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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung hochwertiger, großflächiger Transkriptomdaten einzelner Zellen aus isolierten menschlichen Pankreasinseln unter Verwendung einer tropfenbasierten mikrofluidischen einzelligen RNA-Sequenzierungstechnologie vor.

Zusammenfassung

Pankreasinseln bestehen aus endokrinen Zellen mit ausgeprägten Hormonexpressionsmustern. Die endokrinen Zellen zeigen funktionelle Unterschiede in der Reaktion auf normale und pathologische Bedingungen. Ziel dieses Protokolls ist es, hochwertige, groß angelegte Transkriptomdaten jedes endokrinen Zelltyps unter Verwendung einer tropfenbasierten mikrofluidischen einzelzelligen RNA-Sequenzierungstechnologie zu generieren. Solche Daten können verwendet werden, um das Genexpressionsprofil jedes endokrinen Zelltyps unter normalen oder spezifischen Bedingungen zu erstellen. Der Prozess erfordert eine sorgfältige Handhabung, genaue Messung und eine strenge Qualitätskontrolle. In diesem Protokoll beschreiben wir detaillierte Schritte für die Dissoziation, Sequenzierung und Datenanalyse menschlicher Pankreasinseln. Die repräsentativen Ergebnisse von rund 20.000 menschlichen Einzel-Isletzellen zeigen die erfolgreiche Anwendung des Protokolls.

Einleitung

Pankreasinseln setzen endokrine Hormone frei, um den Blutzuckerspiegel zu regulieren. An dieser wesentlichen Rolle sind fünf endokrine Zelltypen beteiligt, die sich funktionell und morphologisch unterscheiden: Die Zellen produzieren Glucagon, Insulin, Somatostatin, PP-Zellen Pankreaspolypeptid und ghrelin1. Genexpressionsprofilierung ist ein nützlicher Ansatz, um die endokrinen Zellen unter normalen oder spezifischen Bedingungen zu charakterisieren. Historisch gesehen wurde die gesamte Islet-Genexpression Profilierung mit Microarray und RNA-Sequenzierung der nächsten Generationerstellt 2,3,4,5,6,7 , 8. Obwohl das gesamte Islet-Transkriptom informativ ist, um die organspezifischen Transkripte und Krankheitskandidatengene zu identifizieren, gelingt es ihm nicht, die molekulare Heterogenität jedes Ischenzelltyps aufzudecken. Lasercapture Microdissection (LCM) Technik wurde angewendet, um spezifische Zelltypen direkt von Inselchen9,10,11,12 zu erhalten, aber unter der Reinheit der Zielzelle bevölkerung. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet, um spezifische endokrine Zellpopulationen auszuwählen, wie z. B. die Zellen13,14,15,16 , 17 , 18. Darüber hinaus verwendeten Dorrell et al. einen antikörperbasierten FACS-Sortieransatz, um die Zellen in vier Subpopulationen zu klassifizieren19. FACS-sortierte Isletzellen können auch für die RNA-Sequenzierung einzelner Zellen plattiert werden; Die plattenbasierten Methoden stehen jedoch vor Herausforderungen in der Skalierbarkeit20,21,22.

Um hochwertige, groß angelegte Transkriptomdaten jedes endokrinen Zelltyps zu generieren, haben wir mikrofluidische Technologie auf menschliche Ischenzellen angewendet. Die mikrofluidische Plattform generiert Transkriptomdaten aus einer großen Anzahl von Einzelzellen in hoher Durchsatz- und Qualitäts- und Skalierbare Art und Weise23,24,25,26,27. Die hochskalierbare mikrofluidische Plattform zeigt nicht nur die molekularen Eigenschaften eines in großer Menge erfassten Zelltyps auf, sondern ermöglicht auch die Identifizierung seltener Zelltypen, wenn genügend Zellen zur Verfügung gestellt werden. Daher erlaubte die Anwendung der Plattform auf menschliche Pankreasinseln die Profilierung von Ghrelin-Sekretionszellen, einem seltenen endokrinen Zelltyp mit wenig bekannter Funktion aufgrund seiner Knappheit28. In den letzten Jahren wurden mehrere Studien von uns und anderen veröffentlicht, die umfangreiche Transkriptome-Daten menschlicher Inselchen mit der Technologie29,30,31,32, 33. Die Daten sind öffentlich zugänglich und nützliche Ressourcen für die Islet-Gemeinschaft, um die heterokrine Zellheterogenität und ihre Auswirkungen auf Krankheiten zu untersuchen.

