Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muskelbiopsien

Zusammenfassung

Beschrieben hier ist ein Protokoll zur direkten Immunkennzeichnung von nekrotischen Myofikern in Muskelkryosektionen. Nekrotische Zellen sind durchlässig für Serumproteine, einschließlich Immunglobulin G (IgG). Die Enthüllung der Aufnahme von IgG durch Myofiber ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Myofiberen, die einer Nekrose unabhängig von Muskelproblemen unterzogen werden.

Zusammenfassung

Die Nekrose der Muskelfasern (Myonecrosis) spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese mehrerer Muskelerkrankungen, einschließlich Muskeldystrophien. Therapeutische Optionen zur Bekämpfung der Ursachen der Muskeldystrophie Pathogenese werden erwartet, um Muskeldegeneration zu lindern. Daher ist eine Methode erforderlich, um das Ausmaß des Zelltodes in Muskelbiopsien zu asse- und zu quantifizieren. Herkömmliche Methoden zur Beobachtung der Myofiberdegeneration vor Ort sind entweder schlecht quantitativ oder verlassen sich auf die Injektion lebenswichtiger Farbstoffe. In diesem Artikel wird ein Immunfluoreszenzprotokoll beschrieben, das nekrotische Myofiber durch gezielte Immunglobulin-G-Aufnahme (IgG) durch Myofiber stutzt. Die IgG-Aufnahmemethode basiert auf Zellmerkmalen, die den nekrotischen Untergang charakterisieren, einschließlich 1) des Verlusts der Plasmamembranintegrität mit der Freisetzung von schadensassoziierten molekularen Mustern und 2) der Aufnahme von Plasmaproteinen. In murinen Querschnitten ermöglicht die Co-Immunolabelling von Myofibiden, extrazellulären Matrixproteinen und Maus-IgG eine saubere und unkomplizierte Identifizierung von Myofiberen mit nekrotischem Schicksal. Diese einfache Methode eignet sich für die quantitative Analyse und gilt für alle Arten, einschließlich menschlicher Proben, und erfordert keine Injektion von Vitalfarbstoff. Die Färbung nekrotischer Myofiber durch IgG-Aufnahme kann auch mit anderen Co-Immunolabelling gekoppelt werden.

Einleitung

Gestreifter Skelettmuskel besteht hauptsächlich aus Muskelfasern (Myofiber), die für die charakteristische freiwillige kontraktile Funktion verantwortlich sind. Diese Zellen sind multinukleierte, post-mitotische Strukturen, die mechanische Beanspruchung unterstützen, die während der Kontraktion auftritt. Die strukturelle Stabilität der Myofibermembran (Sarcolemma) und ihrer extrazellulären Matrix sind entscheidend für die Gewebehomöostase. Satellitenzellen bilden die Hauptmuskelvorläuferpopulation in reifen Skelettmuskeln und existieren in einem ruhestillen Zustand in gesunden Muskeln. Nach dem Myofibertod wird die Muskelregeneration von Satellitenzellen nach einem myogenen Programm unterstützt, das die Aktivierung, Proliferation, Differenzierung und Fusion von Satellitenzellen umfasst, um schließlich neue multinukleierte Myofiber zu bilden.

Myofiber-Tod kann bei mehreren Muskelerkrankungen auftreten, einschließlich mechanischer Traumata, Ischämie-Reperfusionsverletzungen oder Muskeldystrophien, und es ist mit der nekrotischen Morphologie der abgestorbenen Zellen^1,2verbunden. Der nekrotische Tod ist durch die schnelle Durchlässigkeit der Plasmamembran und die Freisetzung des Zellgehalts im extrazellulären Fach³gekennzeichnet. Es kann entweder aus einem unregulierten Prozess ohne richtige Zellsignalisierung (d. h. versehentliche Nekrose) oder einem orchestrierten intrazellulären Weg (d. h. regulierter Nekrose) resultieren. Bei Myofiberen können sowohl geregelte⁴ als auch unregulierte⁵ Prozesse zu Nekrose führen. Eine typische Folge der Myonekinismus ist die Freisetzung von schadensassoziierten Molekülmustern, die eine starke Entzündungsreaktion aktivieren⁶. Das Vorhandensein von Makrophagen wird bei etwa 48 h und 72 h nach Verletzung⁷beobachtet. Neben ihrer Rolle bei der Clearance von nekrotischen Ablagerungen sind sie auch wichtig bei der Muskelregeneration^8,9.

