Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Injektion von Cricket-Eiern vor, eine Technik, die als grundlegende Methode in vielen Experimenten im Cricket dient, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, RNA-Interferenz und genomische Manipulation.

Zusammenfassung

Die Veränderung der Genfunktion in einem sich entwickelnden Organismus ist für verschiedene Arten von Experimenten von zentraler Bedeutung. Während in traditionellen Modellsystemen enorm leistungsfähige genetische Werkzeuge entwickelt wurden, ist es in den meisten anderen Organismen schwierig, Gene oder Boten-RNA (mRNA) zu manipulieren. Gleichzeitig basieren evolutionäre und vergleichende Ansätze auf einer Erforschung der Genfunktion bei vielen verschiedenen Arten, was die Entwicklung und Anpassung von Techniken zur Manipulation von Expressionen außerhalb der derzeit genetisch behördlichen Spezies. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Injektion von Reagenzien in Cricket-Eier, um die Auswirkungen einer bestimmten Manipulation auf die embryonale oder Larvenentwicklung zu testen. Anweisungen zum Sammeln und Injizieren von Eiern mit abgeschrägten Nadeln werden beschrieben. Diese relativ einfache Technik ist flexibel und potenziell an andere Insekten anpassbar. Man kann Dutzende von Eiern in einem einzigen Experiment sammeln und injizieren, und die Überlebensraten für Pufferinjektionen verbessern sich mit der Praxis und können bis zu 80% betragen. Diese Technik unterstützt verschiedene Arten von experimentellen Ansätzen, einschließlich der Injektion von pharmakologischen Wirkstoffen, in vitro capped mRNA, um Gene von Interesse auszudrücken, doppelsträngige RNA (dsRNA), um RNA-Interferenzen zu erreichen, die Verwendung von clusterierten regelmäßig kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) in Abstimmung mit CRISPR-assoziierten Protein-9 (Cas9)-Reagenzien zur genomischen Modifikation und transposierbaren Elementen zur Erzeugung transienter oder stabiler transgener Linien.

Einleitung

Die Fähigkeit, das Genom zu modifizieren oder die Genexpression in Organismen zu beeinflussen, ist die Grundlage für die Entwicklung vieler Arten von Experimenten, die funktionelle Kausalität testen. Entscheidend für die vergleichende und evolutionär relevante Arbeit ist auch, dass genomische und nicht-genomische Modifikationstechniken in Organismen außerhalb traditioneller genetischer Labortiermodellsysteme (z. B. Mus musculus, Danio) verfügbar sind. rerio, Drosophila melanogasterund Caenorhabditis elegans). Ob es der Wunsch ist, die Vielfalt des Organismus zu verstehen¹ oder die Einhaltung des Krogh-Prinzips, dass es für jede biologische Frage einen Organismus gibt, der am besten zu seiner^Lösung2^,3, der Fähigkeit, Genome zu modifizieren oder Einfluss auf die Genexpression ist für moderne Experimentelle Designs unerlässlich.

Der Cricket Gryllus bimaculatus ist ein aufstrebendes Modellsystem. Verwendet für das letzte Jahrhundert in neuroethologischen Experimenten⁴, die letzten zwei Jahrzehnte haben ein erhöhtes experimentelles Interesse an der Cricket erlebt, vor allem auf die Entwicklung und Entwicklung dieses Organismus^{konzentriert 5}. Die Cricket ist ein hemimetabolous Insekt, das basal zu gut untersuchten holometabolen Insekten, wie D. melanogaster und Tribolium castaneum⁶. Aufgrund seiner nützlichen Position auf dem Evolutionsbaum sind Wissenschaftler daran interessiert, moderne, anspruchsvolle experimentelle Fragen an diesem Insekt zu stellen, was zu einem wachsenden Interesse an der Anpassung molekularer Werkzeuge für den Einsatz in G. bimaculatusgeführt hat.