Hier beschreiben wir ein tropfenbasiertes mikrofluidisches, einzelliges RNA-Sequenzierungsprotokoll, das zur Erstellung von Transkriptomdaten von ca. 20.000 menschlichen Ischenzellen verwendet wurde, einschließlich der zellen- und nichtendokrinen Zellen, einschließlich der Zellen von , , , , , , PP, 32. Der Workflow beginnt mit isolierten menschlichen Inselchen und zeigt Schritte der Inselzelldissoziation, Einzelzellerfassung und Datenanalyse. Das Protokoll erfordert die Verwendung von frisch isolierten Inselchen und kann auf Inselchen von Menschen und anderen Arten, wie Nagetieren, angewendet werden. Mit diesem Workflow können unvoreingenommene und umfassende Isletzellatlas unter Baseline und anderen Bedingungen erstellt werden.

Protokoll

1. Menschliche Islet-Dissoziation

  1. Erhalten Sie menschliche Inselchen isoliert von Kadaver Organspendern beiderlei Geschlechts, im Alter zwischen 15-80 Jahren, ohne bereits bestehende Krankheiten, es sei denn Inselchen von Spendern mit spezifischen demographischen sind für den Studienzweck erforderlich.
    1. Nach der Isolierung die isolierten Inselchen 2-3 Tage beim Lieferanten in der Gewebekulturanlage aufbewahren lassen. Es dauert oft mehr als 1 Tag, bis Diebesschäden sichtbar werden.
    2. Legen Sie die Inselchen in eine Flasche und tauchen Sie sie vollständig in das Inselmedium ein. Holen Sie es ins Labor durch über Nacht Versand.
    3. Beziehen Sie die Inseläquivalentmenge (IEQ) der gelieferten Inselchen vom Insellieferanten.
  2. Stellen Sie am Tag der Ankunft der Insel Insel inseln aus der Sendung zurück. Führen Sie diesen Schritt mit einer Haube durch, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu minimieren.
    1. Kühlen Sie das komplette Islet-Medium (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x Pen-Strep, 2 mM Glutamin) im Kühlschrank.
    2. Übertragen Sie die Inselchen aus der Flasche auf ein 50 ml konisches Rohr.
    3. Fügen Sie 10 ml vorgekühlte komplette Inselmedien in die geleerte Flasche ein, um die restlichen Inselchen auszuwaschen. Übertragen Sie das Medium auf die konische Röhre.
    4. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 x g für 2 min, um Inselchen zurückzugewinnen. Aspirieren Sie den Überstand, der etwa 1-2 ml Medien mit dem Pellet verlässt.
    5. Setzen Sie die Inselchen mit vorgekühlten kompletten Inselmedien wieder auf. Fügen Sie auf der Grundlage des vom Lieferanten bereitgestellten IEQ 12 ml Medien pro 5000 IEQ hinzu.
    6. Gießen Sie die Inselchen in den Medien auf eine 10 cm unbehandelte Gewebekulturschale. Über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 in der Luft inkubieren.
  3. Dissoziieren Sie Inselchen, wie unten gezeigt. Führen Sie diesen Schritt nach der nächtlichen Inkubation aus.
    1. Vorwarme komplette Islet-Medien und Zelldissoziationslösung.
    2. Bereiten Sie 1x PBS mit 0,04% BSA bei Raumtemperatur vor.
    3. Zählen und handpflücken Sie 200-300 Inselchen mit einer P200 Pipette und übertragen Sie die Inselchen in ein 15 ml konisches Rohr mit 5 ml vorgewärmten kompletten Inselmedien.
    4. Sammeln Sie die Inseln durch Zentrifugation bei 200 x g für 2 min. Den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Pellet auf dem Boden zu stören.
    5. 1,0 ml vorgewärmte Zelldissoziationslösung hinzufügen und das Pellet durch sanftes Auf- und Abpfeifen stören. Inkubieren Sie die Inselchen bei 37 °C für 9-11 min. Alle 3 min Pipette langsam für 10 s nach oben und unten, um die Zellen in einzelne Zellen zu dissoziieren.
    6. Sobald die Isletzellen gut dissoziiert sind und die Lösung trüb wird, fügen Sie 9 ml komplette Islet-Medien hinzu und filtern Sie durch ein 30 m großes Zellsieb in ein neues 15 ml konisches Rohr.
    7. Waschen Sie das Rohr und das Zellsieb mit 2 ml kompletten Inselmedien, um die restlichen Inselchen zu sammeln und in das gleiche Rohr hinzuzufügen.
    8. Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min.
    9. Bereinigen Sie medienschonend und setzen Sie das Zellpellet in 5 ml 1x PBS mit 0,04% BSA (PBS-BSA) wieder auf.
    10. Filtern Sie durch ein neues 30-m-Zellsieb in ein 15 ml konisches Rohr und zentrifugieren Bei 400 x g für 5 min, um Zellen zu sammeln.
    11. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 200-300 l 1x PBS-BSA-Lösung wieder auf.
    12. Messen Sie die Zellkonzentration und passen Sie das Volumen auf eine Endkonzentration von 400-500 Zellen/L an.