Muskeldystrophien (MDs) sind eine heterogene Gruppe von Pathologien, die oft auf einen Defekt in der Sarcolemma-Struktur zurückzuführen sind. Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine juvenile X-verknüpfte Krankheit, die etwa 1 von 3.500 männlichen Geburten weltweit¹⁰betrifft, und sie wird durch das Fehlen von Dystrophin-Expression am Sarcolemma verursacht. Chronische Degeneration des Muskelgewebes bei DMD-Jungen führt zu extremer Muskelschwäche und früher Sterblichkeit. Entzündungen, die durch den nekrotischen Tod entstehen, verbessern die Zytotoxizität und fördern die Muskelfibrose und den Verlust der Muskelfunktion^11,12. Behandlungen, die sich derzeit in klinischen Studien mit den Wurzeln von Muskeldegenerativen Erkrankungen, wie gentherapie, richten, sollen die Myonekinz lindern. Daher sind einfache Techniken zur genauen Quantifizierung der Muskeldegeneration erforderlich.

Mehrere Methoden werden routinemäßig verwendet, um Myofiber Verlust in vivo zu überwachen. Die Messung der enzymatischen Aktivität der Kreatinkinase (CK) im Blut ermöglicht eine zuverlässige Quantifizierung der fortlaufenden Nekrose in Muskel- und Herzgeweben. In situ ist die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) die beliebteste Methode, die derzeit in der Diagnose zur Beurteilung der Degeneration-Regenerations-Remodellierung verwendet wird. Die molekulare Grundlage der H&E-Kennzeichnung abgestorbener Zellen bleibt jedoch unklar. Darüber hinaus sind Farbmodifikationen, die auf den Myofibertod bei der H&E-Färbung hindeuten, relativ subtil und ermöglichen keine zuverlässige und reproduzierbare Quantifizierung. Methoden, die DNA-Fragmentierung offenbaren, wie die Terminal-Deoxynukleotidyl-Transferase dUTP-Nick-End-Etikettierung (TUNEL), unvollkommen kennzeichnen nekrotischen Tod³. Sie sind auch schlecht angepasst, um den Tod von Synzytialzellen wie Myofibers zu überwachen. Die Injektion von Vitalfarbstoffen, wie Evans Blaufarbstoff (EBD), stellt eine nützliche Alternative zur Beurteilung von Myofiwanen dar, die die Integrität von Sarcolemma verloren haben, aber in einigen experimentellen Protokollen nicht unbedingt bequem sind. Zum Beispiel kann das Vorhandensein von EBD in Blutproben die Ergebnisse von CK-Messungen beeinflussen, ein kolorimetrischer Test. Darüber hinaus stellt die intrazelluläre Aufnahme von EBD die Co-Immunolabelling-Herausforderung dar. Daher ist eine alternative Methode, die eine direkte Kennzeichnung von Myofiberen ermöglicht, die sich einer Nekrose unterziehen, von Interesse.

Der Wirkmechanismus lebenswichtiger Farbstoffe beruht auf dem Verlust der Plasmamembranintegrität bei nekrotischen Myofikern und der passiven Aufnahme des injizierten Farbstoffs. In ähnlicher Weise nehmen nekrotische Myofiber Blutproteine wie Albumin auf, für die EBD eine starke Affinität hat^13,14, Immunglobulin G (IgG) und IgM¹⁵. Das abnormale Vorhandensein von Blutproteinen in Myofiberstelltstelltstelltstellt daher praktische Marker für Myonecrosis vor Ort. Die Färbung dieser Proteine kann eine Alternative für die Verwendung von lebenswichtigen Farbstoffen sein.

Durch die Verwendung der IgG-Aufnahme als Marker der Myonekinkis in situ wird dieses Protokoll verwendet, um die Muskeldegeneration im tibialis anterior (TA) von mdx Dystrophin-mangelhaften Mäusen zu bewerten. Diese Methode bietet erhebliche Vorteile gegenüber alternativen Techniken: 1) sie ist reproduzierbar und einfach in ihrer Ausführung; 2) es erfordert keine Tierbehandlung vor der Muskelentnahme, wie die Injektion von zirkulierenden Vitalfarbstoffen, und 3) wie jede herkömmliche Immunolabelling, ist es mit der Ko-Kennzeichnung kompatibel.

Protokoll

Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den französischen und europäischen Rechtsvorschriften (Lizenznummer 11-00010) durchgeführt.

1. Tragacanth-Kaugummi-Präparat

1. In einem Glasbecher 6 g Tragacanthpulver in 100 ml entionisiertem Wasser auflösen. Mit Folie abdecken und mindestens 3 h ablassen. Gelegentlich manuell mit einem Metallspachtel rühren, wenn die Mischung schnell zähflüssig wird.
2. Lassen Sie die Tragacanth-Mischung bei 60 °C über Nacht im Wasserbad oder im Ofen. Versiegeln Sie das Becherglas vorsichtig, um ein Trocknen zu vermeiden. Mindestens einmal umrühren, bevor man aliquotiert.
3. Aliquot und lagern bei 4 °C für bis zu 2 Wochen.

