Murine Modell der kontrollierten kortikalen Auswirkungen für die Induktion von traumatischen Hirnverletzungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von murinen traumatischen Hirnverletzungen über einen offenkopfgesteuerten kortikalen Aufprall.

Zusammenfassung

Die Centers for Disease Control and Injury Prevention schätzen, dass in den Vereinigten Staaten jedes Jahr fast 2 Millionen Menschen eine traumatische Hirnverletzung (TBI) erleiden. Tatsächlich trägt TBI zu mehr als einem Drittel der verletzungsbedingten Sterblichkeit bei. Nichtsdestotrotz sind die zellulären und molekularen Mechanismen, die der Pathophysiologie von TBI zugrunde liegen, schlecht verstanden. Daher sind präklinische Modelle von TBI, die in der Lage sind, die für TBI relevanten Verletzungsmechanismen bei menschlichen Patienten zu replizieren, ein dringender Forschungsbedarf. Das Modell der kontrollierten kortikalen Schlagwirkung (CCI) von TBI nutzt ein mechanisches Gerät, um den exponierten Kortex direkt zu beeinflussen. Während kein Modell die unterschiedlichen Verletzungsmuster und die Heterogenität von TBI bei menschlichen Patienten vollständig rekapitulieren kann, ist CCI in der Lage, eine breite Palette klinisch anwendbarer TBI zu induzieren. Darüber hinaus ist die CCI leicht standardisiert, sodass die Forscher die Ergebnisse über Experimente hinweg und über Ermittlungsgruppen hinweg vergleichen können. Das folgende Protokoll ist eine detaillierte Beschreibung der Anwendung einer schweren CCI mit einem kommerziell erhältlichen Aufprallgerät in einem murinen Modell von TBI.

Einleitung

Die Centers for Disease Control and Injury Prevention schätzen, dass etwa 2 Millionen Amerikaner jedes Jahr eine traumatische Hirnverletzung (TBI) erleiden^1,2. Tatsächlich trägt TBI zu über 30 % aller verletzungsbedingten Todesfälle in den Vereinigten Staaten bei, wobei die Gesundheitskosten sich auf fast 80 Milliarden DOLLAR jährlich und fast 4 Millionen Dollar pro Person und Jahr belaufen und ein schweres TBI^3,4,5überleben. Die Auswirkungen von TBI werden durch die signifikanten langfristigen neurokognitiven und neuropsychiatrischen Komplikationen hervorgehoben, die seine Überlebenden mit dem heimtückischen Beginn von Verhaltens-, kognitiven und motorischen Beeinträchtigungen erlitten haben, die als chronische traumatische Enzephalopathie (CTE) bezeichnet werden. ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10}. Selbst subklinische Gehirnerschütterungen – die Auswirkungen, die nicht zu klinischen Symptomen führen – können zu einer langfristigen neurologischen Dysfunktion führen^11,12.

Tiermodelle für die Studie von TBI werden seit den späten 1800er^{Jahren 13}verwendet. In den 1980er Jahren wurde ein pneumatischer Schlagkraft zum Zweck der Modellierung von TBI entwickelt. Diese Methode wird jetzt als kontrollierte kortikale Auswirkung (KI)¹⁴bezeichnet. Die Kontrolle und Reproduzierbarkeit der CCI veranlasste die Forscher, das Modell für den Einsatz bei Nagetieren anzupassen¹⁵. Unser Labor verwendet dieses Modell, um TBI über einen handelsüblichen Schlagkraftunden und elektronisches Betätigungsgerät^16,17zu induzieren. Dieses Modell ist in der Lage, eine breite Palette von klinisch anwendbaren TBI-Zuständen in Abhängigkeit von den verwendeten biomechanischen Parametern zu produzieren. Die histologische Bewertung von TBI-Gehirnen nach einer schweren Verletzung, die in unserem Labor induziert wurde, zeigt einen signifikanten ipsilateralen kortikalen und hippocampalen Verlust sowie kontralaterale Ödeme und Verzerrungen. Darüber hinaus erzeugt CCI eine konsistente Beeinträchtigung der motorischen und kognitiven Funktion, gemessen an Verhaltenstests¹⁸. Zu den Einschränkungen der CCI gehören die Notwendigkeit der Kraniotomie und die Kosten für den Erwerb des Schlag- und Betätigungsgeräts.