2. Einzelzellen-Suspension Qualitätskontrolle

  1. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem fluoreszenzbasierten automatisierten Zellzähler34.
    1. Mischen Sie 10 L-Zellen mit 0,5 l AO/DAPI. Pipette-Mischung gründlich. Laden Sie 10,5 L auf die Folie, und führen Sie den Zellzähltest aus, um die Anzahl und Lebensfähigkeit zu bestimmen.
    2. Verdünnen und/oder filtern Sie die Zellsuspension je nach Bedarf auf der Grundlage der Zellzahl.

3. Einzelzellteilung mit einem mikrofluidischen Chip. Folgen Sie dem Protokoll des Mikrofluid-Chipherstellers35.

  1. 3' Gelperlen und Reverse Transkriptionsreagenzien (RT) auf Raumtemperatur bringen (>30 min). Stellen Sie bei Bedarf den RT-Primer im TE-Puffer wieder her.
  2. Bereiten Sie die RT-Mastermischung in einem Rohr mit niedriger Bindung vor, wie in Tabelle 1beschrieben.
  3. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die für jede Probe eingegeben werden sollen. Berechnen Sie das Zellsuspensionsvolumen (X), das erforderlich ist, um die gewünschte Zielzellenzahl zu liefern. Das berechnete Volumen des nukleasefreien Wassers, das jeder Probe hinzugefügt werden soll, beträgt 33,8-X-L.
  4. Fügen Sie für jede zu partitionierende Probe 33,8-X-L-Nuklease-freies Wasser in 0,2 ml PCR-Streifenrohr ein. Fügen Sie dann jedem Streifenrohr einen Mastermix von 66,2 l hinzu. Fügen Sie die Zellen an dieser Stelle nicht zum Streifenrohr hinzu. Pipette sanft zu mischen. Die vorbereiteten Streifenrohre auf Eis legen.
  5. Legen Sie einen mikrofluidischen Chip in ein Chipgehäuse. Richten Sie das Chipgehäuse aus, um sicherzustellen, dass Ölquellen (Zeile mit der Bezeichnung 3) der Person, die das Experiment durchführt, am nächsten sind.
  6. Wenn Sie weniger als 8 Proben ausführen, verwenden Sie 50 % Glycerin, um nicht verwendete Kanäle in der folgenden Reihenfolge zu füllen:
    1. Fügen Sie 90 l 50% Glycerin in die Brunnen in Reihe 1 für alle ungenutzten Kanäle.
    2. Fügen Sie 40 l 50% Glycerin in die Brunnen in Reihe 2 für alle ungenutzten Kanäle.
    3. Fügen Sie 270 l 50% Glycerin in die Brunnen in Zeile 3 für alle ungenutzten Kanäle.
  7. Schnappen Sie die Gelperlen in einen Wirbel. Wirbel bei voller Geschwindigkeit für 30 s. Tippen Sie den Streifen auf der Bank Spitze mehrmals, um Perlen zu sammeln. Bestätigen Sie, dass keine Blasen vorhanden sind.
  8. Fügen Sie den vorbereiteten Streifenröhrchen X L zellen. Pipette zu mischen 5 mal. Ohne die Pipettenspitzen zu entsorgen, übertragen Sie 90 l Zellmischung in Zeile 1 des Chips.
  9. Warten Sie 30 s, und laden Sie dann 40 l Gelperlen auf Zeile 2. Pipette sehr langsam für diesen Schritt. Geben Sie 270 l Trennöl in die Brunnen der Reihe 3.
  10. Haken Sie die Chipdichtung an die Laschen des Chiphalters. Legen Sie den montierten Chiphalter in das Einzelzellen-Trenngerät und drücken Sie die Run-Taste.
  11. Entfernen Sie sofort den montierten Spanhalter nach Ausführung der Laufzeit.
  12. Entfernen Sie die Spandichtung aus dem Halter, öffnen Sie das Spangehäuse in einem 45°-Winkel, und entfernen Sie 100 l der Emulsion aus dem Chip in eine blaue 96-Well-Kunststoffplatte.

