Bewertung von oxidativen Schäden in den primären Maus-Augen-Oberflächenzellen/Stammzellen als Reaktion auf Uv-C-Schäden (UV-C)

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert den gleichzeitigen Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), lebenden Zellen und abgestorbenen Zellen in lebenden Primärkulturen aus Maus-Augenoberflächenzellen. 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate, Propidiumiodid und Hoechst-Färbung werden verwendet, um die ROS,, abgestorbene Zellen und lebende Zellen zu bewerten, gefolgt von Bildgebung und Analyse.

Zusammenfassung

Die Augenoberfläche ist aufgrund verschiedener Umwelteinflüsse regelmäßig abnutzend. Die Exposition gegenüber UV-C-Strahlung stellt eine Gesundheitsgefährdung am Arbeitsplatz dar. Hier zeigen wir die Exposition von Primärstammzellen von der Maus-Augenoberfläche gegenüber UV-C-Strahlung. Die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ist die Auslesung des Ausmaßes von oxidativem Stress/Schäden. In einer experimentellen In-vitro-Einstellung ist es auch wichtig, den Prozentsatz der toten Zellen zu bewerten, die durch oxidativen Stress erzeugt werden. In diesem Artikel zeigen wir die 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate (DCFDA) Färbung von UV-C-exponierten primären Augenoberflächenstammzellen der Maus und deren Quantifizierung auf der Grundlage der fluoreszierenden Bilder der DCFDA-Färbung. DCFDA Färbung entspricht direkt der ROS-Generation. Wir zeigen auch die Quantifizierung von toten und lebenden Zellen durch gleichzeitige Färbung mit Propidiumiodid (PI) bzw. Hoechst 3332 bzw. dem Prozentsatz der DCFDA (ROS-positiven) und PI-positiven Zellen.

Einleitung

Die Augenoberfläche (OS) ist eine funktionelle Einheit, die hauptsächlich aus der äußeren Schicht und drüsensen Epithelie von Hornhaut, lachrymaler Drüse, meibomianischer Drüse, Bindehaut, einem Teil der Augenlidränder und Innervationen besteht, die Signale¹transduce. Die transparente kuppelförmige Hornhautschicht lenkt das Licht auf die Netzhaut. Dieses avaskuläre Gewebe besteht aus zellulären Komponenten wie Epithelzellen, Keratozyten und Endothelzellen und azellulären Komponenten wie Kollagen und Glycosaminoglycans². Das Gebiet wird von Tränen entwässert, die auch die meisten Nährstoffe liefern. Die anatomische Position des Betriebssystems zwingt es zu einem direkten Kontakt mit der äußeren Umgebung und setzt es oft verschiedenen harten Komponenten wie hellem Licht, Mikroben, Staubpartikeln und Chemikalien aus. Dieser Faktor prädisponiert das Betriebssystem für körperliche Verletzungen und macht es anfällig für verschiedene Krankheiten.

Oxidativer Stress wird durch das Ungleichgewicht zwischen der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und den endogenen antioxidativen Abwehrmechanismen³verursacht. ROS werden in reaktive Moleküle und freie Radikale eingeteilt, die beide aus molekularem Sauerstoff_(O2) durch mitochondriale oxidative Phosphorylierung⁴abgeleitet werden. Die erste Gruppe besteht aus nicht-radikalen Arten wie Wasserstoffperoxid (H_2O2), Singlet-Sauerstoff (¹_O2) und letztere umfasst Arten wie Superoxid-Anionen_(O2^-) und Hydroxylradikale (^•OH), unter anderem. Diese Moleküle sind Nebenprodukte normaler zellulärer Prozesse und ihre Rolle wurden in wichtige physiologische Funktionen wie Signaltransduktion, Genexpression und Wirtsabwehr⁵involviert. Eine verbesserte Produktion von ROS ist bekannt, als Reaktion auf Faktoren wie Pathogeninvasion erzeugt werden, Xenobiotika, und Exposition gegenüber ultravioletten (UV) Strahlung⁴. Diese Überproduktion von ROS führt zu oxidativem Stress, der zur Schädigung von Molekülen wie Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden führt⁶.

Natürliches Sonnenlicht, die vorherrschende Quelle von UV-Strahlung, besteht aus UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) und UV-C (290–200 nm)⁷. Es wurde eine inverse Korrelation zwischen der Wellenlänge und den Spektralenergien berichtet. Obwohl natürliche UV-C-Strahlung von der Atmosphäre absorbiert wird, emittieren künstliche Quellen wie Quecksilberlampen und Schweißgeräte und stellen daher eine berufliche Gefahr dar. Symptome der Exposition gegenüber Augen sind Photokeratitis und Photokeratokonjunktivitis⁸. Die Produktion von ROS ist einer der wichtigsten Mechanismen, um UV-induzierten Zellschaden^{zuzufügen 9}. In der aktuellen Studie zeigen wir den Nachweis von ROS mit der 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein-Diacetat (DCFDA)-Färbungsmethode in primären Augenoberflächenzellen/Stammzellen der Maus, die UV-C ausgesetzt sind. Die grüne Fluoreszenz wurde mittels fluoreszierender Mikroskopie erfasst. Die Zellen wurden mit zwei Farbstoffen, Hoechst 33342 und rotem Propidiumjodid, gegengefärbt, um die lebenden bzw. abgestorbenen Zellen zu färben.

