Ein verbesserter grüner Fluoreszenzprotein-basierter Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primärneuronen

Zusammenfassung

In diesem Bericht beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Untersuchung des Neuritenauswüchss in embryonalen kortikalen Neuronen von Ratten durch Co-Transfecting mit EGFP und dem Protein von Interesse.

Zusammenfassung

Neuritenwachstum ist ein grundlegendes Ereignis bei der Bildung der neuronalen Schaltkreise während der Entwicklung des Nervensystems. Schwere Neuritenschäden und synaptische Dysfunktion treten bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und altersbedingten Degeneration nen auf. Die Untersuchung der Mechanismen, die das Neuritenwachstum regulieren, würde nicht nur wertvolles Licht auf die Entwicklungsprozesse des Gehirns werfen, sondern auch auf solche neurologischen Störungen. Aufgrund der geringen Transfektionseffizienz ist es derzeit schwierig, die Wirkung eines bestimmten Proteins auf das Neuritenwachstum in primären Säugetierneuronen zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Untersuchung des Neuritenauswuchses durch die Kotransfektion von primären kortikalen Neuronen der Ersten Ratte mit EGFP und einem Protein von Interesse (POI). Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von POI transfizierten Neuronen über das EGFP-Signal, und so kann die Wirkung des POI auf das Neuritenwachstum genau bestimmt werden. Dieser EGFP-basierte Assay bietet einen bequemen Ansatz für die Untersuchung von Wegen zur Regulierung des Neuritenwachstums.

Einleitung

Neurite, einschließlich Axone und Dendriten, sind die Projektionen von Neuronen, die an der Etablierung der neuronalen Netze beteiligt sind. Das dynamische Wachstum von Neuriten ist für die Neuroentwicklung unerlässlich. Die zugrunde liegenden Regulierungsmechanismen bleiben jedoch unklar. Insbesondere neuritäre Schäden werden oft bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und nach Hirnverletzungen beobachtet¹. Daher würde die Untersuchung der Rolle vermeintlicher Moleküle in verschiedenen neuriteren Auswuchs-Regulierungswegen unser Verständnis des Prozesses verbessern. Darüber hinaus kann es neue therapeutische Ziele für verschiedene neurologische Störungen offenbaren. Neuronale Zelllinien sind wertvolle Modelle für die Untersuchung neuronaler Prozesse einschließlich Neuritenwachstum, da sie leicht zu manipulieren und transfekt^{sind 2,3}. Es wurde jedoch berichtet, dass genetische Drift in einigen häufig verwendeten Zelllinien auftritt, was zu Variationen ihrer physiologischen Reaktionen führen könnte⁴. Darüber hinaus wurde eine differenzielle Proteinexpression zwischen neuronalen Zelllinien und primären Neuronen gezeigt. Zum Beispiel, PC12, eine neuronale Zelllinie aus Derbe rinder Nebennieren, die weit verbreitet für die Untersuchung von Neuritenauswachsen verwendet wird^2,3, nicht ausdrücken NMDA-Rezeptoren⁵. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass die reduzierte Reaktionsfähigkeit der Maus Neuroblastom Linie Neuro-2a zu Neurotoxinen im Vergleich zu primären Neuronen ist aufgrund der mangelnden Expression bestimmter Membranrezeptoren und Ionenkanäle⁶. Daher sind primäre Neuronen ein wünschenswerteres und repräsentativeres Modell für die Untersuchung des Neuritenwachstums. Jedoch, die Verwendung von primären Neuronen wird durch ihre geringe Transfektion Effizienz behindert⁷.