4. Einzelzellige cDNA-Verstärkung. Folgen Sie dem Protokoll des Mikrofluid-Chipherstellers35.

  1. Reverse Transkription.
    HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt unter einer sauberen PCR-Haube durch, um eine mikrobielle und andere Kontamination der nicht amplifizierten cDNA zu verhindern.
    1. Versiegeln Sie die 96-Well-blaue Platte mit einer Foliendichtung auf einem beheizten Plattenversiegelung.
    2. Führen Sie die umgekehrte Transkriptionsreaktion in einem thermischen Cycler wie folgt aus: 53 °C für 45 min bei 85 °C für 5 min bei 4 °C halten.
      HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt. Proben können bei 4 °C für bis zu 72 h halten.
  2. Nach-RT-Reinigung
    1. Bringen Sie die Nukleinsäure bindung magnetische Perlen und Nukleinsäure Größe Auswahl magnetische Perlen auf Raumtemperatur und Wirbel wieder aufhängen. An dieser Stelle den Probenreinigungspuffer 10 min bei 65 °C auftauen. Bringen Sie alle anderen Reagenzien auf Raumtemperatur und Wirbel.
    2. Bereiten Sie die Puffer vor, wie in den Tabellen 2 und 3dargestellt.
  3. Chemisch brechen die Emulsion und reinigen.
    1. Entfernen Sie dazu vorsichtig die Foliendichtung von der Platte.
    2. Geben Sie 125 l rosa emulsionsbrechendes Reagenz in jede Emulsion ein. Warten Sie 1 min, und übertragen Sie dann das gesamte Volumen auf ein sauberes 0,2 ml Streifenrohr. Stellen Sie sicher, dass sich eine klare Und eine Schicht von Rosa im Streifenrohr befindet.
    3. Entfernen Sie 125 l der rosa Schicht von der Unterseite des Streifenrohrs, ohne die klare Schicht zu stören. Es ist normal, dass ein kleines Volumen der rosa Schicht in der Röhre verbleibt.
    4. Fügen Sie 200 L Cleanup-Mix aus Tabelle 2 in das Streifenrohr und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
    5. Übertragen Sie das Bandrohr auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie die Lösung ablöschen. Entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie, dann waschen Sie die Perlen mit 80% Ethanol zweimal. Lassen Sie die Perlen für 1 min trocknen.
    6. Entfernen Sie das Streifenrohr vom Magneten und fügen Sie 35,5 L Elutionslösung aus Tabelle 3 zu den Perlen hinzu. Pipette, um die Perlen in der Lösung wieder auszusetzen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Übertragen Sie das Bandrohr auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie die Lösung ablöschen. Entfernen Sie die gereinigte cDNA aus dem Bandrohr und geben Sie sie aus, um 0,2 ml Streifenrohre zu reinigen.
  4. Verstärken Sie die cDNA.
    1. Bereiten Sie den Verstärker-Master-Mix in Tabelle 4vor.
    2. Fügen Sie jeder Probe 65 L cDNA Amplification Master Mix hinzu. Legen Sie das Bandrohr in einen Thermischen Cycler und führen Sie folgendes Programm aus: 98 °C 3 min bei 15 Zyklen von [98 °C 15 s bei 67 °C 20 s bei 72 °C 1 min] bei 72 °C 5 min bei 4 °C halten
      HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt. Proben können bei 4°C bis zu 72 h halten.
    3. Reinigen Sie die verstärkte cDNA mit 0,6x Nukleinsäuregrößenauswahl magnetische Perlen. Zweimal mit 80% Ethanol waschen und mit 40,5 l elute.
    4. Führen Sie die Qualitätskontrolle cDNA mit automatisierter Gelelektrophorese und Fluoreszenz-basierte DNA-Quantifizierung Assay36,37.
      HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt. Proben können bei 4 °C bis zu 72 h oder bei -20°C auf unbestimmte Zeit halten.

