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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Protokolle werden vorgestellt, um die autonomen und verhaltensorientierten Auswirkungen passiver Bewegungen bei Nagetieren mittels vertikaler Aufzugsbewegung und Riesenraddrehung zu bewerten.

Zusammenfassung

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, die autonomen und verhaltensorientierten Auswirkungen passiver Bewegung bei Nagetieren mithilfe der vertikalen Aufzugsbewegung und der Riesenradrotationsgeräte zu bewerten. Diese Assays können helfen, die Integrität und das normale Funktionieren des autonomen Nervensystems zu bestätigen. Sie sind an quantitative Maßnahmen gekoppelt, die auf der Defäkationszählung, der Offenfeldprüfung und der Gleichgewichtsbalkenüberquerung basieren. Die Vorteile dieser Assays sind ihre Einfachheit, Reproduzierbarkeit und quantitative Verhaltensmaßnahmen. Die Grenzen dieser Assays bestehen darin, dass die autonomen Reaktionen Epiphänomene nicht-vestibulärer Störungen sein könnten und dass ein funktionierendes vestibuläres System erforderlich ist. Die Untersuchung von Erkrankungen wie Reisekrankheit wird durch die detaillierten Verfahren dieser Assays erheblich unterstützt.

Einleitung

Bewegungskrankheit (MS) durch abnormale visuovestibuläre Stimulation führt zu autonomen Reaktionen, die Symptome wie epigastrische Beschwerden, Übelkeit und/oder Erbrechen1hervorrufen. Nach aktuellen Theorien kann Bewegungskrankheit durch einen sensorischen Konflikt oder neuronale Diskrepanz durch den Empfang integrierter Bewegungsinformationen verursacht werden, die sich vom erwarteten internen Modell der Umgebung2,3 oder der Posturalinstabilität unterscheiden, wie sie auf einem gähnenden Schiff auftreten würde4,5. Trotz erheblicher Fortschritte auf dem Gebiet der Reisekrankheit und der vestibulären autonomen Funktion6,7,8,9,10,11,12kann die zukünftige Forschung durch standardisierte Bewertungsprotokolle unterstützt werden. Die Bewertung der autonomen Auswirkungen von passiven Standardbewegungen wird den Untersuchungen der Ursachen und der Prävention von Reisekrankheit sehr zugute kommen. Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, die autonomen und verhaltensauffälligen Auswirkungen passiver Bewegung bei Nagetieren zu bewerten. Tiermodelle, wie Zagetiere, ermöglichen eine einfache experimentelle Manipulation (z.B. passive Bewegung und Pharmazie) und Verhaltensbeurteilungen, mit denen die Ätiologie von Bewegungskrankheiten untersucht werden kann. Hier stellen wir eine detaillierte Batterie vor, um die Auswirkungen passiver Bewegung und die Integrität der vestibulären Funktion zu testen.