Hier beschreiben wir eine Methode, die die Kotransfektion des Proteins von Interesse (POI) und EGFP in primäre kortikale Neuronen der Ratte beinhaltet. Das EGFP dient als morphologischer Marker zur Identifizierung erfolgreich transfizierter Neuronen und ermöglicht die Messung von Neuriten. Wir validierten diese Methode, indem wir Verbindungen/Moleküle verwendet haben, von denen berichtet wurde, dass sie das Neuritenwachstum modulieren. Darüber hinaus wurde FE65, ein neuronales Adapterprotein, das nachweislich das Neuritenwachstum stimuliert, verwendet, um diesen Ansatz zu veranschaulichen^8,9. Dieses Protokoll beinhaltet (1) die Isolierung von primären kortikalen Neuronen von embryonalen Tag 18 (E18) Rattenembryonen, (2) die Kotransfektion von Neuronen mit EGFP und dem POI (FE65 in dieser Studie) und (3) die Bildgebung und Analyse der Neuronen mit Hilfe der Bildverarbeitung Software ImageJ mit dem NeuronJ Plugin^10,11.

Protokoll

Alle verfahren entsprachen den ethischen Standards der Ethikkommission für Tierversuche der Chinesischen Universität Hongkong.

1. Herstellung von Coverlips

1. Legen Sie einen sterilen 18 mm runden Abdeckungsslip in jeden Brunnen einer 12-Well-Gewebekulturplatte.
2. Beschichten Sie den Deckelschlupf mit 5 g/ml Poly-D-Lysin-Lösung in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator für mindestens 1 h.
3. Die Poly-D-Lysin-Lösung von der Gewebekulturplatte absaugen und die beschichteten Abdeckungen einmal mit sterilem Wasser abspülen.

2. Ratte Embryonale Neuronensektion

1. Opfern Sie eine zeitschwangere Sprague-Dawley-Ratte im Schwangerschaftsalter von 18 Tagen (E18) entweder durch Zervixdislokation oder CO2-Erstickung.
   HINWEIS: Bitte überprüfen Sie die örtlichen Vorschriften für das Opfer von trächtigen Ratten.
2. Öffnen Sie die Bauchhöhle der schwangeren Ratte mit einer Sezierschere und übertragen Sie die Gebärmutter auf eine 10 cm Petrischale.
3. Öffnen Sie die Gebärmutter und den Fruchtwassersack vorsichtig mit einer kleinen Sezierenderin und entfernen Sie die Plazenta aus dem Rattenembryon mit einer kleinen Sezierenderin. Übertragen Sie den gesamten Embryo in eine 10 cm Petrischale mit vorgekühlter Phosphat-gepufferter Saline, ergänzt mit Glucose (PBS-Glucose, 10 mM Natriumphosphate, 2,68 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid und 3 g/L Glukose) mit einem Paar kleiner Zangen.
4. Schneiden Sie entlang der sagittalen Naht des Schädels und öffnen Sie es vorsichtig mit einem Paar kleiner Sezieren Schere. Übertragen Sie das embryonale Gehirn mit einem kleinen flachen Spachtel auf eine 10 cm Petrischale mit eiskaltem PBS-Glucose.
5. Trennen Sie die beiden zerebralen Hemisphären vom Kleinhirn und Hirnstamm mit zwei #5 Pinzette unter einem Zerlegungsmikroskop.
   HINWEIS: Siehe Referenz¹² für die Struktur des Rattenhirns.
6. Entfernen Sie die Meninges mit der #5 Pinzette.
7. Isolieren Sie den Kortex von den Großhirnhälften mit zwei geraden #5 Pinzette.
8. Übertragen Sie den isolierten Kortex in eine 15 ml Zentrifugenröhre in eiskalte PBS-Glucose.

3. Primäre kortikale Neuronenkultur

HINWEIS: Alle Verfahren in den Schritten 3 und 4 werden in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt.