Mehrere weitere Modelle von TBI existieren und sind in der Literatur gut etabliert, einschließlich der seitlichen Fluid Percussion Modell, Gewicht Drop Modell, und Blast Verletzung Modell^19,20,21. Während jedes dieser Modelle seine eigenen Vorteile hat, sind ihre Hauptnachteile gemischte Verletzungen, hohe Sterblichkeit und fehlende Standardisierung, bzw.²². Darüber hinaus bietet keines dieser Modelle die Genauigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit von CCI. Durch die Anpassung der biomechanischen Parameter, die in das Betätigungsgerät eingegeben werden, ermöglicht das CCI-Modell dem Prüfer eine präzise Kontrolle über die Größe der Verletzung, die Tiefe der Verletzung und die kinetische Energie, die auf das Gehirn angewendet wird. Dies gibt den Forschern die Möglichkeit, das gesamte Spektrum von TBI auf bestimmte Bereiche des Gehirns anzuwenden. Es ermöglicht auch die größte Reproduzierbarkeit von Experiment zu Experiment.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. C57BL/6 Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft und in einer Barriereanlage am Center for Comparative Medicine der Northwestern University (Chicago, IL) untergebracht. Alle Tiere wurden in 12/12 h Licht/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.

1. Anästhesie induzieren

1. Anästhesisieren Sie die Maus mit Ketamin (125 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) intraperitoneal injiziert.

2. Vitalzeichen Überwachung alle 15 min

1. Überwachen Sie Temperatur, Atemfrequenz und Hautfarbe. Die Maus sollte sich warm anfühlen. Die Haut sollte rosa und gut durchlässig erscheinen. Die Atemfrequenz sollte 50–70 Atemzüge pro Minute reichen.

3. Prächirurgische Eingriffe

1. Wiegen Sie alle Mäuse am Tag vor der Verletzungsinduktion.
2. Sterilisieren Sie einen Satz chirurgischer Instrumente durch Autoklavieren für jedes Versuchsfach. Sterilisieren Sie das Aufprallgerät vor Gebrauch.
3. Bereiten Sie einen Erholungskäfig vor, indem Sie einen sauberen Käfig über einem elektrischen Heizkissen platzieren, das auf "niedrig" eingestellt und so positioniert ist, dass sich die Mäuse nach dem Ambulanten von der Hitze entfernen können.
4. Richten Sie den Operationssaal in einer sterilisierten laminaren Durchflusshaube ein.
   1. Positionieren Sie den stereotaxic-Betriebsrahmen.
   2. Befestigen Sie das Aufprallgerät am stereotaxic-Rahmen.
   3. Stellen Sie die Betätigungseinrichtung mit den gewünschten biomechanischen Parametern für Geschwindigkeit und Verweilzeit ein.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wird eine schwere Hirnverletzung beschrieben, bei der eine Aufprallspitze mit einem Durchmesser von 3 mm über eine Kraniektomie mit einem Durchmesser von 5 mm mit einer Geschwindigkeit von 2,5 m/s und einer Verweilzeit von 0,1 s verwendet wird. Eine breite Palette von biomechanischen Parametern kann verwendet werden, um das gesamte Spektrum von TBI zu induzieren.
5. Verpassen Sie neue persönliche Schutzausrüstung und sterile Handschuhe.
6. Rasieren Sie das Fell von der operativen Website mit elektrischen Clippers.
7. Tragen Sie eine schützende opthalmische Salbe auf die Augen der Maus auf, um Hornhautverletzungen und Trocknung zu verhindern.
8. Legen Sie die Maus in den Operationssaal.
9. Bereiten Sie die Haut mit einem Jod-basierten chirurgischen Peeling abwechselnd mit Alkohol dreimal.