Injektionen molekularer Reagenzien in Cricket-Eier können für genomische Modifikationsexperimente sowie nicht-genomische Manipulationen der Genexpression in Embryonen verwendet werden. Zum Beispiel wurden transgene G. bimaculatus tragen degfP Insertionen wurden mit der Transposase piggyBac^7,8erstellt. Die Forscher haben erfolgreich Knockout G. bimaculatus mit Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-ähnlichen (TAL) Effektornukleasen (TALENs) erstellt, um doppelsträngige Brüche in bestimmten Genomregionen einzuführen⁹. Obwohl ZFNs und TALENs ortsspezifisches Targeting bei Tieren über die großen vier Modellsysteme hinaus ermöglichen, wurden diese Reagenzien schnell durch das CRISPR/Cas9-System übertroffen, das einfacher zu bedienen, effizienter und hochflexibler^{ist 10}. CRISPR wurde in G. bimaculatus zur Herstellung von Knock-out¹¹ sowie Knock-in-Linien^12,13 Zusätzlich zur genomischen Modifikation kann dsRNA in Eier injiziert werden, um die mRNA-Expression bei der Entwicklung Embryonen, so dass die Forscher die Rolle der spezifischen Transkripte während der Entwicklung verstehen^14,15. Einige begrenzte Details über die Injektion von Cricket-Eiern wurden bereits veröffentlicht¹².

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Injektion früher G. bimaculatus Eier. Dieses Protokoll ist effektiv und leicht an verschiedene Laboreinstellungen, Injektionsmaterialien und möglicherweise an andere Insekten anpassbar. Während zusätzliche Details für die Gestaltung und Umsetzung von Genommodifikations- und Knockdown-Experimenten an anderer Stelle veröffentlicht wurden^12,13, werden diese Ansätze letztlich auf das hier beschriebene Injektionsprotokoll angewiesen sein.

Protokoll

1. Hardware-Einrichtung und -Vorbereitung von Materialien

HINWEIS: Zur Vorbereitung von Lösungen, Reagenz und Ausstattungsdetails finden Sie in Tabelle 1 und Materialtabelle.

1. Richten Sie ein Sezieren des Mikroskops ein, um Eier zu sehen und die Injektionsnadel zu führen. (Abbildung1A zeigt ein mit Fluoreszenz ausgestattetes Sezierendes Mikroskop.) Fluoreszenzfähigkeit ist vorteilhaft, aber nicht notwendig.
2. Positionieren Sie einen 3-Achsen-Mikromanipulator, um die Injektionsnadel an Ort und Stelle zu manövrieren (Abbildung 1A).
3. Richten Sie einen Mikroinjektor mit Schläuchen und einem Nadelhalter ein, um kleine Mengen Material zu injizieren (Abbildung 1A). Verwenden Sie optional ein Fußpedal, das in der Abbildung nicht dargestellt ist.
4. Entwerfen und erstellen Sie einen Stempel, um Bohrungen für Eier zu erstellen (Abbildung 1C), indem Sie die Umkehrung des gewünschten Musters drucken, entweder mit einem 3D-Drucker oder einem Lasergravierer.
   HINWEIS: Der gezeigte 3D-gedruckte Musterstempel ist 4,5 cm x 5 cm mit 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm Vorsprung zur Herstellung individueller Brunnen. Details, wie man eine Vielzahl von anpassbaren Formen zu machen wurden an anderer Stelle veröffentlicht¹⁶.
5. 10x Injektionspuffer, HEPES gepufferte Saline (HBS) und eine Stammlösung aus Tetramethylrhodamin Dextran Farbstoff vorbereiten und bei 4 °C lagern.
6. Vorbereiten sie experimentelle Lösungen, die injiziert werden sollen, wie dsRNA, CRISPR/Cas9¹², transponierbare Elemente, in vitro gekappte mRNA^7,8, pharmakologische Wirkstoffe¹⁷, ZFNs oder TALENS⁹.
7. Legen Sie Doppelklebeband auf mehrere Schichten Standard-Laborband auf einem Glasmikroskop-Dia, um eine Plattform 1 mm oder so über dem Glasschlitten zu erstellen, die zum Halten von Nadeln für die Bewertung verwendet wird.
8. Bereiten Sie einen Cricket-Behälter ca. 40 cm x 60 cm größe mit einem Deckel mit einer mesh-bedeckten Öffnung für die Luftzirkulation.
9. Fügen Sie Lebensmittel, Wasser und schutzbeschützende Materialien hinzu.
10. Fügen Sie mehrere Dutzend gesunde männliche und weibliche erwachsene Grillen. Identifizieren Sie erwachsene Cricket durch die Anwesenheit von Flügeln.
    HINWEIS: Eine Reihe von post-imaginalen Alter kann die Eierträge erhöhen. Die Dichte der Grillen sollte relativ hoch sein, um genug Eier für ein Experiment sammeln zu können, aber nicht so überfüllt, dass Kannibalismus auftritt. Zum Beispiel sollten etwa zwei Dutzend gesunde Grillen, mit einem ungefähr gleichen Verhältnis von Mann zu Frau, in einem Behälter der oben genannten Größe ausreichen, um etwa 200 Eier in einem Ein- bis Zwei-Stunden-Zeitraum zu sammeln. Grillen können bei Raumtemperatur gehalten werden, aber Entwicklung und Verhalten sind optimal, wenn Grillen in einem warmen (23,5–26 °C), feuchten (40 - 60% relativen Luftfeuchtigkeit) Brutkasten gehalten werden.

