Eine Methode zur Untersuchung der de novo Bildung von Chromatin-Domänen

Zusammenfassung

Diese Methode wurde entwickelt, um der Bildung von PRC2-vermittelten Chromatindomänen in Zelllinien zu folgen, und die Methode kann an viele andere Systeme angepasst werden.

Zusammenfassung

Die Organisation und Struktur von Chromatindomänen ist für einzelne Zelllinien einzigartig. Ihre Fehlregulation könnte zu einem Verlust der zellulären Identität und/oder Krankheit führen. Trotz enormer Anstrengungen ist unser Verständnis der Bildung und Verbreitung von Chromatin-Domänen immer noch begrenzt. Chromatin-Domänen wurden unter stationären Bedingungen untersucht, die nicht förderlich für die Verfolgung der ersten Ereignisse während ihrer Einrichtung sind. Hier stellen wir eine Methode vor, um Chromatin-Domänen induduziert und deren Neubildung als Funktion der Zeit zu verfolgen. Obwohl, zuerst auf den Fall der PRC2-vermittelten repressiven Chromatin-Domänenbildung angewendet, könnte es leicht an andere Chromatin-Domänen angepasst werden. Die Modifikation und/oder Kombination dieser Methode mit Genomik- und Bildgebungstechnologien wird unschätzbare Werkzeuge liefern, um die Etablierung von Chromatin-Domänen im Detail zu untersuchen. Wir glauben, dass diese Methode unser Verständnis davon revolutionieren wird, wie Chromatin-Domänen sich bilden und miteinander interagieren.

Einleitung

Eukaryotische Genome sind hoch gradig organisiert und Veränderungen in der Chromatin-Zugänglichkeit steuern direkt die Gentranskription¹. Das Genom enthält verschiedene Arten von Chromatin-Domänen, die mit transkriptionaler Aktivität und Replikationtiming^2,3korrelieren. Diese Chromatin-Domänen reichen von wenigen Kilobasen (kb) bis zu mehr als 100 kb und zeichnen sich durch eine Bereicherung in unterschiedlichen Histonmodifikationen^{aus 4}. Die zentralen Fragen sind: Wie werden diese Domänen gebildet und wie werden sie propagiert?

Eine der am besten charakterisierten Chromatin-Domänen wird durch die Aktivität des Polycomb-Repressionskomplexes 2 (PRC2) gefördert. PRC2 ist ein Komplex mit mehreren Untereinheiten, der aus einer Teilmenge der Polycomb-Gruppe (PcG) der Proteine^5,6besteht und die Mono-, Di- und Trimethylierung von Lysin 27 des Histons H3 (H3K27me1/me2/me3)^7,8, ^9,10. H3K27me2/me3 sind mit einem repressiven Chromatinzustand verbunden, aber die Funktion von H3K27me1 ist unklar^6,11. Eine der Kernkomponenten der PRC2, die embryonale Ektodermentwicklung (EED), bindet durch ihren aromatischen Käfig an das Endprodukt der PRC2-Katalyse, H3K27me3, und diese Funktion führt zur allosterischen Stimulation von PRC2^12,13. Die enzymatische Aktivität der VR China ist entscheidend für die Erhaltung der zellulären Identität während der Entwicklung, da die unangemessene Expression bestimmter Entwicklungsgene, die für eine bestimmte Abstammung kontraindiziert sind, schädlich wäre^5,6 . Daher ist die Auflösung der Mechanismen, mit denen PRC2 die Bildung repressiver Chromatindomänen bei Säugetieren fördert, von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der zellulären Identität.

Alle bisherigen experimentellen Systeme zur Untersuchung der Chromatin-Domänenbildung einschließlich PRC2-vermittelter Chromatin-Domänen wurden unter stationären Bedingungen durchgeführt, die nicht in der Lage sind, die sich entfaltenden Ereignisse der Chromatin-Domänenbildung in Zellen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung eines induzierbaren Zellsystems vor, das die anfängliche Rekrutierung und Verbreitung von Chromatin-Domains überwacht. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Verfolgung der Bildung von PRC2-vermittelten repressiven Chromatin-Domänen, die H3K27me2/3 umfassen. Dieses System, das die mechanistischen Details der Chromatin-Domänenbildung erfassen kann, könnte angepasst werden, um andere Chromatin-Domänen zu integrieren, wie die weithin untersuchten Domänen, die entweder H2AK119ub oder H3K9me umfassen. In Kombination mit Genomik- und Bildgebungstechnologien hat dieser Ansatz das Potenzial, verschiedene, zentrale Fragen der Chromatinbiologie erfolgreich anzugehen.

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Protokoll

Generierung induzierbarer EED-Rettungs-MESCs

1. Zellkultur

1. Verwenden Sie feederfreie C57BL/6-Maus-Embryonale Stammzellen (mESCs), die ein stabil integriertes CreERT2-Transgen besitzen, das sich bei Verabreichung von 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)¹³in den Kern transortieren kann.
2. Wachsen Sie mESCs in konventionellen ESC-Medium^14,15, ergänzt mit 1000 U/mL LIF, 1 M ERK-Hemmer PD0325901 und 3 M GSK3-Hemmer CHIR99021. Für herkömmliches ESC-Medium verwenden Sie Knockout DMEM mit 15% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1X Penicillin/Streptomycin und 0,1 mM 2-Mercaptoethanol.
3. Verwenden Sie Platten, die mit 0,1% Gelatinelösung für die Kultivierung von mESCs beschichtet sind.

2. Erzeugung von klonalen EED Knockout (KO) mESCs

1. Entwurfsanleitung RNAs (gRNAs), um Exon 10 und Exon 11 der endogenen Kopie von EED in mESCs mit dem CRISPR-Designtool in Benchling¹⁶zu löschen. EED-KO-gRNA-1 zielt unmittelbar vor Exon 10 auf das Intron und EED-KO-gRNA-2 auf das Intron unmittelbar flussabwärts von Exon 11. Die gleichzeitige Anwendung dieser gRNAs löscht sowohl Exon 10 als auch Exon 11 durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ).
2. Klonen Sie gRNAs in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) mit Anweisungen in Ran et al., 2013¹⁷.
3. In einem 6-Well-Plattenformat transfekieren Sie 2 x 10⁵ mESCs mit je 1 mg EED-KO-gRNA-1 und EED-KO-gRNA-2 (siehe Materialtabelle) unter Verwendung von Transfektionsreagenz, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Ändern Sie das Medium 24 h nach der Transfektion.
4. Zwei Tage nach der Transfektion isolieren GfP-positive Zellen mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS). Erwarten Sie, dass die Transfektionseffizienz um 10-30 % variiert. Sortieren Sie etwa 5 x 10⁵ Zellen, um genügend GFP-positive Zellen für die Beschichtung zu erfassen.
5. Die isolierten GFP-positiven mESCs in 15 cm Platten vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine (10-20 x10³ Zellen pro Platte) für die Koloniekommissionierung.
6. Wachsen Sie die Zellen im ESC-Medium für etwa eine Woche, bis einzelne Kolonien sichtbar sind. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage.
7. Wählen Sie mindestens 48 Kolonien mit 20 L Mikropipette Spitze. Schrott über die Kolonie, während in die Mikropipette Spitze zu aspirating. Zerteilen Sie die Kolonie nicht in einzelne Zellen. Übertragen Sie die Kolonie in eine accutase-haltige (20 ml) 96 Brunnenplatte.
8. Inkubieren Sie die Kolonien 10 min bei 37 °C, bis alle Zellen getrennt sind.
9. Fügen Sie 200 ml ESC-Medien in jeden Brunnen mit Mehrkanal-Pipette.
10. Mischen Sie die Zellen gut und verblechen Sie die Zellen in zwei separate 96 Brunnenplatten mit Mehrkanal-Pipette.
11. Verwenden Sie eine der 96 Brunnenplatten für die Genotypisierung und halten Sie die andere wachsen, bis die Genotypisierung abgeschlossen ist. Verwenden Sie DNA-Extraktionslösung, um DNA aus der 96-Well-Platte zu extrahieren, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
12. Verwenden Sie genotypisierende Primer Gnt_EED-KO-up und Gnt_EED-KO_down, die die gelöschte Seite umfassen und die Genotypisierung szieren PCR mit Taq DNA Polymerase nach den Anweisungen des Herstellers durchführen.
    HINWEIS: Andere Arten von DNA-Polymerasen können auch für die Genotypisierung verwendet werden, jedoch bietet Taq DNA-Polymerase Komfort, da die PCR-Reaktion direkt auf ein Gel geladen werden kann, wenn sein farbiger Reaktionspuffer verwendet wird.
    1. Beobachten Sie ein DNA-Produkt mit geringerem Molekulargewicht in Zellen mit einer homozygoten Deletion relativ zum Wildtyp-Fall (WT).
       ANMERKUNG: Um PRC2-Nullzellen zu erzeugen, ist die homozygote Löschung der Exons 10 und 11 notwendig, um EED zu destabilisieren und zu degradieren, eine wesentliche Untereinheit des Kerns PRC2¹³. Die CRISPR-Zieleffizienz beträgt rund 10 %.
13. Validieren Sie die Löschung von EED exon 10 und 11 und den Verlust von EED-Protein durch Sanger-Sequenzierung bzw. Western Blotting.
14. Bestätigen Sie die Erschöpfung von EED und H3K27me2/me3 aus Chromatin in EED KO-Zellen durch ChIP-seq unter Verwendung von Antikörpern gegen H3K27me2/me3 und EED. Verwenden Sie das Protokoll in Oksuz et al., 2017¹⁵ für ChIP-seq-Experimente.

3. Entwicklung der EED-Knockout-mESCs für Cre-ERT2-basierte induzierbare EED-Expression

1. Entwerfen Sie gRNA (EED-gRNA-inducible), um einen Schnitt innerhalb des intron folgenden Exons 9 von EED mit dem CRISPR-Design-Tool in Benchling¹⁶ einzuführen (siehe Tabelle der Materialien).
2. Klonen Sie gRNAs in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) mit Anweisungen in Ran et al., 2013¹⁷.
3. Entwerfen Sie eine Spender-Vorlagen-DNA, die EED-cDNA-Sequenz nach Exon 9 und ein C-terminales Flag-HA-Tag vor einer T2A-GFP-Sequenz umfasst, alles in umgekehrter Ausrichtung in Bezug auf die endogene Gensequenz.
   1. Flankieren Sie die Kassette mit einem Spleiß-Akzeptor und einer Polyadenylierungssequenz, die zwischen heterologen invertierten LoxP-Standorten (lox66 und lox71) verschachtelt^{ist 18}.
   2. Schließen Sie mindestens 500 bp Homologiearme von jedem Ende ein. Teilen Sie die Spendervorlage in 2 Segmente von gBlocks-Genfragmenten auf (siehe gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" und gBlock-2-Käfigmut "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") und montieren Sie sie in PCR Blunt Vektor mit Gibson Klonen nach den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: gblock-2 enthält einen aromatischen Rückstand (Y365) im EED-Käfig, der für die Interaktion mit H3K27me3¹²wichtig ist. gBlock-2-Wt enthält Wildtyprückstände, während gblock-2-cage-mutant die Käfigmutante eED (Y365A) enthält, die nicht an H3K27me3 gebunden werden kann. Induzierbare WT EED Rettung wird als i-WT-r bezeichnet und induzierbare Käfig-mutierte EED-Rettung wird als i-MT-r aus Bequemlichkeit bezeichnet.
4. In einem 6-Well-Plattenformat transfekieren Sie 2 x 10⁵ mESCs mit 1 mg der gRNA (EED-gRNA-inducible) und 1 mg der Spenderschablonen (i-WT-r oder i-MT-r) mit Transfektionsreagenz und isolieren GFP-positive Zellen mit FACS.
5. Befolgen Sie die Schritte 2.3-2.11, um einzelne Kolonien zu isolieren, die für die Genotypisierung bereit sind, um eine erfolgreiche Ausrichtung zu haben.
6. Verwenden Sie Genotypisierungsprimer Inducible_Genotype-FW-1 und Inducible_Genotype-REV-1, die die eingelegte Kassette überspannen und genotypisierende PCR mit Taq DNA-Polymerase durchführen.
   HINWEIS: Die Targeting-Effizienz für CRISPR beträgt etwa 10 %.
   1. Bestätigen Sie die korrekte Integration der Kassette per PCR mit Inducible_Genotype-FW-2 und Inducible_Genotype-REV-2 Primern, die außerhalb der Homologiearme liegen.
      HINWEIS: Die homozygote Integration der Kassette ist notwendig, um eine effiziente Rettung von EED zu erreichen. Beachten Sie, dass Zellen mit homozygoter Integration ein einziges großes DNA-Produkt im Vergleich zu WT EED produzieren, das ein kurzes Produkt produziert.
7. Bestätigen Sie die Integration der Kassette durch Sanger-Sequenzierung.
8. Bestätigen Sie das Umblättern der Kassette und den Ausdruck von EED und anderen PRC2-Kernkomponenten (z. B. EZH2 und SUZ12) bei 4-OHT-Verwaltung durch Western Blotting.
9. Bestätigen Sie die Expression von T2A-GFP und den Prozentsatz des Flip-by-Flow-Zytometrie. Beachten Sie, dass die Expression von GFP auf das Umdrehen der Kassette und den Ausdruck von EED hindeutet.