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Protokoll

Das Experiment wurde an primären Augenzellen/Stammzellen durchgeführt, die vom Schweizer Albino-Mausauge abgeleitet wurden. Die Verwendung von Tieren zur Augenernte für dieses Experiment wurde vom Institutional Animal Ethical Committee, Yenepoya (Considered to be University) genehmigt (IEAC-Zulassungsnummer, 6a/19.10.2016).

1. Zubereitungen von Reagenzien

HINWEIS: Die Ableitung von Primärzellen/Stammzellen von der Augenoberfläche der Maus geht über den Rahmen dieses Protokolls hinaus. Daher zeigen wir die UV-C-Expositionsdosen, reagenzvorbereitung zur Beurteilung von ROS, lebende und abgestorbene Zellen und deren Quantifizierung. Bitte beachten Sie Tabelle 1 für die jeweiligen Vogen der Reagenzien (10% fetales Rinderserum, DCFDA, Hoechst und Propidiumiodid-Lagerlösungen, die zur Erzielung der endgültigen Färbelösung hinzugefügt werden).

1. Bereiten Sie eine Lagerlösung von 10 mM DCFDA vor, indem Sie 25 mg DCFDA-Pulver in 5,13 ml DMSO auflösen. Aliquot 250 l in bernsteinfarbenen 1,5 ml-Röhren und bei -20 °C lagern.
2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mg/ml (16,23 mM Lösung) Hoechst 33342 vor, indem Sie den gesamten Inhalt der 25 mg Durchstechflasche in 2,5 ml entionisiertem Wasser auflösen. In bernsteinfarbenen Mikrozentrifugenröhrchen Aliquots von 100 l in bernsteinfarbenen Mikrozentrifugenrohren herstellen und bis zu 6 Monate bei 2-6 °C lagern. Für längerfristige Lagerung bei -20 °C lagern.
3. Bereiten Sie eine Lagerlösung von 1 mg/ml Propidiumjodid in entionisiertem Wasser, aliquot 1 ml jeweils in bernsteinfarbenen 1,5 ml-Röhren, und lagern Sie bei 4 °C.

2. Zellbeschichtung und UV-C-Strahlungsbehandlung

1. Dissoziieren Sie vor der Beschichtung die in unserem Labor isolierten primären Augenoberflächenzellen der Maus (unveröffentlichte Ergebnisse; solche Zellen sind eine Mischung aus Hornhautepithel, Stromalzellen und Keratozyten) mit einem sanften Zelldissoziationsmittel (Tabelle der Materialien).
2. Platte 0,2 x 10⁶ Maus primäre Okuläroberflächenzellen in 35 mm 0,2% Kellermembranmatrix-beschichteten Zellkulturschalen in 2,5 ml Komplettmedien. Über Nacht bei 37 °C in einem 5%_CO2 und befeuchteten Inkubator inkubieren.
   HINWEIS: Das komplette Medium für die Kultivierung von Primärzellen von der Augenoberfläche der Maus besteht aus DMEM-hochglukosehaltigem Gehalt von 20% FBS, 1% Pen-Strep, 1% Glutamax, 1% nicht-essentieller Aminosäure (NEAA), 1% Natriumpyruvat und 0,1%
3. Bevor Sie die Zellen verschiedenen Dosen von UV-C aussetzen, verwerfen Sie das maximale Medienvolumen und lassen Sie nur eine dünne Medienschicht (ca. 500 L) in Kontakt mit den Zellen bleiben, gerade genug, um sie abzudecken.
4. Nehmen Sie die Gerichte, nacheinander zur UV-C-Quelle/Kammer (die untere Kammer eines Hybridisierungsofens/UV-Kreuzverlinker; Materialtabelle). Legen Sie die Schale in die Kammer und entfernen Sie den Deckel der Schale. Die offene Deckelposition der Schale sorgt dafür, dass die Zellen während der UV-C-Exposition die maximale UV-C-Dosis erhalten.
5. Setzen Sie die Zellen verschiedenen Graden/Dosen von UV-C aus: 1 J/m², 100J/m², 1.000 J/m² und 10.000 J/m².
6. Nach der UV-C-Belichtung den Deckel jedes Geschirrs sofort austauschen und aus der UV-C-Quellkammer entfernen.
7. Bringen Sie jedes der Gerichte auf die laminare Luftstromhaube und füllen Sie jedes der Gerichte mit 2 ml frischen Komplettmedien auf.
8. Inkubieren Sie die Zellen für 3 h in einem 37 °C CO2-Inkubator. Drei Stunden Inkubation nach UV-C-Exposition sind optimal, um die frühen Effekte zu visualisieren und zu quantifizieren.

