Generierung einer Leber orthotopischen Human Enuveal Melanom Xenograft Plattform bei immundefizienten Mäusen

Zusammenfassung

Orthotopische humane Leber metastasierenuvealmelanom xenograft MausModelle wurden mit chirurgischen orthotopischen Implantationstechniken mit Patienten-abgeleiteten Tumorstück und Nadelinjektionstechniken mit kultivierten menschlichen uvealen Melanom-Zelllinien erstellt.

Zusammenfassung

In den letzten Jahrzehnten wurden subkutan implantierte, von Patienten abgeleitete Xenograft-Tumoren oder kultivierte menschliche Zelllinien zunehmend als repräsentativere Modelle zur Untersuchung von menschlichen Krebserkrankungen bei immundefizienten Mäusen anerkannt als herkömmliche etablierte menschliche Zellen. Linien in vitro. Kürzlich wurden orthotopisch implantierte Patienten-Xenograft-Modelle (PDX) bei Mäusen entwickelt, um Merkmale von Patiententumoren besser zu replizieren. Ein orthotopisches Xenograft-Mausmodell der Leber soll eine nützliche Krebsforschungsplattform sein, die Einblicke in die Tumorbiologie und die medikamentöse Therapie bietet. Jedoch, Leber orthotopische Tumorimplantation ist in der Regel kompliziert. Hier beschreiben wir unsere Protokolle für die orthotopische Implantation von lebermetastasierten uvealen Melanomtumoren. Wir kultivierten humane Leber metastasieren uveal Melanom Zelllinien in immundefizienten Mäusen. Die Protokolle können zu gleichbleibend hohen technischen Erfolgsraten führen, indem entweder eine chirurgische orthotopische Implantationstechnik mit Stücken von patientenabgeleitetem uvealem Melanomtumor oder eine Nadelinjektionstechnik mit kultivierter menschlicher Zelllinie verwendet wird. Wir beschreiben auch Protokolle für CT-Scans zum Nachweis von inneren Lebertumoren und für Reimplantationstechniken mit kryokonservierten Tumoren, um eine Re-Engraftmentment zu erreichen. Zusammen bieten diese Protokolle eine bessere Plattform für leberorthotopische Tumormausmodelle des lebermetastasieren uvealen Melanoms in der translationalen Forschung.

Einleitung

Uvealmelanom ist der häufigste intraokulare maligne Tumor bei Erwachsenen in der westlichen Welt. In den letzten 50 Jahren ist die Inzidenz von uvealem Melanom (5,1 Fälle pro Million) in den Vereinigten Staaten stabil geblieben^1,2. Uvealmelanom entsteht durch Melanozyten in der Iris, ziliarkörper, oder Aderhaut, und es ist eine extrem tödliche Krankheit, wenn es Metastasen entwickelt. Die Sterblichkeitsrate von Patienten mit uvealer Melanommetastasierung betrug 80% bei 1 Jahr und 92% bei 2 Jahren nach der Erstdiagnose der Metastasen. Die Zeit zwischen der Diagnose von Metastasen und dem Tod ist in der Regel kurz, weniger als 6 Monate, ohne Bezug auf Therapie^3,4. Der Krebs breitet sich durch das Blut aus und neigt dazu, dominant metastasieren in die Leber (89-93%)^4,5. Für die weitere Untersuchung des lebermetastasierenden uvealen Melanoms wird dringend ein effektives Mausmodell benötigt. Für die translationale Forschung besteht die klare Forderung, ein leberlokalisiertes metastasierendes uveales Melanom-Mausmodell zu generieren.