5. Sequenzierung Bibliotheksbau

  1. Tagmentierung und Bereinigung von cDNA38.
    1. Normalisieren Sie cDNA auf 50 ng in 20 l des Gesamtvolumens. Die genaue Quantifizierung ist in diesem Schritt von entscheidender Bedeutung.
    2. Machen Sie die Tagmentierung in Tabelle 5 und aliquot 30 l zu jeder 20-L-cDNA-Probe auf Eis. Legen Sie die Proben in den thermischen Cycler und führen Sie das Tagmentationsprotokoll: 55 °C 5 min bei 10 °C halten.
    3. Führen Sie die Bereinigung von tagmented cDNA mithilfe der Spalten38durch. Fügen Sie jeder Probe einen DNA-Bindungspuffer von 180 l hinzu. Übertragen Sie 230 l in eine Spin-Spalte.
    4. Zentrifugieren Sie bei 1300 x g für 2 min und entsorgen Sie den Durchfluss.
    5. Zweimal mit 300 L DNA-Waschpuffer waschen. Zentrifugieren Sie zusätzlich 2 min bei 1300 x g, um die Ethanolentfernung zu gewährleisten.
    6. Elute gereinigt etagmented cDNA durch Zugabe von 31 l Elutionspuffer in die Säule und inkubieren bei Raumtemperatur für 2 min.
    7. Zentrifuge für 2 min bei 1300 x g, um das gereinigte Produkt zurückzugewinnen.
  2. Beispielindex PCR.
    1. Wählen Sie Barcodes aus, die sich während eines Multiplex-Sequenzierungslaufs nicht überlappen.
    2. Erstellen Sie einen PCR-Mastermix für Beispielindizes, wie in Tabelle 6dargestellt.
    3. Fügen Sie den Sample Index PCR-Master-Mix 60 l der gereinigten Probe hinzu.
    4. Fügen Sie jeder Probe 10 L eines 4-Oligo-Probenindexs von 20 ,M und 4,00 % hinzu (verwendete Datensatzindex). Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt nun 100 l.
    5. In einen Thermocycler mit dem Deckel auf 105 °C stellen. Führen Sie das folgende Programm aus: 98 °C 45 s bei 12-14 Zyklen von [98 °C 20 s bei 54 °C 30 s bei 72 °C 20 s] bei 72 °C 1 min bei 4 °C halten.
      HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt. Proben können bei 4 °C für bis zu 72 h halten.
  3. Reinigen Sie Bibliotheken mit doppelter Perlenbereinigung.
    1. Fügen Sie der Probe 100 l Nukleinsäuregrößenauswahl magnetische Perlen hinzu und mischen Sie sie gründlich mit einer Pipette. Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
    2. Auf einen Magneten übertragen und stehen lassen, bis die Lösung klar ist. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
    3. Zweimal mit 200 l 80% Ethanol waschen.
    4. Trocknen Sie die Perlen auf dem Magneten für 2 min. Entfernen Sie vom Magneten und fügen Sie 50,5 L EB Buffer zum Perlenpellet hinzu. Pipette, um die Perlen im Puffer wieder zu suspendieren.
    5. Bei Raumtemperatur 2 min. auf einen Magneten übertragen und 2 min stehen lassen. 50 l eluierte Probe in ein reines Bandrohr geben.
    6. Fügen Sie der Probe 40 L Nukleinsäuregrößenauswahl magnetische Perlen hinzu und brüten bei Raumtemperatur für 5 min. Auf einen Magneten übertragen und lassen Sie die Lösung frei. Entfernen und verwerfen Sie Überstand.
    7. Zweimal mit 125 l 80% Ethanol waschen.
    8. Trocknen Sie die Perlen auf dem Magneten für 2 min. Entfernen Sie vom Magneten und fügen Sie 60,5 L EB Buffer zum Perlenpellet hinzu. Pipette, um die Perlen im Puffer wieder zu suspendieren.
    9. Bei Raumtemperatur 2 min. auf einen Magneten übertragen und 2 min stehen lassen. 50 l eluierte Probe in ein reines Streifenrohr geben. Dies ist die letzte Bibliothek.
    10. Proben bei 4 °C bis 72 h oder bei -20 °C unbestimmt halten. Beachten Sie, dass dies ein sicherer Haltepunkt ist.
  4. Quantifizieren und durchführen Sie die Qualitätskontrolle von Endbibliotheken mit automatisierter Gelelektrophorese und fluoreszenzbasierter DNA-Quantifizierungs-Assay36,37. Verdünnen Sie die Proben 1:10 vor der laufenden Qualitätskontrolle.