2. Herstellung von Nadeln für die Injektion

1. Verwenden Sie Borosilikatglaskapillaren mit Filament (siehe Tabelle der Materialien für Größendetails). Bereiten Sie die Zugnadeln am selben Tag oder bis zu einigen Tagen vor der Injektion vor.
2. Legen Sie ein Kapillarglas in den Puller, zentrieren Sie das Glas auf das Filament, und ziehen Sie die Knöpfe, um das Glas an Ort und Stelle zu sichern.
3. Stellen Sie die Abziehertemperatur in der Nähe der Glasrampentemperatur (-5 °C bis +10 °C) ein.
4. Verwenden Sie ein einstufiges Hochwärmeprotokoll, um eine lange Verjüngung mit einer kleinen Öffnung zu ziehen, aber vermeiden Sie das Schmelzen der endenliegenden Enden geschlossen.
   HINWEIS: Verwenden Sie z. B. bei Verwendung des Mikropipette-Ziehers, der in der Tabelle der Materialien mit einem Kastenfilament ausgestattet ist, die folgenden Parameter für Glas mit einer Rampentemperatur von 478: Hitze 478; Ziehen 45; Vel 75; Del 120. Die optimalen Bedingungen für die Herstellung einer Nadel mit der in Abbildung 2B dargestellten Form sollten von jedem Anwender empirisch bestimmt werden.
5. Nadelspitzen zur Vorbereitung auf die Injektionen abschrägen.
6. Befeuchten Sie die Spinnschleiferebene des Kegels (Abbildung 2A) mit tropfendem Wasser. Verwenden Sie entweder Umkehrosmose (RO) oder Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltes destilliertes Wasser.
7. Legen Sie die gezogene Nadel in den Verweser und drehen Sie sie in einen 20°-Winkel.
8. Senken Sie die Nadel, bis sie nur die Schleifebene berührt und 2 bis 3 min abschrägen.
9. Bewerten Sie die Abschrägung, indem Sie die abgeschrägte Nadel auf ein Doppelklebeband legen, das an einem Glasmikroskopschlitten verklebt wurde.
10. Platzieren Sie das Dia, das die Nadel hält, auf die Bühne eines zusammengesetzten Mikroskops, das mit einer Kamera und einer Bildaufnahmesoftware ausgestattet ist.
11. Erfassen Sie ein Bild der Nadelspitze mit einem 20-fachen Objektiv.
12. Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um den inneren Lumendurchmesser der Nadel zu messen, der nur proximal zur abgeschrägten Öffnung ist (Abbildung 2C). Die optimale Größe beträgt 10 m + 2 m.
13. Entsorgen Sie Nadeln, die eine Öffnung unter 8 m und über 12 m haben.
14. Bewahren Sie die Nadeln in einem Behälter mit Deckel auf, um zu vermeiden, dass sie staubig werden. Verwenden Sie einen Streifen Wachs oder ähnliches Material, um die Nadeln von der Unterseite des Behälters zu heben, um zu verhindern, dass die Spitzen brechen (Abbildung 2D).

3. Eiersammlung und -zubereitung

1. Maximieren Sie die Anzahl der Eier, die gelegt werden, indem Sie Grillen jegliches feuchtes Ledermaterial (Wasserfläschchen, Eierschalen) über Nacht oder für mindestens 8–10 h vor dem Versuch, Eier zu sammeln, vorenthalten.
   HINWEIS: Da Weibchen die Fähigkeit haben, Spermien intern zu speichern, kann ein anders getimtes Verfahren erforderlich sein, wenn eine sorgfältig getimte Befruchtung experimentell wesentlich ist¹⁸.
2. 40 ml 1% Agarose in Wasser machen und in eine 10 cm Petrischale gießen.
3. Legen Sie einen Eierbrunnenstempel auf die Oberfläche der Agarose, bevor sie erstarrt.
4. Entfernen Sie den Stempel, sobald die Agarose verfestigt ist, um die Brunnen zu offenbaren (Abbildung 1C).
5. Füllen Sie die Agarose-Wellplatte mit HBS, die 1% Penicillin/Streptomycin enthält.
6. Den Deckel auf die Schale legen, in Parafilm wickeln und bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Geschirr kann für ein paar Tage bei 4 °C gelagert werden, sollte aber vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmt werden, um Kondensation zu vermeiden.
7. Machen Sie eine Ei-SammlungSchale für Grillen Eier zu legen, indem Sie eine 35 mm Petrischale mit weißen Spielplatz Sand füllen (Abbildung1B).
   HINWEIS: Der in der Materialtabelle angegebene Sand hat die entsprechende Korngröße. Wenn die Sandkörner zu groß sind, wird der Sand die Eier beschädigen.
8. Die Eierschale mit einem Quadrat papiertuch, das etwa 18 cm x 18 cm groß geschnitten ist, mit einem Quadrat papierenen Handtuchs bedecken und mit Sand auf die Oberseite legen. Durch dieses Papierhandtuch bedecken Sie die gefüllte Schale mit Leitungswasser.
9. Neigen Sie die Petrischale und drücken Sie vorsichtig die Oberseite, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
10. Stecken Sie die Ecken des Papiertuchquadrats unter die Schale und legen Sie die Eierschale in den umgekehrten Deckel, der dazu beiträgt, die Papiertuchabdeckung an Ort und Stelle zu halten.
11. Legen Sie die Eierschale in den Cricket-Behälter und lassen Sie die erwachsenen Weibchen Eier für ein bis zwei h oviposit.
    HINWEIS: Die relativ kurze Zeit hier stellt sicher, dass alle Eier im Entwicklungsstadium zum Zeitpunkt der Injektion ähnlich sein werden. Wenn eine Injektion vor der Zellzellisierung wichtig ist, sollten Injektionen innerhalb von 14 h von Eiablage¹⁹auftreten.
12. In der Zwischenzeit die Agaroseschale (ab Schritt 3.6) auf die Raumtemperatur erwärmen lassen, um Eier zur Injektion zu halten.
13. Entfernen Sie die Eiersammelschale, die jetzt frisch gelegte Eier enthält, aus dem Cricket-Behälter, und entfernen Sie den Papiertuchdeckel. Legen Sie ein Sieb mit einer Porengröße von 0,5–1 mm über einen Becher mit einer Kapazität von mindestens 500 ml (Abbildung 1B).
14. Spülen Sie den Inhalt der Eierlegende (Sand und Eier) in das Sieb unter sanft fließendem Leitungswasser, so dass die Sandkörner durch das Siebgitter in das Wasser im Becher unten fallen, aber die Cricket-Eier im Siebkorb zurücklassen.
15. Füllen Sie einen Behälter mit RO-Wasser und legen Sie es in ein Tablett. Das Sieb über den Behälter umkehren und gegen die Schale anzapfen, um die Eier ins Wasser zu entwirn. Die Eier sinken auf den Boden des Behälters.
16. Schneiden Sie die Spitze mit einer P1000 Pipettenspitze mit einer Schere ab, um eine Öffnung von ca. 3 mm Durchmesser zu machen. Legen Sie diese Spitze auf einen P1000 Pipettier und verwenden Sie ihn, um die Eier aus dem Behälter auf die Agarose-Ei-Formschale zu übertragen, so wenig Wasser wie möglich zu übertragen.
17. Verwenden Sie Eine Kunststoff-Pinzette, um Eier in MitHBS gefüllten Agarosebrunnen plus 1% Penicillin/Streptomycin anzulegen. Jedes Ei sinkt auf den Boden eines einzelnen Brunnens. Mit dem Petrischalendeckel abdecken, bis er injiziert werden kann.

4. Bereiten Sie den Mikroinjektor vor

1. Befestigen Sie den Mikroinjektor an einer Druckluft- oder Gasquelle (dieses Protokoll wurde entweder mit Druckluft oder N₂optimiert).
   HINWEIS: Wenn Sie einen tragbaren Lufttank verwenden, füllen Sie ihn auf mindestens 75 psi. Der Tank verliert luftdruck während der Injektionen und muss möglicherweise wieder aufgefüllt werden; Injektionen werden schwierig unter 40psi.
2. Schalten Sie den Mikroinjektor ein. Stellen Sie die Einspritzzeit auf 0,17 s und den Druck auf 10–15 psi ein.
   HINWEIS: Der genaue Druckbedarf hängt vom Öffnen der Nadel ab und muss empirisch für jede verwendete Injektionsrunde und/oder neue Nadel bestimmt werden.
3. Stellen Sie sicher, dass der BALANCE-Regler des Mikroinjektors auf 0 (in der Regel vollständig gegen den Uhrzeigersinn) gedreht wird und dass der Mikroinjektor unter Druck steht und sich im Injektionsmodus befindet.

5. Injektionen

1. Filtern Sie ca. 500 l 10x Injektionspuffer mit einer 1 ml Spritze und einem 0,45 m Spritzenfilter.
2. Mischen Sie Injektionsreagenzien (die folgenden Details sind für die Injektion von dsRNA hergestellt, wie in¹²beschrieben ).
   HINWEIS: Es kann ratsam sein, mehrere Steuerelemente zu entwerfen und durchzuführen, vor allem, wenn man diese Technik zum ersten Mal lernt. Das Poking-Eier ohne Injektion, das Injizieren von Puffer + Farbstoff allein oder das Injizieren von Puffer + Farbstoff + ein Kontrollreagenz (wie eGFP dsRNA) sind gute Tests dafür, wie störend verschiedene Elemente des Injektionsprotokolls sein könnten. Siehe Abbildung 3 für die Überlebensfähigkeit einer Reihe verschiedener Steuerelemente.
3. Beginnen Sie mit einem 4 ml dsRNA aliquot.
4. 0,5 ml des gefilterten 10x Injektionspuffers in die dsRNA aliquot geben.
5. 0,5 ml von 50 mg/ml Tetramethylrhodam Dextran Farbstofflösung hinzufügen. Wenn Sie an einem Sezieren von Bereichen ohne Fluoreszenz arbeiten, verwenden Sie stattdessen Phenol Red.
6. Halten Sie alle Materialien für die Dauer der Injektionszeit auf Eis.
7. Die Injektionslösung mit 20 ml Ladespitzen und einer p10 Pipette in eine Injektionsnadel geben.
8. Ziehen Sie eine 1,5 ml Injektionslösung auf und legen Sie die Ladespitze in das breite Ende der Injektionsnadel ein.
9. Auswerfen Der Lösung so weit wie möglich in die Nadel und beseitigen Luftblasen durch sanftes Streichen; Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu brechen.
10. Legen Sie die Schale der Eier unter das Sezieren Mikroskop und wählen Sie eine niedrige Vergrößerung von etwa 10x (1x Vergrößerung durch 10x Augenobjektive betrachtet).
11. Setzen Sie die Nadel in das Injektionsgehäuse ein und ziehen Sie sie fest.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Nadel richtig und fest in das Gehäuse eingesetzt wird. Ziehen Sie dazu das breite Ende der Nadel wieder aus dem Metallgehäuse und bringen Sie die Siliziumschläuche in das Gehäuse. Stellen Sie die Siliziumschläuche so ein, dass das Glasende der Nadel direkt über das Silizium hinausragt. Wenn dies nicht geschieht, können die Siliziumschläuche zwischen dem Glas und dem Metallgehäuse eingeklemmt werden, wodurch das Ende der Nadel blockiert wird.
12. Setzen Sie das Injektionsgehäuse vorsichtig mit einer befestigten Nadel in den Mikromanipulator ein. Achten Sie auf das scharfe Ende der Nadel und achten Sie darauf, dass sie nicht auf Oberflächen gestoßen und gebrochen wird.
13. Wenn Sie sowohl die Eier als auch die Nadel durch das Mikroskop betrachten, bewegen Sie die Nadel in der Nähe der Eier in der oberen linken Ecke des Tellergitters.
14. Senken Sie die Nadel, bis die Spitze in die HBS plus 1% Penicillin/Streptomycin gepufferte Lösung in der Schale.
15. Zentrieren Sie die Nadel im Sichtfeld und bewegen Sie die Eierschale so, dass die Nadel ein paar Mm näher am Rand der Schale als die Eier ist.
16. Versperren Sie nicht den Blick auf das Gitter von Eiern mit der Nadel.
17. Stellen Sie das Mikroskop auf den Filter, der für Rhodamine geeignet ist, so dass es möglich ist, die Fluoreszenz in der Nadel zu beobachten und sich auf die Spitze der Nadel zu konzentrieren.
18. Drehen Sie am Mikroinjektor den BALANCE-Regler langsam im Uhrzeigersinn, bis die Injektionslösung aus der Nadel in die Suspensionslösung austritt. Die Bilanznummer auf dem Bildschirm des Mikroinjektors beginnt zu steigen, obwohl der numerische Wert nicht wichtig ist. Als nächstes drehen Sie den Knopf gegen den Uhrzeigersinn leicht zurück, bis der Farbstoff nicht mehr aus der Nadel austritt.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dieses Gleichgewicht jedes Mal festzulegen, wenn eine neue Nadel verwendet wird. Ohne das entsprechend eingestellte Gleichgewicht wird der Mikroinjektor noch einige Zeit nach dem Auslösen der Injektion injizieren. Es ist sogar möglich, dass ein einziger Druck des Injektionsknopfes mit einer unsymmetrischen Nadel zum Ausschluss des gesamten Inhalts der geladenen Nadel führt.
19. Mit der Nadel im Sichtfeld zentriert, bewegen Sie die Eischale, so dass die Nadel auf das Ei gerichtet ist, das zuerst injiziert werden soll. Es wird empfohlen, dass Injektionen in einer Ecke des Gitters von angeordneten Eiern beginnen, zum Beispiel die obere linke Ecke.
20. Stellen Sie die Vergrößerung auf ca. 50x ein; bei dieser Vergrößerung füllt ein einzelnes Ei den größten Teil des Sichtfeldes.
21. Verwenden Sie sowohl den Mikromanipulator als auch die Hand auf der Eierschale, um die Nadel für die Injektion in Position zu bringen.
22. Fördern Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator und setzen Sie die Spitze der Nadel in das erste zu injizierende Ei ein.
23. Legen Sie die Nadel bei 20–30% Eilänge vom hinteren (blunter) Ende des Eis (Abbildung 1E), senkrecht zur langen Achse des Eis.
24. Injektionslösung entweder mit dem Injektionsfußpedal oder dem Injektionsknopf am Mikroinjektor. Ein kleiner Bolus aus fluoreszierendem Material im Ei zeigt eine erfolgreiche Injektion an (Abbildung 1D).
    HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, dass etwas Dotter während der Injektion aus dem Ei ausgeworfen wird (Abbildung 1F), und dies deutet nicht unbedingt darauf hin, dass das injizierte Ei unrentabel sein wird.
25. Ziehen Sie die Nadel aus dem Ei. Wenn das Ei beim Zurückziehen der Nadel unbeabsichtigt aus seinem Brunnen gehoben wird, verwenden Sie kleine Zangen, um das Ei beim Zurückziehen der Nadel wieder in seinen Brunnen zu schieben.
26. Wenn die Nadel während der Injektion verstopft, entfernen Sie die Nadel aus dem Ei und, halten Sie die Nadel in der HBS eingetaucht plus 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung, die die Eier bedeckt, löschen Sie die verstopfte Nadel entweder mit der Clear-Funktion oder durch Drücken der Injektion knopf.
27. Weiterhin die gleiche Nadel zu verwenden, wiederholen Sie das Injektionsverfahren für so viele Eier wie möglich. Zunächst können es nur etwa 20 oder 30 Eier sein, werden aber mit der Praxis auf über 100 anwachsen.
28. Wenn die Nadel verstopft wird und nicht gelöscht werden kann, entsorgen Sie die Nadel, füllen Sie eine neue Nadel und beginnen Sie erneut (d. h. kehren Sie zu Schritt 5.7 zurück).
29. Bewahren Sie die Schale der injizierten Eier in einem warmen Inkubator (23,5–26 °C) auf, der leicht feucht ist (um die Verdunstung zu minimieren), bis die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium für die Analyse erreicht haben.
30. Entfernen Sie mindestens alle 24 h Eier, die nicht mehr lebensfähig sind (Abbildung 3A,B), und ersetzen Sie die Suspensionslösung durch frische HBS plus 1% Penicillin/Streptomycin.
31. Zwei bis drei Tage nach der Injektion die Eier durch sanftes Pipettieren oder mit Plastikzangen auf mit HBS befeuchtete Papiertücher plus 1% Penicillin/Streptomycin in einer verpfuschen Petrischale übertragen, um die Entwicklung im warmen, feuchten Inkubator fortzusetzen.
32. Überwachen Sie die Eier und entfernen Sie Eier, die nicht mehr lebensfähig sind jeden Tag (Abbildung 3A,B).