Patienten-abgeleitete Tumor-Xenograft-Mausmodelle (PDX) sollen individuelle Medizinstrategien liefern. Diese Modelle könnten prädiktiv für klinische Ergebnisse sein, nützlich für die präklinische Arzneimittelbewertung sein und für biologische Studien von^Tumoren6 verwendet werden. Repräsentative PDX-Modelle sind ektopisch tumorimplantierte Xenograft-Mäuse, die Tumor an subkutanen Stellen haben. Die meisten Forscher können Chirurgie für subkutane Implantation ohne spezielle Praxis^7,8. Sie können auch subkutane Tumoren leicht überwachen. Obwohl subkutane PDX-Modelle in der Forschungsphase populär wurden, haben sie einige Hürden beim Übergang in die Praxis. Subkutane Implantation zwingt patientenabgeleitete Tumoren, sich in einer anderen Mikroumgebung als dem Tumorursprung zu engrafieren, so dass sie zu Engraftmentversagen und langsamem ^{Tumorwachstum}9^{,10,11, 12,13,14}. Orthotopische Engraftment kann ein idealer und rationaler Ansatz für ein PDX-Modell sein, weil es das gleiche Organ wie der ursprüngliche Tumor^15,16verwendet.

Kürzlich haben wir Protokolle für chirurgische orthotopische Implantationstechniken von lebermetastasierten uvealen Melanomtumoren und Nadelinjektionstechniken mit einer kultivierten menschlichen lebermetastasieren uvealen Melanom-Zelllinie in NOD entwickelt. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse^17,18. Die Protokolle führen zu konstant hohen technischen Erfolgsraten. Wir haben auch CT-Scanning-Techniken etabliert, die nützlich sind, um innere Lebertumoren zu erkennen, und wir haben eine Reimplantation von kryokonservierten Tumoren in der PDX-Plattform entwickelt. Wir fanden heraus, dass uveale Melanom-Tumor-Xenograft-Modelle die Eigenschaften des ursprünglichen Lebertumors des Patienten beibehalten, einschließlich ihrer histopathologischen und molekularen Eigenschaften. Zusammen bieten diese Techniken eine bessere Plattform für orthotopische Tumormodelle der Leber für uveales Melanom in der translationalen Forschung.

Protokoll

Patienten, die an der Studie teilnehmen, sollten eine schriftliche Zustimmung erteilen, die die Verwendung von ausrangierten chirurgischen Proben für Forschungszwecke und genetische Studien ermöglicht, gemäß einem vom Institutional Review Board genehmigten Protokoll. Dieses Protokoll wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt und vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC) genehmigt.

1. Sammlung von frischem, vom Patienten abgeleitetem Tumorgewebe

1. Erhalten Sie patientenabgeleitetes Tumorgewebe aus einer Operation oder eine Nadelbiopsie in einem Operationssaal des Krankenhauses.
2. Das Tumorgewebe in einen 100 ml-Behälter mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Lösung auf Eis legen.
3. Übertragen Sie das Gewebe in eine sterile Kapuze (Biosicherheitsstufe 2) in einem Labor.
4. Fahren Sie so schnell wie möglich mit Schritt 2 fort.
   HINWEIS: Aus Sicherheitsgründen patienten mit bekannten HIV- oder Hepatitis-B- oder C-Infektionen ausschließen.

2. Verarbeitung von frischem, vom Patienten abgeleitetem Tumorgewebe

1. Legen Sie das Gewebe in ein 50 ml-Rohr mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) auf Eis. Zum Waschen des Gewebes PBS in das Rohr geben und PBS zweimal aus dem Rohr entsorgen.
2. Übertragen Sie das Gewebe in eine Petrischale mit PBS auf Eis.
3. Entfernen Sie mit sterilen Zangen und Scheren die nekrotischen Teile des Gewebes. Halten Sie das Gewebe feucht und kalt während der Schritte 2.3 bis 2.5. Überspringen Sie bei Nadelbiopsieproben Schritt 2.3 und 2.5, und schneiden Sie die Proben nicht.
   HINWEIS: Das nekrotische Gewebe bricht oft leicht auseinander, wenn es berührt wird.
4. Schneiden Sie das Gewebe in 1 mm³ Würfel für die chirurgische Leberimplantation.
5. Den Rest des Gewebes in 2 mm Würfel in der Petrischale schneiden.
6. Übertragen Sie sie in ein 1,7 mm Mikrorohr mit 4% Formalin für die histologische Analyse und in ein anderes Rohr für die genomische und proteomische Analyse.
7. Legen Sie die Mikroröhren in ein flüssiges Stickstoffglas mit flüssigem Stickstoff. Die Rohre zur dauerhaften Lagerung in einen -80 °C-Gefrierschrank überführen.
   HINWEIS: Die Zeit zwischen der Entnahme der Probe vom Patienten und der Gewebeverarbeitung sollte 30 min nicht überschreiten.