3. Vorbereitung von Live-Zell-Färbemedien

1. Bereiten Sie die Färbemittel während der letzten 15 min der 3 h Zellinkubation nach UV-C-Exposition frisch vor.
2. Vorwarm 10 ml der Färbemedien mit 10% FBS-DMEM ergänzt durch 1% Pen-Strep bis 37 °C.
3. Fügen Sie 5 l von 10 mM DCFDA hinzu; 5 l von 10 mg/ml Hoechst-Lösung und 200 l mit 1 mg/ml Propidiumjodid. Die Endkonzentrationen von DCFDA, Hoechst und PI liegen in den 10 ml DerFärdenmedien bei 5 m, 5 g/ml bzw. 20 g/ml.

4. DCFDA Färbung von UV-C exponierten Maus primären Augenzellen

1. Nach 3 h Inkubation von UV-C exponierten Maus primärer Augenzellen in verschiedenen Dosen, aspirieren Sie die Medien aus den 35 mm Geschirr.
2. Mit 2 ml frisch zubereiteten DCFDA-Färbemedien an jedes der Gerichte von den Seiten sanft auffüllen.
3. Inkubieren Sie die Zellen mit den Färbemedien 15 min im Dunkeln in einem 37 °C CO2-Inkubator zur Färbung von Lebendenzellen.

5. Betrachtung von DCFDA (ROS), Hoechst und PI gebeizten Zellen

1. Nach Abschluss der Inkubation die Färbemedien entsorgen.
2. Fügen Sie den Zellen frische serfüllende Medien hinzu und beobachten Sie die Zellen unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop/Zellbilder (Tabelle der Materialien). Fotografieren Sie die gewünschten Felder: Hellfeld, blaue Fluoreszenz, rote Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz.
   HINWEIS: Die blauen fluoreszierend gefärbten Zellen sind die Kerne, die grüne Fluoreszenz ist für ROS-erzeugungende Zellen und die rote Fluoreszenz zeigt die PI-positiven abgestorbenen Zellen an.

6. Quantifizierung von gebeizten Zellen (Hoechst-Blue, PI-Dead und Green-ROS) mit bildgebenden Verfahren

1. Exportieren Sie die unter dem invertierten Fluoreszenzmikroskop/Zellbilder aufgenommenen Bilder zur Quantifizierung nach ImageJ.
2. Öffnen Sie jedes der Bilder nacheinander, indem Sie jeden Kanal (d. h. blau (Nuclei/Hoechst), grün (ROS), rot (Dead/PI positiv)) sequenziell zum Zählen verwenden. Beginnen Sie mit dem nicht belichteten Steuerelement und bewegen Sie sich sequenziell zu 1, 100, 1.000 und 10.000 J/m^-2.
3. Zählen Sie die Zellen mit dem Zellenzählwerkzeug, das als Kreuz im Softwaremenü markiert ist, für jedes der Felder [blau positiv (Hoechst positiv; Kerne), rot positiv (PI-positiv; tote Zellen); grün positiv (ROS)] in jedem der Bilder, die jedem der Behandlungen.
4. Zählen Sie, indem Sie auf jedes der spezifischen Signale in jedem der Felder klicken. Wenn Sie beispielsweise auf die blau/Hoechst-Gebeikerne klicken, wird die Gesamtzahl der Kerne in einem bestimmten Feld angezeigt.
5. Berechnen Sie die Ergebnisse als Prozentsatz des Zelltodes durch UV-Schäden (Anzahl der PI-positiven Zellen x 100 geteilt durch die Anzahl der Hoechst-positiven Zellen) und den Prozentsatz der ROS-Produktion durch UV-Schäden (Anzahl der DCFDA-positiven Zellen x 100 geteilt durch die Anzahl der Hoechst-positiven Zellen).

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Ergebnisse

DCFDA ist ein farbloser Farbstoff, der eine chemisch reduzierte Form von Fluorescein ist, die als Indikator für den Nachweis von ROS in Zellen verwendet wird. Dieser Farbstoff wird in Zellen eingeschlossen und leicht zu fluoreszierendem Dichlordihydrofluorescein (DCF) oxidiert, das eine grüne Fluoreszenz aussendet. Diese Fluoreszenz kann mit fluoreszierender Mikroskopie nachgewiesen werden. Die Zellen können visualisiert und mit der ROS-Akkumulation wie folgt korreliert werden: (i) lebende Zellen ohne ROS emittieren h...

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Diskussion

Die hier beschriebene DCFDA-Färbemethode ermöglicht die Visualisierung von ROS in primären augenförmigen, mit UV-C-Strahlung behandelten primären okulären Lebendenzellen der Maus. Ein Vorteil dieser Färbemethode ist, dass sie es den Forschern auch ermöglicht, die unmittelbaren Auswirkungen von UV-C (3 Stunden nach UVC-Exposition) auf die lebenden Zellen und deren gleichzeitige Aufzählung für den Prozentsatz von ROS-positiven sowie abgestorbenen Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus können die Zellen, da die F...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad