühlen lassen.
4. Übertragen Sie eine Unterprobe (5 ml) jedes Mediums in Kulturröhren in einem anaeroben Inkubator und lagern Sie die restlichen Medien bei 4 °C.

4. Humane Fäkalienprobenvorbereitung

1. Sammeln Sie frische Fäkalienproben unmittelbar nach frischer Defäkation von gesunden erwachsenen menschlichen Freiwilligen mit Kotbehältern und anschließend für die Güllezubereitung.
   HINWEIS: Vor der Probenentnahme sollten alle Freiwilligen gescreent werden, um sicherzustellen, dass antibiotika, probiotische oder präbiotische Behandlungen mindestens 3 Monate vor der Entnahme von Proben nicht erhalten werden. Darüber hinaus müssen alle Spender eine informierte, schriftliche Zustimmung erteilen.
2. Eine frische Fäkalienprobe (1 g) auf 10 ml 0,1 M anaerobe PBS (pH 7,0) in Glasbecher geben, dann Glasstäbe verwenden, um eine 10% (w/v) Gülle zuzubereiten.
3. Verwenden Sie ein 0,4 mM Großes Sieb, um die Fäkalienschlämme zu filtern. Verwenden Sie dann eine Unterprobe der gefilterten Gülle, um Diefermentationsexperimente zur Chargenkultur zu impfen, und lagern Sie den Rest bei -80 °C für weitere Analysen.
   HINWEIS: Die Schritte 4.2–4.3 werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt.

5. In-vitro-Chargenfermentation

1. In Schritt 3.2 in einer anaeroben Kammer hergestellte gefilterte Fäkalienschlämme (500 l) in das Fermentationsmedium geben und dann bei 37 °C inkubieren.
2. Sammeln Sie 2 ml fermentierte Proben bei 24 h und 48 h in der anaeroben Kammer und zentrieren Sie dann außerhalb der Kammer bei 6.000 x g für 3 min.
3. Übertragen Sie die Überstande sorgfältig auf ein neues Zentrifugenrohr, das für Polysaccharidabbauanalysen und kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) verwendet wird.
4. Bewahren Sie die Zentrifugationspellets bei -80 °C auf und verwenden Sie anschließend die bakterielle genomische DNA-Extraktion.

6. EPS-Abbau durch menschliche Fäkalienmikrobiota

1. 0,2 l fermentierte Überstoffe auf vorbeschichtete Kieselgel-60 TLC-Aluminiumplatten geben und anschließend mit einem Haartrockner trocknen.
2. Entwickeln Sie die Platten in 20 ml einer Ameisensäure/n-Butanol/Wasser (6:4:1, v:v:v) Lösung und trocknen Sie mit einem Haartrockner.
3. Die Teller im Orcinol-Reagenz einweichen, um zu färben, dann trocknen Sie mit einem Haartrockner.
   1. Bereiten Sie Orcin-Reagenzien vor, indem Sie 900 mg Lichenol in 25 ml destilliertem Wasser auflösen und dann 375 ml Ethanol hinzufügen. Anschließend sollte konzentrierte Schwefelsäure langsam zugesetzt und die Lösung gründlich vermischt werden.
4. Hitzeplatten bei 120 °C für 3 min im Backofen und bewerten Denkwert von EPS durch Messung von TLC-Bändern.