3. Chirurgische Leberimplantation mit patientenabgeleitetem Tumorgewebe

1. Sprühen Sie alle Gegenstände, die zur Operation in die Motorhaube kommen, mit 70 % Ethylalkohol.
   HINWEIS: Dazu gehören chirurgische Instrumente, Heizkissen und Anästhesiemaschinen.
2. Messen Sie das Gewicht eines Wattestäbchens und eines Stoffblechs.
3. Anästhetisieren Sie eine Maus mit einem 3-5% Isofluran-Verdampfer, indem Sie sie in die Induktionskammer legen.
4. Sobald die Maus vollständig beästhetisiert ist, legen Sie sie in Supine-Position auf einem Heizkissen. Legen Sie den Isofluran-Kegel auf die Schnis der Maus, um 1,5–3% Isofluran zur Aufrechterhaltung der Anästhesie einzuatmen.
   HINWEIS: Die Maus muss während des gesamten Vorgangs auf dem Heizkissen sein. Mangelnde Heizung kann Zukühlung verursachen.
5. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie ohne Reaktion, wenn der Fuß der Maus mit ultrafeinen Zangen gestochen wird.
6. Buprenorphin (0,6 mg/kg) subkutan an der Flanke mit einer 27 G Nadel auf einer Mikrospritze vor der Operation injizieren.
7. 70% Ethylalkohol auf den Bauch auftragen und das Fell nach oben und unten verteilen. Nach dem Ausbreiten des Fells, bestätigen Sie eine einfachere Visualisierung der Haut unter dem linken subcostalBereich für einen einfacheren Schnitt. Rasieren Sie das Fell nicht aus dem Bauch.
   HINWEIS: Das Fell wird die Einschnittstelle nach der Operation verstecken und verhindern, dass die Maus die Schnittoperation kratzt. Jedoch, Sie können das Fell rasieren, um eine Infektion der Einschnittstelle nach institutionellen Standards zu verhindern.
8. Jod auftragen und in die Haut aufnehmen lassen.
9. Legen Sie einen sterilen chirurgischen Vorhang mit einem 2 cm Loch auf die Maus.
10. Heben Sie die Bauchhaut mit gebogenen ultrafeinen Zangen an und machen Sie einen 1 cm quer linken subcostalen Hautschnitt mit gebogener Schere.
11. Legen Sie die Spitze der gekrümmten Schere unter die Haut des Einschnitts und öffnen Sie sie leicht, um Peritoneum von der Haut zu trennen. Ziehen Sie die Schere mit geschlossenen Klingen vom Schnitt ab.
    HINWEIS: Das Öffnen und Schließen der Schere in der Maus kann zu Beschädigungen und Blutungen führen.
12. Finden Sie die Leber unter dem Peritoneum. Bestätigen Sie eine dunkle rötliche Farbe durch das Peritoneum.
13. Mit gebogener Schere, machen Sie einen 1 cm Querschnitt im Peritoneum. Wenn eine Peritonealarterie von der Schneide blutet, stoppen Sie die Blutung sofort mit Kauterie.
14. Schnappen Sie sich Fettgewebe mit gebogenen ultrafeinen Zangen mit einer Hand, legen Sie den Rand eines Wattestäbchens unter den linken Leberlappen und rollen Sie den Tupfer mit der anderen Hand nach unten, um die Leber herauszuholen.
    HINWEIS: Das Greifen von Fettgewebe ist wichtig, um zu verhindern, dass das Fettgewebe am Wattestäbchen klebt.
15. Exteriorisieren Sie die Leber auf dem Wattestäbchen und legen Sie die Leber auf ein Vlies absorbierende Stoffblech.
    HINWEIS: Das Stoffblech spielt zwei wesentliche Rollen bei der Stabilisierung der Leber und der Aufnahme von Blutungen.
16. Machen Sie einen Schnitt 5 mm in der Breite und Tiefe mit einem sterilen Nr. 11 Skalpellklinge, um eine Tasche im Parenchym zu bilden, während sie die Einschnittstelle mit dem Wattestäbchen sanft drücken.
    1. Legen Sie die Klinge parallel zur Leberoberfläche ein und schneiden Sie sie horizontal.
    2. Drücken Sie die Einschnittstelle mit dem Wattestäbchen, um Blutungen zu stoppen.
       HINWEIS: Halten Sie die Klinge nicht vertikal, sonst brechen Sie die Leber und verletzen große Gefäße in der Mitte der Leber.
17. Rollen Sie den Wattestäbchen nach oben, um die Einschnittstelle zu öffnen und einen 1 mm³ Würfel Tumorgewebe in die Tasche mit gebogenen ultrafeinen Zangen zu implantieren. Ziehen Sie die Zange zurück, während Sie den Wattestäbchen in umgekehrter Drehung rollen und nach unten drücken.
    HINWEIS: Das Drücken der Einschnittstelle mit dem Wattestäbchen beim Einziehen der Zange hilft, eine Verschiebung des Tumors in der Tasche zu verhindern.
18. Nehmen Sie den Wattestäbchen nach der Implantation vorsichtig von der Einschnittstelle. Fahren Sie so schnell wie möglich mit Schritt 3.19 fort.
19. Legen Sie ein resorbierbares Hämostat auf die Einschnittstelle.
20. Bestätigen Sie hämostasis. Wenn die Blutung anhält, fügen Sie mehr Hämostat auf der Einschnittstelle hinzu.
21. Die Leber mit Zangen (vorzugsweise stumpf endlos) vom Stoffblech abziehen und die Leber wieder in die Bauchhöhle geben.
22. Nahtperitoneum mit doppelter Ligatur mit 5-0 resorbierbarer Naht.
23. Nahthaut mit dreifacher Ligatur mit 5-0 resorbierbarer Naht.
    HINWEIS: Dreifachligatur hilft, chirurgische Inzisiondehiszenz zu verhindern.
24. Beobachten Sie die Maus, bis sie vollständig wach ist, und legen Sie sie wieder in den Käfig.
25. Messen Sie das Gewicht des Wattestäbchens und des Stoffblechs mit Blut für das Blutvolumen während der Operation. Vergleichen Sie sie mit ihren ursprünglichen Gewichten vor der Operation. Reduzieren Sie Blutungen während der Operation auf weniger als 10% des zirkulierenden Blutvolumens in der Maus.