1. Den isolierten Kortex bei 4 °C 5 min durch Schwerkraft absetzen und die PBS-Glukose ansaugen.
2. Fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA in den isolierten Kortex und mischen Sie sanft durch Tippen und Inkubieren des Gewebes in einem 37 °C Wasserbad für 10 min, um eine enzymatische Verdauung zu ermöglichen. Tippen Sie vorsichtig auf das Rohr, um alle 2 min zu mischen.
3. 4 ml Pflegemedium (z.B. Neurobasal Medium) in das Gewebe/Trypsin-Gemisch geben.
   HINWEIS: Alle Wartungsmedium in diesem Protokoll verwendet wird mit Penicillin-Streptomycin und B-27 Ergänzung¹³ergänzt.
4. Dissoziieren Sie das Gewebe sanft durch Triturierung mit einer 1 ml Pipette.
5. Pellet die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand.
6. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 bis 3.7 zweimal.
7. Das Zellpellet in 1 ml Wartungsmedium wieder aufsetzen.
8. Fügen Sie 10 L von 0,4% Trypan Blue-Lösung zu 10 l Zellsuspension für die Zählung lebensfähiger Zellen durch ein Hämozytometer hinzu.
9. Die Neuronen mit einer Dichte von 65.000/cm2 (lebensfähige Zellen) in 1 ml Pflegemedium pro Brunnen in einer 12-Well-Platte verkleben.

4. Zelltransfektion und Fixierung

1. Nach 2 Tagen in vitro (DIV2) transfekt man 0,5 g EGFP-Konstrukt (pEGFP-C1) zusammen mit oder ohne 0,5 g POI in Neuronen unter Verwendung von 1 l Transfektionsreagenz (z. B. Lipofectamin 2000). Verwenden Sie die Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Säugetierexpressionskonstrukte wurden mit einem Endotoxin-freien Plasmid-Präparat-Kit hergestellt. Die Behandlung mit Chemikalien/Molekülen (in diesem Manuskript wurden Cytochalasin D (Cyto D) und Nervenwachstumsfaktor (NGF) verwendet) kann bei 6 h nach der Transfektion erfolgen.
2. Das Kulturmedium 24 h nach der Transfektion ansaugen und die transfizierten Zellen einmal mit 37 °C PBS (10 mM Natriumphosphate, 2,68 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid) waschen.
3. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die festen Zellen dreimal mit PBS.
5. Fügen Sie eine minimale Menge an Fluoreszenz-Montagemedium auf einem Mikroskop-Glasschlitten hinzu. Übertragen Sie den Deckelrutsch von der 12-Well-Platte vorsichtig auf das Montagemedium mit der Probe zur Glasrutsche.
   HINWEIS: Versiegeln Sie den Rand des Deckels mit Nagellack, wenn ein wässriges Montagemedium verwendet wird.

5. Messung des Neuritenauswüchses

1. Verwenden Sie ein 40-faches Objektiv, um Bilder mit einem Epifluoreszenzmikroskop zu erfassen.
2. Erfassen Sie Bilder von mindestens 40 intakten Neuronen mit EGFP-Signal pro Transfektion.
3. Öffnen Sie das aufgenommene Bild in der ImageJ-Software mit dem NeuronJ-Plugin^11, um die Länge des längsten Neurites vom Zellkörper bis zur Spitze des Wachstumskegels jedes abgebildeten Neurons zu messen.
4. Analysieren Sie die mit der Software erhaltenen Daten, um die Wirkung der gezielten Proteine im Neuritenwachstum zu bestimmen.

Ergebnisse

Um diese Methode zu testen, verwendeten wir Cyto D und den Nervenwachstumsfaktor NGF, die nachweislich das Neuritenwachstum bzw.^14,15,16hemmen und stimulieren. Die Neuritenlänge der mit EGFP transfizierten Neuronen wurde nach der Behandlung mit Cyto D oder NGF gemessen. Die Transfektionseffizienz von EGFP auf die Neuronen betrug 2,7% (1.068 Neuronen gezählt). Wie in Abbildu...

Diskussion

Wie bereits erwähnt, PC12 und seine Subklonen sind weit verbreitet für das Studium der Neuritenerweiterung verwendet, weil sie ausgezeichnete Transfektionseffizienz^2,3haben. Im Gegensatz dazu haben primäre Neuronen eine niedrige Transfektionsrate, was ein großes Hindernis für die Untersuchung von Neuriten-Auswuchsregulatoren durch Transfektion⁷darstellt. Hier beschreiben wir ein praktisches Protokoll zur Quantifizierung des Neuritenwa...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061