7. Auswirkungen von EPS auf die menschliche Darmmikrobiota

1. Gefrieren Sie die in Schritt 4.3 hergestellten Originalfäkalienproben und die in Schritt 5.4 hergestellten fermentierten Proben.
2. Extrahieren Sie bakterielle genomische DNA (gDNA) aus allen Proben mit einem Stuhl bakterielle genomische DNA-Extraktionkit nach den Anweisungen des Herstellers.
3. Bestimmen Sie DNA-Konzentrationen, Integrasse und Größenverteilungen mit einem Mikrospektrophotometer und einer Agargelelektrophorese.
4. Führen Sie PCR von bakteriellen 16S rRNA-Genen aus der extrahierten gDNA mit den zuvor beschriebenen Vorwärts- und Reverse-Primern¹²:
   -Vorwärtsgrundierung (Barcode-Primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
   -Reverse Primer (806R): GGACTACHVGGWTCTAAT
   Verwenden Sie die folgenden thermischen Cycler-Bedingungen:
   1. 94 °C für 5 min.
   2. 94 °C für 30 s.
   3. 55 °C für 30 s.
   4. 72 °C für 1 min.
   5. Wiederholen Sie 2–4 für 35 Zyklen
   6. 72 °C für 5 min.
   7. 4 °C halten bis zum Entfernen aus dem thermischen Cycler.
5. Führen Sie die Sequenzierung von PCR-Produkten mit hohem Durchsatz bei einem DNA-Sequenzierungsunternehmen mithilfe einer mikrobiellen Community-Analyse mit ultrahohem Durchsatz durch.
6. Erhalten Sie saubere, qualitativ hochwertige Sequenzen mit der Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) Sequenzanalysepipeline¹³.
7. Definieren Sie operative taxonomische Einheiten (OTUs) für 16S rRNA-Gensequenzen mit einer Nukleotidähnlichkeit von mehr als 97 % mithilfe von Bioinformatik-Tools wie der Mothur Software Suite¹⁴.
8. Wählen Sie aus jeder OTU eine repräsentative Sequenz aus, und verwenden Sie den RDP-Klassifikator zusammen mit der taxonomischen SILVA-Datenbank, um repräsentative Sequenzen¹⁵zu klassifizieren.
9. Berechnen Sie Goods Abdeckung, Alpha-Diversitätsmetriken (einschließlich Simpson- und Shannon-Index) und Reichtum (beobachtete Anzahl von OTUs) mit Bioinformatik-Tools¹⁶.

8. Auswirkungen von EPS auf die SCFA-Produktion durch menschliche Darmmikrobiota

1. In Schritt 5,3 bis 2 ml Zentrifugenrohren fermentierte Überräube (1 ml) hinzufügen.
2. Fügen Sie 0,2 ml 25% (w/v) Metaphosphorsäure zu jeder der Proben hinzu und mischen Sie die Lösungen gründlich durch Wirbeln.
3. Zentrifugieren Sie die Mischungen bei 13.000 x g für 20 min und übertragen Sie die Überräube in frische Schläuche.
4. Gleichzeitig Lösungen von 120 mM Essig-, Propion-, Butyric-, isobutyric-, Valeric- und Isovalersäuren vorbereiten. Dann 1 ml jeder vorbereiteten Säure zu 1,2 ml 25% (w/v) Metaphosphorsäure hinzufügen und als Standardcocktails verwenden.
5. Filtern Sie die Proben mit einer 0,22-M-Membran.
6. SCFA-Konzentrationen mit Hochleistungsgaschromatographie gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen^11,17erkennen.
   HINWEIS: Für die Gaschromatographie (GC) wird eine InertCap FFAP-Säule (0,25 mM x 30 m x 0,25 m) verwendet. Die SCFA-Konzentrationen werden dann anhand von Spitzenbereichen mithilfe der internen Single-Point-Standardmethode im GC Solution-Softwarepaket quantifiziert.

Ergebnisse

Die Produktion von Schleimhaut EPS konnte in B. Longumkulturen auf PYG-Platten nach anaeroben Inkubation für 72 h beobachtet werden (Abbildung 1A). Die Zentrifugierung von Kulturkratzen, gefolgt von Ethanolfällung und Trocknung, führte zur Sammlung zelluloseähnlicher EPS (Abbildung 1B). Getrocknetes EPS und lösliche Stärke wurden dann als Kohlenstoffquellen für Fermentationskulturen verwendet. TLC wurde für die Oligosaccharid-Trennung und Reinhe...

Diskussion

In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung und Der Aktivitäten der menschlichen Darmmikrobiota erzielt. Als Folge dieser Studien ist das holobionische Konzept entstanden, das die Wechselwirkungen zwischen Wirten und assoziierten mikrobiellen Gemeinschaften darstellt, wie z.B. zwischen Menschen und ihrer Darmmikrobiota^19,20. Darüber hinaus werden Menschen sogar jetzt als Superorganismen betrachtet

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filters	Millipore	SLGP033RB	Use to filter samples
0.4-mm Sieve	Thermo Fischer	308080-99-1	Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Solarbio	X1010	Use to prepare color plate
Acetic	Sigma-Aldrich	71251	Standard sample for SCFA
Agar	Solarbio	YZ-1012214	The component of medium
Anaerobic chamber	Electrotek	AW 400SG	Bacteria culture and fermentation
Autoclave	SANYO	MLS-3750	Use to autoclave
Bacto soytone	Sigma-Aldrich	70178	The component of medium
Baking oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Use to heat and bake
Beef Extract	Solarbio	G8270	The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® 51870™	Bacteria
Bile Salts	Solarbio	YZ-1071304	The component of medium
Butyric	Sigma-Aldrich	19215	Standard sample for SCFA
CaCl2	Solarbio	C7250	Salt solution of medium
Capillary column	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm)	Used to SCFA detection
Casein Peptone	Sigma-Aldrich	39396	The component of medium
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Use for centrifugation
CoSO4.7H2O	Solarbio	C7490	The component of medium
CuSO4.5H2O	Solarbio	203165	The component of medium
Cysteine-HCl	Solarbio	L1550	The component of medium
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O	Solarbio	YZ-111614	The component of medium
Formic Acid	Sigma-Aldrich	399388	Used to TLC
Gas chromatography	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Used to SCFA detection
Glass beaker	Fisher Scientific	FB10050	Used for slurry preparation
Glucose	Solarbio	G8760	The component of medium
Haemin	Solarbio	H8130	The component of medium
HCl	Sigma-Aldrich	30721	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric	Sigma-Aldrich	46935-U	Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids	Sigma-Aldrich	129542	Standard sample for SCFA
K2HPO4	Solarbio	D9880	Salt solution of medium
KCl	Solarbio	P9921	The component of medium
KH2PO4	Solarbio	P7392	Salt solution of medium
LiCl.3H2O	Solarbio	C8380	Use to prepare color plate
Meat Extract	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	The component of medium
Metaphosphoric Acid	Sigma-Aldrich	B7350	Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O	Solarbio	M8160	The component of medium
MgSO4.7H2O	Solarbio	M8300	Salt solution of medium
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE system	DNA sequencing
MnSO4.H20	Sigma-Aldrich	M8179	Salt solution of medium
Mupirocin	Solarbio	YZ-1448901	Antibiotic
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Salt solution of medium
NaHCO3	Sigma-Aldrich	792519	Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Determine DNA concentrations
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol	ChemSpider	71-36-3	Used to TLC
NiCl2	Solarbio	746460	The component of medium
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Used to prepare orcinol reagents
Propionic	Sigma-Aldrich	94425	Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Used to prepare the lipid suspension
Resazurin	Solarbio	R8150	Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator	LABCONCO	CentriVap	Use to prepare EPSs
Starch	Solarbio	YZ-140602	Use to the carbon source
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	150692	Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR	BIO-RAD	1861096	PCR amplification
TLC aluminium sheets	MerckMillipore	116835	Used to TLC
Trypticase Peptone	Sigma-Aldrich	Z699209	The component of medium
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293	The component of medium
Tween 80	Solarbio	T8360	Salt solution of medium
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Standard sample for SCFA
Vitamin K1	Sigma-Aldrich	V3501	The component of medium
Vortex oscillator	Scientific Industries	Vortex.Genie2	Use to vortexing
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625	The component of medium
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251	The component of medium