4. Sammeln und Verarbeiten der kultivierten menschlichen Leber metastasierenuveales Melanom Zelllinie

1. Bereiten Sie kultivierte Zellen vor.
2. Sammeln Sie Zellen, und berechnen Sie die Zellennummer mithilfe eines Zellenzählers.
3. Bereiten Sie eine angemessene Menge an Zellsuspension für 10,0 x 10⁶ Zellen in einem 15 ml Rohr vor.
4. Drehen Sie das Rohr bei 300 x g für 5 min in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur.
5. Entfernen Sie den Überstand im 15 ml Rohr. Lassen Sie das Zellpellet an der Unterseite des Rohres.
6. Fügen Sie 50 l RPMI 1640 medium in ein 1,7 ml Rohr.
7. Schneiden Sie die Spitze einer 200-L-Spitze mit einer Schere, um die Spitzenöffnung zu vergrößern.
8. Fügen Sie die Kellermembranmatrix mit einer Pipette mit der geschnittenen Spitze in das 1,7 ml-Rohr mit RPMI-Rohr ein.
9. Mischen Sie RPMI und Matrix in der 1,7 ml-Röhre. Wirbel es.
10. Fügen Sie 110 l des Gemischs in das Zellpellet in das 15 ml-Rohr. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 1,7 ml Rohr.
11. Halten Sie die Röhre vor der Nadelinjektion auf Eis.