4. Anwendung kontrollierter kortikaler Auswirkungen

1. Incise die Kopfhaut 1 cm in der Mittellinie mit einem Skalpell, das den Schädel freilegt.
2. Positionieren Sie die Maus innerhalb eines stereotaxic-Betriebsrahmens, indem Sie die bilateralen zeitlichen Knochen zwischen Miniatur-Ohrstangen sichern und die Schneidezähne innerhalb einer Schneidezähne verriegeln, wodurch ein stabiler Dreipunktgriff am Mauskopf entsteht.
3. Ziehen Sie die Kopfhaut mit einem Hämostat oder Verriegelungszange von der Operationsstelle weg, um sicherzustellen, dass die Kopfhaut während der Kraniektomie nicht mit dem Bohrer in Kontakt kommt.
4. Identifizieren Sie die sagittalen und koronalen Nähte auf dem exponierten Schädel.
   HINWEIS: Dieses Protokoll zentriert die Kraniektomie 2 mm links der sagittalen Naht und 2 mm rostral zur koronalen Naht.
5. Führen Sie eine Kraniektomie mit einem Bohrer mit einem Trephin-Bohrer durch.
   1. Um die Kraniektomie durchzuführen, aktivieren Sie zuerst den Bohrer mit maximaler Geschwindigkeit und wenden Sie dann den Trephin-Bohrer senkrecht zum Schädel an der Stelle der Kraniektomie an.
   2. Tragen Sie sanften, gleichmäßigen Druck auf den Bohrer auf, sobald der Kontakt mit dem Schädel hergestellt wird. Ein leichtes "Geben" wird zu spüren sein, sobald der Bohrer durch den Schädel dringt. Nicht in die darunter liegende Dura eindringen.
      HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet einen 5 mm Trephin-Bohrer, um die Kraniektomie durchzuführen.
6. Verwenden Sie Zangen und eine kleine Spur hypodermische Nadel, um die Knochenklappe zu entfernen, vollständig die zugrunde liegende Dura mater aussetzen.
7. Drehen Sie die Stoßdämpferspitze in das Operationsfeld und senken Sie sie, bis sie mit der freiliegenden Dura mater in Kontakt tritt. Sobald der Kontakt hergestellt ist, wird der Kontaktsensor des Instruments einen hörbaren Ton machen, um den Chirurgen zu warnen, dass Kontakt hergestellt wurde. Dadurch wird der Nullpunkt markiert, von dem aus die Verformungstiefe festgelegt wird.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet eine 3 mm Schlagspitze, um eine schwere Verletzung zu verursachen. Tipps von bis zu 1 mm können verwendet werden, um mehr lokalisierte Verletzungen anzuwenden.
8. Ziehen Sie die Aufprallspitze zurück und stellen Sie die gewünschte Aufpralltiefe ein, indem Sie die Stoßkraftposition auf dem stereotaxic-Rahmen senken.
   HINWEIS: In diesem Protokoll beschreiben wir eine schwere Verletzung, indem wir die Verformungstiefe auf 2 mm einstellen.
9. Tragen Sie die Verletzung durch Aktivieren des Stoßeffekts auf das Betätigungsgerät auf.
10. Drehen Sie die Schlagvorrichtung aus dem Feld und entfernen Sie das Tier aus dem stereotaxic Rahmen.

5. Schließung der Chirurgischen Stelle

1. Kontrollieren Sie Blutungen aus dem Schädel und verletzte kortikale Oberfläche mit direktem Druck von einem sterilen Baumwolle gekippt Applikator.
2. Trocknen Sie den Schädel mit einem sterilen Baumwolle gekippt Applikator.
3. Schließen Sie die Kopfhaut über der Kraniektomie mit einem handelsüblichen chirurgischen Klebstoff oder Monofilament-Nähte.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wird ein veterinärchirurgischer Klebstoff verwendet, um die Kopfhaut zu schließen. Die Knochenklappe wird nicht ersetzt und verworfen.

6. Postoperative Pflege und Überwachung

1. Verabreichen Sie postoperative Analgesie (z. B. anhaltende FreisetzungBuprenorphin 0,1–0,5 mg/kg subkutan verabreicht, die 72 h anhaltende Analgesie zur Verfügung stellt).
2. Legen Sie das Tier in der seitlichen Dekubitus-Regenerationsposition in einen sauberen vorgewärmten Käfig.
3. Beobachten Sie die Tiere, bis sie wach und mobil sind, und bringen Sie dann jede Maus in ihren Heimischenkäfig zurück.
4. Sorgen Sie für freien Zugang zu Nahrungsmitteln und Wasser. Normale Nahrungs- und Wasseraufnahme werden in der Regel innerhalb von ein bis zwei Stunden nach der Verletzung wieder aufgenommen.
5. Messen Sie das Körpergewicht alle drei Tage während des Experiments.

Ergebnisse

Der Stoßsoper wird direkt am stereotaxic-Rahmen montiert und ermöglicht eine Auflösung von bis zu 10 m für die Steuerung des Aufprallpunkts, der Tiefe und des Eindringens. Die eingesetzten elektromagnetischen Kräfte können Aufprallgeschwindigkeiten von 1,5 bis 6 m/s vermitteln. Dies ermöglicht eine unvergleichliche Präzision und Reproduzierbarkeit über die gesamte Bandbreite des klinisch relevanten TBI. Die Forscher können Pilotexperimente durchführen, die die Verletzungsparameter wie Aufprallspitzengröße, A...

Diskussion

Es gibt mehrere Schritte, die für die Anwendung einer zuverlässigen und konsistenten Verletzung entscheidend sind. Zuerst muss die Maus eine tiefe Ebene der chirurgischen Anästhesie erreichen, die keine Bewegung während der Durchführung der Kraniektomie gewährleistet. Während zahlreiche Anästhesie-Therapien verwendet werden können, um Vollnarkose bei Nagetieren zu induzieren, Anästhetika, die Atemdepression enden, wie inhalative Anästhetika, kann zu Atemstillstand führen, wenn sie mit einem schweren TBI kombi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.	5939911020
Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL	Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA	BSRLAB0.5-182012
High Speed Rotary Micromotor KiT0	Foredom Electric Company	K.1070
Imapact one for Stereotaxix CCI	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39463920
Ketathesia Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein, Inc	56344
Mouse Specific Stereotaxic Base	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39462980
Trephines for Micro Drill	Fine Science Tools, Inc	18004-50