Die vorliegende Studie beschreibt zwei Assays, die vertikale Bewegung des Aufzugs (EVM) und die Riesenradrotation (FWR), die autonome Reaktionen auf die passive Bewegung auslösen. Die Assays sind an drei quantitative Verhaltensmaßnahmen gekoppelt, den Gleichgewichtsstrahl (bei Mäusen13 und Ratten14,15,16,17), die Offenfelduntersuchung und die Defäkationszählung. Die EVM (ähnlich der Steigung und Rolle eines Schiffes, das auf eine Welle trifft) bewertet die vestibuläre Funktion, indem sie die otolith sensorischen Organe stimuliert, die lineare Beschleunigungen kodieren (d. h. das Saccule, das auf Bewegungen in der vertikalen Ebene reagiert)18. Das Gerät FWR (Zentrifugalrotation oder Sinusbewegung) stimuliert die Otolithorgane durch lineare Beschleunigung und die halbkreisförmigen Kanäle durch Winkelbeschleunigung19,20. Das Riesenrad/Zentrifugaldrehgerät ist einzigartig in seiner autonomen Bewertung. Bis heute ist das einzige ähnliche Gerät in der Literatur die off-vertical axis rotation (OVAR) Drehscheibe, die verwendet wird, um den vestibulo-okulären Reflex (VOR)18,21,22, konditionierte Vermeidung23,24, und die Auswirkungen der Hypergravitation25,26,27zu untersuchen. Der EVM-Assay und der FWR-Gerätetest induzieren eine vestibuläre Stimulation, die zu autonomen Reaktionen führt. Wir koppeln EVM und FWR mit quantitativen Messungen wie Ausgleichsstrahl, Defäkationszählung und Freifeldanalyse28,29,30, um robuste und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Ähnlich wie bei Mäusen13 und Ratten14,15,16,17ist der Balancestrahl-Test ein 1,0 m langer Strahl, der 0,75 m vom Boden zwischen zwei Holzhockern mit einer einfachen Black-Box-Modifikation am Zielende (Finish) aufgehängt ist. Der Gleichgewichtsbalken wurde verwendet, um Angst (obskure Black Box)14,17, traumatische Verletzung15,16,17, und hier, autonome Reaktionen, die das Gleichgewicht beeinflussen zu bewerten. Wir haben zuvor eine Defäkationszählung zur Beurteilung der autonomen Reaktion im Bewegungskrankheitsmodell durchgeführt, und es ist eine zuverlässige quantitative Messung, die leicht durchgeführt und eindeutig bewertet wird6,8,9,11. Die Open-Field-Analyse verwendet eine einfache Blackbox-Verhaltensbeurteilung mit Ethovision28, Bonsai30oder eine einfache Videoanalyse in Matlab29, um Verhalten wie Bewegung zu quantifizieren. Im aktuellen Protokoll verwenden wir die gesamte zurückgelegte Entfernung, aber wir stellen fest, dass verschiedene Paradigmen existieren (z.B. Dehnung, Bewegungszone, Geschwindigkeit, etc.) 28,29,30. Zusammen bilden diese Verfahren eine kurze Batterie von Bewertungen für die Untersuchung und Bewertung autonomer Reaktionen auf passive Bewegungen, z.B. bei Bewegungskrankheit6,7,8,9,10,11. Die vorliegenden Assays können an eine Vielzahl von Tiermodellen angepasst werden.

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Protokoll

Die vorliegende Studie und die Verfahren wurden von der Ethikkommission für Tierexperimente der Zweiten Militärmedizin (Shanghai, China) in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (US National Research Council, 1996).

1. Tiere

  1. Verwenden Sie Sprague-Dawley (SD) Ratten von zwei Monaten (200–250 g). Verwenden Sie für jeden Verhaltenstest eine separate Gruppe von Ratten. Verwenden Sie immer separate Steuerungs- und Versuchsgruppen.
    HINWEIS: Es gab zwei autonome Tests: EVM und FWR. Die EVM hatte neben einer Kontrollgruppe (= 4) drei Bedingungen mit drei Verhaltenstests (Balance-Beam, Defäkationszählung und offenes Feld = 3) mit jeweils 8 Ratten für insgesamt 96 Ratten (4 x 3 x 8). Der FWR hatte eine Bedingung zusätzlich zu einer Kontrollgruppe (= 2) mit drei Verhaltenstests (Balance-Strahl, Defäkationszählung und offenes Feld = 3) mit jeweils 8 Ratten für insgesamt 48 Ratten (2 x 3 x 8). Insgesamt berichten wir von 144 Ratten.
  2. Käfig Nagetiere unter einer konstanten Temperatur von 25 °C und 60%–70% Luftfeuchtigkeit.
  3. Haus Nagetiere in 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklen mit Zugang zu Nahrung und Trinkwasser ad libitum.
    HINWEIS: Da die folgenden Protokolle Verhaltensexperimente sind, sollten Ratten schonend behandelt werden. Der Umgang mit Tieren sollte mit beiden Händen mit Körper- und Rückenunterstützung sein, um keine Angst zu erzeugen.
  4. Führen Sie Experimente (EVM und FWR) durch und bewerten Sie Assays (Balance-Beam- und Freifeldauswertung) in der Dunkelheit, um visuelle Hinweise zu minimieren.