5. Chirurgische Nadel implantation von kultivierten menschlichen Leber metastasierenuveal enuvamelanom Cell Line in Leber

1. Folgen Sie dem obigen Protokoll von den Schritten 3.1 bis 3.15.
2. Sammeln Sie die Zellsuspension mit einer Mikrospritze mit einer 27 G Nadel.
3. Setzen Sie die Nadel entlang der Oberfläche der Leber und fördern Sie die Spitze der Nadel 5 mm tiefer.
4. Injizieren Sie 20 l Zellsuspension in die Leber.
5. Kauterisieren Sie die Einfügemarke der Leber, um zu verhindern, dass die injizierten Zellen auslaufen. Bestätigen Sie hämostasis.
6. Folgen Sie dem obigen Protokoll von den Schritten 3.21 bis 3.24.

6. CT-Scan

1. Platzieren Sie die Maus in einen Restrainer im Wachzustand.
2. Wischen Sie den Schwanz mit einem sterilen Alkoholpad zur Desinfektion und Vasodilatation ab.
3. Injizieren Sie 100 l CT-Kontrastmittel durch die Schwanzvene mit einer 27 G Nadel auf eine 1 ml Spritze.
4. Warten Sie 4 h nach der Injektion, bevor Sie den CT-Scan einnehmen.
   HINWEIS: Es dauert 4 h, bis das Mittel von Leber-Kupffer-Zellen aufgenommen wird.
5. Vier Stunden nach der Injektion die tumortragende Maus mit 3–5% verdampftem Isofluran ansiebe, indem sie sie in die Induktionskammer legt.
6. Sobald die Maus vollständig anästhesiert ist, legen Sie sie in die anfällige Position auf einem CT. Legen Sie den Isoflurankegel auf die Schnis der Maus, um 1,5–3% Isofluran zur Aufrechterhaltung der Anästhesie einzuatmen.
7. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie ohne Reaktion, wenn der Fuß der Maus mit ultrafeinen Zangen gestochen wird.
8. Nehmen Sie einen CT-Scan für 15 min.
9. Stellen Sie sicher, dass die Maus, bis sie nach dem CT-Scan vollständig geweckt ist, und legen Sie sie wieder in den Käfig.
10. Bewerten Sie die Existenz eines Tumors und messen Sie die Tumorgröße auf den CT-Bildern.
    HINWEIS: Das Kontrastmittel verbessert normales Leberparenchym, so dass es leicht ist, unenhanced Tumor zu erkennen. Interpretieren Sie die Gallenblase und den Magen nicht als Tumor.

7. Ernte und Verarbeitung von Gewebe

1. Euthanisieren Sie Mäuse mit CO_2, gefolgt von zervikalen Dislokationen, indem Sie den Zeigefinger und Daumen hinter den Schädel legen und den Körper an der Basis des Schwanzes ziehen. Fahren Sie so schnell wie möglich mit Schritt 7.2 fort.
2. Die Maus in eine Supine-Position geben und den Bauch mit 70% Ethylalkohol besprühen.
3. Verwenden Sie sterile Zangen und sterile Schere, um einen 3-cm-Querschnitt unterhalb des xiphoiden Prozesses zu machen, um die Bauchorgane freizulegen.
4. Verbrauchen Sie das Tumorgewebe und führen Sie die Schritte 2.1 bis 2.2 aus.
5. Den Rest des Tumors in 2 mm Würfel in der Petrischale schneiden.
6. Übertragen Sie sie in eine kryogene Röhre mit Kryomedium zur Reimplantation nach Kryokonservierung.
7. Legen Sie die Rohre in einen kryogenen Gefrierbehälter gefüllt mit Isopropanol.
8. Den Behälter zur Zwischenlagerung in einen -80 °C-Gefrierschrank geben. Die Kryoröhren mit Kryomedium nicht direkt in einen flüssigen Stickstofftank geben. Einfrieren Sie sie langsam mit einer Abkühlrate von -1 °C/min, um Tumorgewebe zu erhalten.
9. Am nächsten Tag die Rohre zur dauerhaften Lagerung in einen flüssigen Stickstofftank überführen.