6. Bibliothekssequenzierung

  1. Normalisieren Sie jede Probe, die auf 2 ng/L sequenziert werden soll, und bündeln Sie 3 L jeder normalisierten Probe zusammen.
  2. Messen Sie die Poolkonzentration mit dem fluoreszenzbasierten DNA-Quantifizierungstest37.
  3. Verdünnen Sie den Pool auf 0,25 ng/L.
  4. Denaturieren des Pools wie folgt: 12 l verdünnte gepoolte Probe (0,25 ng/l) + 1 l DNA-Kontrolle (1 nM), 2 L EB-Puffer + 5 L NaOH (0,4N). Lassen Sie diese inkubieren für 5 min, dann fügen Sie 10 l von 200 mM Tris pH 8.0.
  5. Laden Sie 4,05 l in 1345,95 l HT1. 1,3 ml in die Sequenzerkassette laden und nach Herstellerrichtlinien39 nach einem Sequenzierungsrezept mit 26 Zyklen (Read 1) + 8 Zyklen (i7 Index) + 0 Zyklen (i5 Index) + 55 Zyklen (Lesen 2) laufen.

7. Ausrichtung lesen (Ergänzungsdatei 1)

  1. Führen Sie Cell Ranger (v2.0.0) aus, um BCL-Dateien (Demultiplex Raw Base Call) zu demultiplex, die durch Sequenzierung in FASTQ-Dateien generiert werden. Richten Sie FASTQ-Dateien an der menschlichen B37.3-Genom-Baugruppe und dem UCSC-Genmodell aus, um die Expressionsquantifizierung zu erhalten.
  2. Ausrichtung Qualitätskontrolle.
    1. Generieren Sie Ausrichtungsmetriken und überprüfen Sie Q30-Basen, gültigen Barcode-Bruch, zellverknüpften Leseanteil, zugeordneten Leseanteil und Lesevorgänge, die in jeder Zelle erkannt werden.
    2. Untersuchen Sie das Barcode-Rangdiagramm, um sicherzustellen, dass die zelleverknüpften Barcodes und der Hintergrund getrennt werden.