2. Aufzug vertikale Bewegungsvorrichtung

  1. Führen Sie die vertikalen Bewegungsverfahren des Aufzugs in völliger Dunkelheit durch, um visuelle Hinweise zu minimieren.
  2. Legen Sie die Nagetiere in die Plexiglasbox (22,5 cm x 26 cm x 20 cm). Hier bietet die Plexiglas-Box Platz für vier Nagetiere (maßgeschneidertes Gerät).
  3. Stellen Sie sicher, dass die Box geschlossen und sicher geschlossen ist, um zu vermeiden, dass Nagetiere herausfallen. Platzieren Sie die Plexiglasbox auf dem Aufzugspad des vertikalen Bewegungsgeräts des Aufzugs (maßgeschneidertes Gerät).
  4. Schalten Sie das vertikale Bewegungsgerät des Aufzugs auf die niedrigste Einstellung für die Akklimatisierung ein.
  5. Stellen Sie die Amplitude auf 22 cm nach oben und 22 cm von neutral nach unten. Inkrementelle Änderung der vertikalen Bewegung des Aufzugs wie folgt:
    1. Stellen Sie die Anfangsperioden auf 2.500 ms für 5 min, 2.000 ms für 5 min und 1.500 ms für 5 min ein.
    2. Verwenden Sie eine Testperiode von 1000 ms für 2 h.
    3. Verlangsamen Sie das Gerät in umgekehrter Richtung mit Perioden von 1500 ms für 5 min, 2000 ms für 5 min und 2500 ms für 5 min.

3. Riesenrad-Drehvorrichtung

  1. Rüstsatz des Riesenrad-Drehgeräts
    1. Legen Sie den Plexiglasbehälter (22,5 cm x 26 cm x 20 cm) auf eine Holzbank (maßgeschneidertes Gerät).
    2. Legen Sie die Nagetiere in den Plexiglasbehälter mit der langen Achse des Körpers senkrecht zur horizontalen Drehstange des Riesenrades (maßgeschneiderte Vorrichtung).
      HINWEIS: Die Platzierung mit körpersensensensen senkrecht zu horizontalem Stab sorgt für die Stimulation der Otolithorgane (vorder-posterior und vertikale Richtung) während der Rotation.
    3. Schließen Sie die Plexiglasdose sicher.
    4. Legen Sie den zweiten Satz Nagetiere in den Plexiglasbehälter mit der langen Achse des Körpers senkrecht zur horizontalen Drehstange am zweiten Arm der Riesenrad-Drehvorrichtung. Verwenden Sie einen zweiten Satz Nagetiere mit ähnlicher Masse, um das Riesenrad auszugleichen.
    5. Schließen Sie die Plexiglasbox sicher und legen Sie sie auf das Riesenrad-Drehgerät.
  2. Riesenrad-Rotationsverfahren
    1. Führen Sie die Radrotationsverfahren bei völliger Dunkelheit durch, um visuelle Hinweise zu minimieren.
    2. Starten Sie das Riesenrad, das sich im Uhrzeigersinn bei 16°/s2 dreht, um eine Winkelgeschwindigkeit von 120°/s zu erreichen, und beginnen Sie dann, bei 48°/s2 zu verlangsamen, um 0°/s zu erreichen. Nach einer 1 s Pause den Behälter in der gleichen Weise wie oben gegen den Uhrzeigersinn drehen zu lassen (Beschleunigung bei 16°/s2, um eine Winkelgeschwindigkeit von 120°/s zu erreichen und dann bei 48°/s2 zu verzögerungsvoll zu drehen, um 0°/s zu erreichen). Der Zyklus im Uhrzeigersinn-Pause-Gegentakt benötigt ca. 10 s, um seine Ausgangsposition zu erreichen.
    3. Fahren Sie die Drehung im Uhrzeigersinn für 2 h pro Sitzung für ca. 720 Umdrehungen fort.