4. Nach Keimbildung und Verbreitung der PRC2-Aktivität auf Chromatin

1. Bestätigen Sie, dass i-WT-r und i-MT-r mESCs keine undichte Expression von GFP durch Durchflusszytometrie haben. Im Falle einer undichten Expression von GFP, isolieren GFP-negative Zellen durch FACS vor Beginn des Experiments.
2. Erweitern Sie die mESCs i-WT-r und i-MT-r in fünf 15 cm Platten (5x 10⁶ Zellen pro Platte).
3. Induzieren Sie die Expression von WT oder Käfig-mutierteem EED durch Verabreichung von 0,5 mM 4-OHT für 0 h, 12 h, 24 h, 36 h und 8 Tage (eine 15 cm Platte pro Zustand). Wechseln Sie das Medium nach 12 h für Behandlungen länger als 12 h. Isolieren Sie die erfolgreich rekombinierten Zellen durch FACS mit GFP. Passen Sie die Zeit der Behandlungen so an, dass alle Bedingungen auf einmal gesammelt werden.
4. Führen Sie ChIP-seq für H3K27me2, H3K27me3 durch, um ihre zeitliche Ablagerung an Chromatin als Reaktion auf die Wiederexpression von WT oder Käfig-mutiertem EED zu untersuchen. Verwenden Sie das ChIP-seq-Protokoll einschließlich der Bibliotheksvorbereitung, die in Oksuz et al., 2017¹⁵beschrieben ist.
5. Verwenden Sie die Spike-in-Steuerung in jeder Stichprobe, um einen quantitativen Vergleich zwischen verschiedenen Zeitpunkten¹⁹zu ermöglichen.
   1. Für die Spike-in-Kontrolle verwenden Sie Chromatin von Drosophila melanogaster (im Verhältnis 1:50 zum mESC-abgeleiteten Chromatin) sowie Drosophila-spezifischem H2Av-Antikörper (1 l H2Av-Antikörper pro 4 g Drosophila-Chromatin nach Herstelleranweisungen) in jeder Probe.
   2. Bereiten Sie das Chromatin von Drosophila ähnlich wie von mESCs mit dem Protokoll in Oksuz et al., 2017¹⁵.
6. Ordnen Sie die Sequenz für ChIP-seq bis mm10 Genom mit Bowtie 2 mit Denisstandardparametern²⁰.
7. Normalisieren Sie die Maus ChIP-seq liest zu spike-in Drosophila Lesezählt²¹. Berechnen Sie den Spike-in-Normalisierungsfaktor mit der folgenden Formel: 1 x 10⁶/eindeutige Drosophila-Lesezahlen. Erwarten Sie etwa 1 x 10⁶Drosophila Lesezahlen und 20 x 10⁶ Maus Lesezahlen pro Experiment zu bekommen.
   1. Fügen Sie das Drosophila-Chromatin bei der Sequenzierung der Eingangsproben nicht ein.
8. Verwenden Sie genomecov Werkzeug von Bettwerkzeugen, um Bam-Datei in Bettgraph²²zu konvertieren. Als nächstes, konvertieren Sie die bettgraph in bigwig Datei mit bedGraphToBigWig Werkzeug von USCS^23,24. Siehe das folgende Skript:
   gen="Pfad zum mm10-Genom"
   chr="Pfad zu mm10 Chromosomengrößen"
   inp_bam="pfad zur Eingabe bam-Datei "
   multiply="berechnen Sie den Spike-in-Normalisierungsfaktor"
   betttools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
   sortieren -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
   bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
9. Visualisieren Sie die ChIP-seq Lesedichten, indem Sie die bigwig-Dateien auf den USCS-Genombrowser²⁴hochladen.