8. Datenanalyse (Ergänzungsdatei 2)

  1. Zellqualitätskontrolle und Vorverarbeitung.
    1. Schließen Sie Zellen mit < 500 nachgewiesenen Genen aus, < 3000 Gesamtanzahl der eindeutigen molekularen Identifikatoren (UMI), > 0,2 Lebensfähigkeitsbewertung wie zuvor beschrieben32. Passen Sie die Cutoffs nach Gewebe- und Zelltypen an.
    2. Doublets entfernen.
      1. Bewerten Sie die fünf endokrinen Hormongene (Glucagon - GCG, Insulin - INS, Somatostatin - SST, Pankreaspolypeptid - PPYund Ghrelin - GHRL) für bimodale Expressionsmuster (Hoch- und Niederexpressionsmodus) mit R Paket mclust40.
      2. Entfernen Sie Zellen, die mehr als ein Hormongen exprimieren, d.h. mit zwei oder mehr Hormongenen im Modus mit hoher Expression.
    3. Normalisieren Sie die Genexpression mit der gesamten UMI und multiplizieren Sie mit dem Skalierungsfaktor 10.000 auf Zellebene mit dem R-Paket Seurat41.
    4. Entfernen Sie Gene, die in weniger als 3 Zellen nachgewiesen wurden.
    5. Erkennen Sie variable Gene unter Verwendung der durchschnittlichen Expression und Dispersion aller Zellen. Passen Sie die Cutoffs an die Gewebe- und Zelltypen an.
  2. Führen Sie die Hauptkomponentenanalyse mit den variablen Genen durch. Clusterzellen mit der ausgewählten Anzahl von Hauptkomponenten. Leiten Sie zellclusterangereicherte Gene ab, indem ein Zellcluster mit dem Rest der Zellen verglichen wird.

Ergebnisse

Der einzellige RNA-Sequenzierungsworkflow besteht aus drei Schritten: Dissoziierung intakter menschlicher Inselchen in einzelzellige Suspension, Erfassung einzelner Zellen mit einer Tröpfchen-basierten Technologie und Analyse von RNA-Seq-Daten (Abbildung 1). Erstens wurden die erworbenen menschlichen Inseln über Nacht inkubiert. Die intakten Inseln wurden unter dem Mikroskop untersucht (Abbildung 2A). Die Integrität dissoziier...

Diskussion

Einzellige Technologien, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, bieten eine neue Plattform, um Zelltypen zu charakterisieren und molekulare Heterogenität in menschlichen Pankreasinseln zu untersuchen. Wir haben ein Protokoll der tropfenbasierten mikrofluidischen Einzelzellisolierung und Datenanalyse zur Untersuchung menschlicher Inselchen angenommen. Unser Protokoll produzierte erfolgreich RNA-Sequenzierungsdaten aus über 20.000 einzelnen menschlichen Ischenzellen mit relativ geringen Variationen in Sequenzqualit...

Offenlegungen

Alle Autoren sind Mitarbeiter und Aktionäre von Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Danksagungen

nichts

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
30 µm Pre-Separation FiltersMiltenyi Biotec130-041-407Cell strainer
8-chamber slidesChemometec102673-680Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626for QC
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns10X Genomics120237Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)10X Genomics120236Microfluidic chips
CMRL-1066ThermoFisher11530-037Complete islet media
EB BufferQiagen19086Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirtedVWR47744-112Emulsion plate
Fetal Bovine SerumThermoFisher16000-036Complete islet media
Human isletsProdo LabsHIRIsolated human islets
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher25030-081Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples)IlluminaFC-121-1031Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)IlluminaFC-404-2005Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140-122Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA KitLife TechnologiesQ32854for QC
Solution 18Chemometec103011-420Cell counting assay reagent
SPRISelect ReagentFisher ScientificB23318Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm)VWR10861-594for islet culture
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactionsVWR77001-152Library clean up columns

Referenzen

  1. Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
  2. Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
  3. Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
  4. Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
  5. Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
  6. Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
  7. Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
  8. van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
  9. Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
  10. Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  11. Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
  12. Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  13. Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
  14. Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
  15. Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  16. Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
  17. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
  18. Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  20. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  21. Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
  22. Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  23. Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
  24. Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
  25. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  26. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  27. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
  28. Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
  29. Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  30. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  31. Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
  32. Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
  33. Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
  34. Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
  35. 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
  36. Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
  37. Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
  38. Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
  39. Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
  40. Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
  41. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
  42. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
  43. DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
  44. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
  45. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
  46. Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
  47. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  48. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  49. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).

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