8. Reimplantation

1. Halten Sie Rohre in einem flüssigen Stickstoffglas mit flüssigem Stickstoff eingefroren, bis sie bereit sind, Gewebe zu implantieren. Minimieren Sie die Exposition des Gewebes gegenüber Raumtemperatur, um die Lebensfähigkeit zu erhalten und die Einpfropfchancen zu erhöhen.
2. Kryopreservede Röhre in einem 37 °C Wasserbad auftauen.
3. Führen Sie die Schritte 2.2–2.4 aus.
4. Implantieren Sie den aufgetauten Tumor in Mäuse, wie in den Schritten 3.1–3.24 beschrieben.

Ergebnisse

Chirurgische orthotopische Implantation mit der Lebertaschenmethode kann menschlichen Lebermetastasen-Melanom-Tumor mit einer hohen Erfolgsrate von 80% innerhalb von sechs Monaten in die Mausleber transplantieren. Der Xenograft-Tumor engraft in die Leber als einsamer Tumor ohne Tochterknötchen (Abbildung 1 und Abbildung 3A). Die chirurgische orthotopische Injektionstechnik in die Leber mit Mikronadeln, die erfolgreich kultiviert...

Diskussion

Die aktuellen orthotopischen Xenograft-Modelle sind arbeitsintensiv, zeitaufwändig und teuer zu erstellen. Orthotopische Tumor Xenograft Maus Modelle für Leberkrebs wurden vor mehr als zwei Jahrzehnten etabliert^19,20,21. Diese Technik ist jedoch kompliziert und erfordert die Verwendung von speziellen Geräten, wie z. B. einem Mikronadelhalter und 6-0 bis 8-0. feine Nähte unter dem Mikroskop. Tumor und normales Lebergewebe mü...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent)	Miltenyl Biotec	130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium	Corning	21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver			All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane	Purdue Products	67618-150-17
Isopropanol	Fisher scientific	A416-1	Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC	BD	354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Jackson Lab	5557	4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium	Corning	21-031-CM
RPMI 1640	Corning	10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Nice-Pak products	B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution	Wako	163-20145
70% Ethyl alcohol solution	Fisher Scientific	04-355-122
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Absorbable hemostat	Johnson and Johnson	63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery	Bovie Medical	MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container	NALGENE	5100-0001
Cryotube	SARSTEDT	72.379
Curved scissors	World Precision Instruments	503247
Curved ultrafine forceps	World Precision Instruments	501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister	Harvard Apparatus	600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer	Artisan Scientific	66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar	Thermo Fisher Scientific	2123
Micro-CT scan	Siemens
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood			Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel	AD Surgical	A300-11-0
Straight forceps	World Precision Instruments	14226
Surgical drape
Tail vein restrainer	Braintree Scientific	TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle	BD	309623
1.7 mL tube	Bioexpress	C-3260-1
5-0 PDO Suture	AD Surgical	S-D518R13
15 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9152N
27 G needle	BD	780301
27 G needle	Hamilton	7803-01
50 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9502N
50 µL micro syringe	BD	80630
50 µL micro syringe	Hamilton	7655-01
100 mL container	Fisher Scientific	12594997
200μL tip