2. Muskelsammlung

HINWEIS: Für dieses Experiment wurde eine 4 Wochen alte männliche Mdx-Maus durch Zervixverrenkung geopfert. Dieses Verfahren erfordert keine Anästhesie und ist eine humane Tötungsmethode in Übereinstimmung mit den lokalen Rechtsvorschriften.

1. Zerlegung des Tibialis-Anteriormuskels (TA)
   1. Nach dem Rasieren des Mausbeins, legen Sie die Maus auf den Rücken und pindien die Füße auf einem Korkbrett mit Nadeln. Entfernen Sie mit Präzisionsscheren (oder einem Skalpell) und Zangen die Beinhaut vom Fuß bis zum Knie, um die gesamte Länge der Tibia und TA freizulegen.
   2. Mit der Schere, machen einen Schnitt zwischen der Tibia und TA. Dies erleichtert die Trennung der TA vom Knochen und sorgt für einen leichten Griff zum Epimysium. Entfernen Sie mit Präzisionszangen die Epimysiumschicht vorsichtig von der Oberfläche der TA.
      HINWEIS: Ab diesem Schritt kann die TA anfälliger für Trocknung sein, die vermieden werden sollte.
   3. Im Knöchelbereich isolieren Sie die TA-Sehne von anderen Sehnen mit Zangen. Ziehen Sie die TA-Sehne vorsichtig nach oben, um sie von der Tibia und den umgebenden Muskeln zu isolieren.
   4. Wenn der TA-Bauch vollständig getrennt ist, halten Sie die Sehne hoch, so dass nur der proximale Teil des TA-Muskels am Knie befestigt ist. Trennen Sie die proximale Sehne vorsichtig so nah wie möglich am Knieknochen.
   5. Legen Sie die TA in eine Gaze, die leicht mit Salzmittel gedämpft ist, um ein Trocknen vor dem Einfrieren des Muskels zu vermeiden.
2. 70 bis 100 ml Isopentan in einem Becherglas aus Kunststoff oder Polytetrafluorethylen vorkühlen, indem man es teilweise in flüssigen Stickstoff eintaucht. Lassen Sie es abkühlen, bis das Isopentan am Boden des Bechers zu einem weißen Feststoff wird.
3. Auf einem kreisförmigen Stück Kork (20 mm x 11 mm x 8 mm) 0,5 ml Tragakantikergummi legen. Die andere Seite des Korkens sorgfältig vorbeschriften, damit die Biopsie nach dem Gefrierschritt richtig identifiziert werden kann.
4. Die TA mit Zangen, distaler Sehne nach oben in das Zahnfleisch einbetten. Um geeignete Querschnitte des Muskels zu ermöglichen, halten Sie den Muskel mit seiner Achse senkrecht zur Korkoberfläche. Die Qualität der Kryosektionen wird sich verbessern, wenn die Biopsie nicht vollständig in das Zahnfleisch eingebettet ist. Mindestens die Hälfte der TA (Tendonseite) durch das Zahnfleisch freigelegt werden lassen.
5. Tauchen Sie den Korken mit dem eingebetteten Muskel schnell in die ungefrorene, kalte Isopentanschicht. Beachten Sie, dass der Korkin in der Flüssigkeit isopentane schwimmt. Halten Sie die Probe auf den Kopf, da der Muskel in Isopentan getaucht werden muss. Lassen Sie die Proben im Isopentan für ca. 2 min, um ein vollständiges Einfrieren zu ermöglichen.
   HINWEIS: Ab diesem Stadium muss die TA bis zur Kryosektion eingefroren bleiben. Den Muskel vor der Langzeitlagerung in einem Gefrierschrank von -80 °C in Trockeneis lagern.

3. Kryosektion

1. Stellen Sie die Kryostattemperatur auf -25 °C ein. Halten Sie die Objekttemperatur bei etwa -20 °C. Fixieren Sie das Objekt im Kryostat mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung. Trimmen Sie den Muskel bis zum Erreichen des Muskelbauchs und schneiden Sie dann 7 x 10 m Abschnitte.
   HINWEIS: Die Stabilisierung der Objekttemperatur erfordert mindestens 10 min.
2. Bewahren Sie Glasgletten auf, die zum Sammeln von Kryosektionen bei Raumtemperatur (RT) verwendet werden. Sammeln Sie mindestens zwei Abschnitte auf jeder Folie. Die Muskelpartien kleben und tauen beim Kontakt der warmglasgleitenden Rutsche. Entfernen Sie die Folie und halten Sie sie bei RT.
3. Lassen Sie Abschnitte mindestens 20 min bei RT in einer belüfteten Umgebung trocknen.
4. Bewahren Sie die Kryosektionen auf Glasgletten bei -80 °C auf, bis sie verwendet werden.