4. Bewertung von EVM und FWR

ANMERKUNG: Die Bewertung der Ferris-Rad-Drehvorrichtung und der vertikalen Bewegung des Aufzugs erfolgt durch drei Verfahren: Gleichgewichtsstrahlprüfung, Defäkationszählung und Offenfeldprüfung. Identische Verfahren werden verwendet, um die vertikale Bewegung des Aufzugs zu bewerten. Diese Bewertungsverfahren sollten so bald wie möglich nach der Raddrehung oder der vertikalen Aufzugsbewegung durchgeführt werden.

  1. Balance-Strahl
    1. Balance-Strahl-Setup
      1. Richten Sie den Ausgleichsbalken10,11,12 ein, indem Sie zwei Holzhocker (ca. 0,75 m Höhe) im Versuchsfeld, ca. 110 cm voneinander entfernt, platzieren.
      2. Legen Sie eine schwarze Plastikbox (15 cm x 15 cm x 8 cm) auf den Fertighocker.
      3. Legen Sie einen schmalen Holzbalken (2,5 cm x 130 cm) zwischen die beiden Hocker, so dass ein Abstand von 100 cm zwischen den Hockerkanten, vom Starthocker bis zum Fertighocker.
        HINWEIS: Der Eingang zur schwarzen Plastikbox sollte an der Ziellinie der 100 cm sein.
      4. Legen Sie eine Lampe am Starthocker. Schalten Sie die Lampe ein.
      5. Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus und stellen Sie sicher, dass das Zimmer so dunkel wie möglich ist. Dadurch wird sichergestellt, dass das Nagetier der Richtung des Gleichgewichtsstrahls vom beleuchteten Bereich zum verdunkelten Bereich folgt.
    2. Balance-Strahl-Verfahren
      HINWEIS: Der motorische Koordinationstest des Gleichgewichtsstrahls wird durch Messung der Zeit gemessen, die für die Durchquerung des erhöhten Holzbalkens erforderlich ist.
      1. Trainieren Sie jedes Nagetier täglich für 3 aufeinander folgende Tage, vor dem Untersuchungszeitraum, um eine stabile Leistung auf dem Schwebebalken10zu erreichen. Trainieren Sie, indem Sie die Ratte in den Balken in der beleuchteten Ecke einführen und sie dazu auffordert, den Balken zu überqueren. Irgendwann wird die Ratte von sich aus kreuzen. Ratten im vorliegenden Protokoll dauerten 3,6 x 0,9 Sekunden.
        HINWEIS: Einige Nagetiere erreichen während des Trainings keine stabile Leistung und sollten ausgeschlossen werden. Einige Nagetiere erfüllen die Aufgabe nicht, während andere keine Motivation haben, den Balken zu überqueren. Stabile Leistung war zwei aufeinanderfolgende Testperioden der Überfahrtszeiten weniger als 4 Sekunden. Fällt eine Ratte während der Ausbildung oder Bewertung ab und sollte sie als "Fallfall" der Ratte kategorisiert und nicht weiter bewertet werden.
      2. Für den eigentlichen Ablauf das trainierte Nagetier auf den Starthocker in der Nähe des Lichts legen und gleichzeitig auf eine Stoppuhr drücken. Das Nagetier sollte den Gleichgewichtsbalken schnell überqueren und in die Blackbox auf dem Zielhocker eindringen.
      3. Drücken Sie den Start auf der Stoppuhr, sobald das Nagetier an Ort und Stelle ist, und drücken Sie Stopp, wenn die Nase in die dunkle Box auf dem Zielhocker eintritt. Die Zeit, um den Balken zu durchqueren, ist vom Starthocker bis zum Ende des Hockers.
        HINWEIS: Sobald das Nagetier trainiert ist, können Sie vor der Auswertung eine Intervention oder Manipulation durchführen, z. B. die Induzierung von Reisekrankheit. Sie können auch eine Basismessung erhalten, bevor sie eingreifen, indem Sie die Zeit für die Durchquerung der letzten Trainingseinheit verwenden.
  2. Defäkationszählung
    1. Legen Sie den Plexiglasbehälter mit den vier Nagetieren nach der Riesenrad-Testphase auf eine Bank.
    2. Entfernen Sie die Nagetiere und legen Sie sie in einzelne Offene Felder (unten).
    3. Zählen Sie die Anzahl der Kotpellets in der Plexiglasbox, die jedem Nagetier zugeschrieben wird.
      ANMERKUNG: Für den Vergleich mit der Auswertung nach Aufzugsbewegung kann eine Basismessung durch Zählen von Kotpellets vor der vertikalen Aufzugsbewegung erhalten werden.
  3. Freifeldprüfung
    1. Legen Sie die Nagetiere in den offenen Feldkasten (40 cm x 40 cm x 45 cm).
    2. Zeichnen Sie das Verhalten des offenen Feldes mit einer IR-Videokamera für 3 min28,29,30 auf.
    3. Bestimmen Sie die gesamte zurückgelegte Strecke.
      HINWEIS: Es ist sehr wichtig, das Nagetier NICHT in den offenen Feldkasten vor der vertikalen Bewegung des Aufzugs zu platzieren. Die Umwelt muss für das Nagetier neu sein. Daher sollten Basismessungen NICHT für die Offene Felduntersuchung durchgeführt werden.