Ergebnisse

Grillen legen leicht Eier in das feuchte Material, und die Bereitstellung von ausreichendem Material, wie feuchter Sand oder Schmutz, veranlasst sie, eine große Anzahl von Eiern zu legen. Dies ist besonders wirksam, wenn Grillen zuerst eilegendes Material für 8–10 h vorenthalten werden. Eier, die in sauberen Sand gelegt werden, können leicht getrennt, gesammelt (Abbildung 1B) und in maßgeschneiderte Eibrunnen zur Injektion gelegt werden (

Diskussion

Die beiden größten Herausforderungen bei dieser Technik sind die damit verbundenen Fragen der optimalen Nadelgröße und Überlebensfähigkeit. Obwohl kleinere Nadeln die Überlebensfähigkeit verbessern, haben Nadeln mit schmaleren Lumen ein höheres Maß an Kapillarkräften bei der Arbeit, was es wahrscheinlicher macht, dass sich Dasgelb in die Nadel bewegt, wodurch es verstopft wird. Im besten Fall können Verstopfungen einfach durch Injektion eines anderen Eis oder durch Löschen der Nadel wie oben beschrieben bese...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent dissecting microscope	Leica	M165 FC	Stereomicroscope with fluorescence
External light source for fluorescence	Leica	EL 6000
Microinjector	Narishige	IM-300	-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-
mCherry filter cube	Leica	M205FA/M165FC	Filter cube for mCherry or similar red dye will work
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R	Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)
Magnetic stand	Narishige	MMO-202ND
Pipette Holder (Needle holder)	Narishige	HD-21
Tubing to connect air source to microinjector
Egg well stamp	3D printed	custom	3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic
Microwave	various
Incubator or temperature controlled room	various		Temperatures of 23.5-26 °C are needed.
Cricket food	various		cat food or fish flakes are appropriate food.
Cricket water	vairous		Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls
Cricket shelter	arious		Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons
Glass capillary tubes	World Precision Instruments, Inc.	Item no. 1B100F-4	Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament
Micropipette puller	Flaming/Brown	Model P-97	Distributed by Sutter Instrument Co.
Beveller/Micro grinder	Narishige	Model EG-45/EG-400	EG-400 includes a microscope head
Petri dishes	CellTreat	Product code 229693	90 mm diameter
Play Sand	Sandtastik Products Ltd.	B003U6QLVS	White play sand
Agarose	American Bioanalytical	AB000972	Agarose GPG/LE ultrapure
Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers	US Kitchen Supply	Model SS-C123	Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm
Penicillin Streptomycin	Gibco by Life Technologies	Ref 15070-063	Pen Strep
Plastic tweezers	Sipel Electronic SA	P3C-STD	Black Static Dissipative, 118 mm
Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm	Nalgene	725-2545	Use with 1 mL syringe
1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip	Becton Dickinson	309602	Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work
Air tank (optional)	Midwest Products	Air Works®	Portable air tank
Rhodamine dye	Thermofisher	D-1817	dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,
20 mL loading tips	Eppendorf	Order no. 5242 956.003	epT.I.P.S. 20 μL Microloader
Compound microscope	Zeiss	Axioskope 2 plus
20x objective	Ziess	Plan-Apochromat 20x/0.75 M27
Camera	Leica	DMC 5400
Leica Application Suite  software	Leica	LAS	Version 4.6.2 used here