4. Immunolabelling

1. Taurutschen bei RT für mindestens 15 min in einer belüfteten Umgebung.
2. Deinkieren Sie den Abschnittsbereich mit einem hydrophoben Stift. Lassen Sie die hydrophobe Barriere trocknen.
3. Fixieren Sie das Gewebe mit 2% Paraformaldehyd für 10 min in einer feuchten Kammer.
4. Waschen Sie die Abschnitte mit Phosphat gepufferter Saline (PBS) 2x für je 5 min.
5. Blockieren Sie die Muskelabschnitte mit 10% Ziegenserum in PBS für 1 h bei RT in einer feuchten Kammer verdünnt.
6. Inkubieren Sie die Abschnitte für 2 h bei RT (oder über Nacht bei 4 °C) in einer feuchten Kammer mit den primären Antikörpern in 5% Ziegenserum verdünnt. Zur einfachen IgG-Aufnahmekennzeichnung in Myofibers nur Inkubationsabschnitte mit Kaninchenantikörpern gegen Mauspanlaminin.
   HINWEIS: Andere Antigene der extrazellulären Matrix können gezielt eingesetzt werden, solange sie eine klare Kennzeichnung der umgebenden extrazellulären Matrix der Myofiber bieten. Marker für Muskelregeneration, Entzündungen oder andere Parameter können kombiniert werden, solange die Antikörper nicht in einem Mauswirt angehoben werden. Das für die Analyse verwendete Mikroskop sollte eine zusätzliche Fluoreszenzfarbe enthalten.
7. Waschen Sie die Abschnitte mit PBS 3x für jeweils 5 min.
8. Inkubieren Sie die Abschnitte mit roten fluoreszierenden Ziege polyklonalen Sekundärantikörper zu Kaninchen IgG H&L und grüne fluoreszierende Ziege polyklonalen Sekundärantikörper an Maus IgG H&L. Inkubieren bei RT für 45 min in einer feuchten Kammer.
9. Waschen Sie mit PBS 3x für je 10 min.
10. Montieren Sie die Abschnitte in einem fluoreszierenden Montagemedium, das 100 ng/mL 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) enthält, und bedecken Sie jeden Schlitten mit einem Deckel.
11. Trocknen Sie vor der Bildgebung über Nacht bei 4 °C.

Ergebnisse

Myofiber sind von einer lamininhaltigen extrazellulären Matrix umgeben. Rote Färbung begrenzt Myofibers Peripherie und ermöglicht ihre Identifizierung. IgG wird grün dargestellt. Kerne sind mit DAPI gefärbt und finden sich blau unter dem Mikroskop. Allerdings sind Die Kerne hier weiß dargestellt (Abbildung 1). Im extrazellulären Fach wird eine schwache IgG-Immunreaktivität erwartet, die bei Entzündungen erhöht werden kann. Grüne Färbung innerhalb ...

Diskussion

Myofiber-Nekrose ist eine häufige Folge traumatischer Bewegung in normalen Muskeln. Es wird durch eine starke Regenerationsfähigkeit der lokalen Muskelvorläufer gut kompensiert. Bei mehreren Muskelerkrankungen, wie z. B. bei MDs, wird die Regenerationsfähigkeit von Satellitenzellen jedoch durch chronische Myonekrose und übermäßige Fibrose beeinträchtigt. Jüngste Ergebnisse zeigen, dass Muskelfasern durch Nekkrotose, eine regulierte Form der Nekrose, absterben können. Genauer gesagt, die Hemmung der Nekrotose ka...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Circular cork disks	Pyramid Innovation	R30001-E	Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing
Cryostat	Leica	CM3050 sn34	Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers.
Dakopen	Dako	S2002	A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation
Forceps	FST	91117-10	/
Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Dilution: 1/500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Dilution: 1/500
Goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.
mdx mouse	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration
Microscope	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Embedding matrix
PFA (Paraformaldehyde)	ThermoFischer Scientific	28908	Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01	Dilution medium for immunolabeling
Precision scisors	FST	fst 14001-12 and fst 14001-14	Used for the muscle collection
Rabbit antibody to mouse pan-Laminin	Sigma Aldrich	L9393	Dilution: 1/1000
Tragacanth	Sigma Aldrich	G1128	Aliquots to keep at +4°C