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Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt repräsentative Gleichgewichtsstrahlergebnisse der Zeit, die bis zur Querung aufgewirlegt wird. Ratten wurden für 3 aufeinander folgende Tage trainiert, um eine stabile Leistung auf dem Schwebebalken10zu erreichen. Am darauffolgenden Tag wurden Ratten auf Die Schwebebalkenleistung untersucht. In der y-Achse der Figur haben wir die Anzahl der Sekunden, die Nagetiere für den Ausgleich für Riesenrad, vertikale Bewegung des Aufzugs und Steuergruppen f...

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Diskussion

Die vorliegende Studie beschreibt die Bewertung autonomer Reaktionen auf passive Bewegungen bei Nagetieren mit vertikaler Aufzugsbewegung und Riesenraddrehung. Diese Geräte und Verfahren können leicht an andere Nagetiere übernommen werden, und es bestehen mehrere Modifikationen der Assays, um die vestibuläre Funktion unter verschiedenen Umständen zu bestätigen, z. B. bei pharmakologischen Herausforderungen oder chirurgischen Eingriffen. Forschung an MS durch vestibuläre Stimulation ausgelöst hat zu der Theorie ge...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine finanziellen oder nichtfinanziellen Interessenkonflikte. Das FWR-Gerät hat ein Patent in China: ZL201120231912.1.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise vom Hong Kong Research Grants Council, Early Career Scheme, Project #21201217 to C. L. unterstützt. Das FWR-Gerät hat ein Patent in China: ZL201120231912.1.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Elevator vertical motion deviceCustomCustom-made Elevator vertical motion device to desired specifications
EthovisionNoldus Information TechnologyVideo tracking software
Ferris-wheel rotation deviceCustomCustom-made Ferris-wheel rotation device to desired specifications
Latex, polyvinyl or nitrile glovesAMMEXUse unpowdered gloves 8-mil
Open field boxCustomDarkened plexiglass box with IR camera
Rat or mouseJAX labsAny small rodent
Small rodent cageTecniplast1284L
Wooden beam and stoolsCustomCustom-made wooden beam and stools to specifications indicated

Referenzen

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