5. Überwachung der Entstehung und des Wachstums der H3K27me3-Schwerpunkte in den mESCs-Kernen

1. Platte 1x 10⁴ mESCs in 8-Well-Kammer-Dias vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine.
2. Am nächsten Tag beginnen Sie mit der Durchführung aufeinander folgender 4-OHT-Induktionen (0,5 mM), um die Zellen zu sammeln, die EED für angegebene Zeitpunkte (0 h, 12 h, 24 h und 36 h) exemiten. Wechseln Sie das Medium nach 12 h für Behandlungen länger als 12 h.
3. Fixieren Sie die mESCs mit 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Saline (PBS) bei Raumtemperatur (RT) für 10 min.
4. Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBS/0,25% Triton X-100 bei RT für 30 min.
5. Blockieren Sie die Zellen mit PBS/5% Eselserum/0,1% Triton X-100 (Sperrpuffer) bei RT für 30 min.
6. H3K27me3 Primärantikörper 1:500 im Sperrpuffer verdünnen und den Zellen hinzufügen.
7. Inkubieren Sie die Zellen mit primärem Antikörper über Nacht bei 4 °C.
8. Führen Sie am nächsten Tag 3 Wässen mit PBS/0,1% Triton X-100 durch.
9. Sekundärantikörper (Alexa fluor 595) 1:1000 im Sperrpuffer verdünnen und zellenverstärken.
   1. Führen Sie alle Inkubationen im Dunkeln in den folgenden Schritten durch, da sekundäre Antikörper, die mit Alexa Fluor konjugiert sind, lichtempfindlich sind.
10. Inkubieren Sie den sekundären Antikörper für 2 h bei RT.
11. Führen Sie 3 Wässen mit PBS/0.1% Triton X-100 durch.
12. DAPI (1 mg/ml) 1:4000 mit PBS/0,1% Triton X-100 verdünnen und zellenverstärken.
13. Inkubieren Sie die Zellen mit DAPI für 10 min bei RT.
14. Montieren Sie die Zellen mit Aqua-Halterung.
15. Stellen Sie die Zellen mit konfokaler Mikroskopie bei 63-facher Vergrößerung ab.
16. Verarbeiten und Pseudo-Farbe der Bilder mit einer Verteilung von ImageJ, Fidschi²⁵.

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Ergebnisse

Ein allgemeines Schema des bedingten Rettungssystems
Abbildung 1 zeigt das Targeting-Schema zur bedingten Rettung von EED-KO-Zellen mit entweder WT- oder Käfigmutant (Y365A) EED, das aus dem endogenen EED-Lokus exprimiert wird. Nach dem Knocking out EED, einer Kernuntereinheit von PRC2, die für ihre Stabilität und enzymatische Aktivität unerlässlich ist, wird eine Kassette innerhalb des intron folgenden Exon s 9 von EED eingeführt (Abbildung 1

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Diskussion

Ein kraftvoller Ansatz, um die mechanistischen Details während der Bildung einer bestimmten Chromatin-Domäne zu verstehen, besteht darin, zuerst die Domäne zu stören und dann ihre Rekonstruktion in den Zellen zu verfolgen. Der Prozess kann jederzeit während der Rekonstruktion angehalten werden, um die laufenden Ereignisse im Detail zu analysieren. Frühere Studien an Chromatin-Domänen waren nicht in der Lage, solche Ereignisse zu lösen, wie sie unter stationären Bedingungen durchgeführt wurden (z. B. Vergleich v...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg)	Sigma	H7904-5MG	For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml)	Electron Microscopy Sciences	15710	For immunofluorescence
2-mercaptoethanol	LifeTechnologies	21985-023	For mESCs culture
2% Gelatin Solution	Sigma	G1393-100ml	For mESCs culture
Accutase 500 ML	Innovative Cell Tech/FISHER	AT 104-500	For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresaerch	711-585-152	For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium	FISHER/VWR	41799-008	For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK	Fisher Sci	177445PK	For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg	Life Tech	D1306	For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901	Stemgent	04-0006	For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein	Millipore/Fisher	ESG1107	For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified	Atlanta	S10250	For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L	For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021	Stemgent	04-0004	For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB	Cell Signaling	9728S	Antibody for ChIP-seq
H3K27me3	Cell Signaling	9733S	Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb)	Active motif	39715	Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM	Invitrogen	10829-018	For mESCs culture
L-glutamine	Sigma	G7513	For mESCs culture
Lipofectamine 2000	LifeTech	11668019	For transfection
MangoTaq DNA Polymerase	Bioline	BIO-21079	For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma/Roche	P0781	For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen	QE0905T	For Genotyping PCR
Triton X-100	Sigma	T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K270020	For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1			Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2			Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible			Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor			https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible			Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor			https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1			Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1			Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1			Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1			Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2			Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2			Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.