Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon

Zusammenfassung

Präsentiert wird hier eine Elektroporationsmethode für die Plasmid-DNA-Abgabe und ependymogliale Zellbeschriftung im erwachsenen Zebrafischtelencephalon. Dieses Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Visualisierung und Verfolgung einzelner ependymoglialer Zellen und eröffnet neue Möglichkeiten, Elektroporation auf eine breite Palette genetischer Manipulationen anzuwenden.

Zusammenfassung

Elektroporation ist ein Transfektionsverfahren, bei dem ein elektrisches Feld auf Zellen angewendet wird, um temporäre Poren in einer Zellmembran zu erzeugen und ihre Durchlässigkeit zu erhöhen, wodurch verschiedene Moleküle in die Zelle eingeführt werden können. In diesem Papier wird Elektroporation verwendet, um Plasmide in ependymogliale Zellen einzuführen, die die ventrikuläre Zone des erwachsenen Zebrafischtelencephalons aussäumen. Ein Bruchteil dieser Zellen zeigt Stammzelleigenschaften und erzeugt neue Neuronen im Zebrafischgehirn; Daher ist es wichtig, ihr Verhalten zu untersuchen, um ihre Rolle bei der Neurogenese und Regeneration zu bestimmen. Die Einführung von Plasmiden über Elektroporation ermöglicht die langfristige Kennzeichnung und Verfolgung einer einzelnen ependymogliaalen Zelle. Darüber hinaus können Plasmide wie Cre recombinase oder Cas9 an einzelne ependymogliade Zellen abgegeben werden, was eine Genrekombination oder Genbearbeitung ermöglicht und eine einzigartige Gelegenheit bietet, die autonome Genfunktion der Zelle in einer kontrollierten, natürlichen umgebung. Schließlich wird dieses detaillierte, schrittweise Elektroporationsprotokoll verwendet, um eine erfolgreiche Einführung von Plasmiden in eine große Anzahl von einzelnen ependymogliaalen Zellen zu erhalten.

Einleitung

Zebrafische sind ausgezeichnete Tiermodelle, um die Hirnregeneration nach einer Stichwunde zu untersuchen. Im Vergleich zu Säugetieren weisen auf der evolutionären Leiter weniger entwickelte Arten wie Zebrafische im Allgemeinen höhere Raten konstitutiver Neurogenese und breitere Bereiche des aufenthaltes von adulten neuronalen Stammzellen auf, was zu einer konstanten Erzeugung neuer Neuronen im gesamten die meisten Hirnbereiche im Erwachsenenleben. Diese Funktion scheint mit deutlich höheren Regenerationsfähigkeit von Zebrafischen im Vergleich zu Säugetieren¹korrelieren, da Zebrafische ein bemerkenswertes Potenzial haben, in den meisten untersuchten Hirnverletzungsmodellen effizient neue Neuronen zu erzeugen^{2, 3,4,5,6,7,8}. Hier wird der Zebrafisch Telencephalon untersucht, da es sich um ein Hirngebiet mit prominenter Neurogenese im Erwachsenenalter handelt. Diese Zonen der adulten Neurogenese sind homologe zu neurogenen Zonen im erwachsenen Säugetiergehirn^9,10,11.

Reichlich neurogene Bereiche im Zebrafisch Telencephalon sind aufgrund der Existenz von radialen Glia wie Zellen oder Ependymoglia-Zellen vorhanden. Ependymogliade Zellen fungieren als ansässige adulte neuronale Stammzellen und sind verantwortlich für die Erzeugung neuer Neuronen sowohl im intakten als auch im regenerierenden Gehirn^3,5. Lineage-Tracing-Experimente haben gezeigt, dass ventrikuläre Ependymoglia auf Verletzungen reagieren, sich dannvermehren und neue Neuroblasten erzeugen, die zur Läsionsstelle 5 wandern. Aufgrund der immerleten Natur von Zebrafischtelencephalon säumen ependymogliale Zellen die ventrikuläre Oberfläche und bauen die ventrale ventrikuläre Wand. Die dorsale ventrikuläre Wand wird durch eine dorsale ependymale Zellschicht gebildet (Abbildung 1A). Wichtig ist, dass Zebrafische ependymoglia die Eigenschaften sowohl der Radialglia als auch der ependymalen Zellen verkörpern. Lange radiale Prozesse sind ein typisches Merkmal von radialen Gliazellen, während Zellverlängerungen und enge Knoten (sowie ihre ventrikulären Positionen) typische Merkmale der ependymalen Zellen^12,13,14sind. Daher werden diese Zellen als ependymogliade Zellen bezeichnet.

Um dem In-vivo-Verhalten einzelner ependymotgliaaler Zellen während der Regeneration zu folgen, müssen sie zuverlässig beschriftet werden. Verschiedene Methoden der In-vivo-Zellbeschriftung für die fluoreszierende Mikroskopie wurden bereits beschrieben, wie z. B. endogene Reporter oder lipophile Farbstoffe¹⁵. Diese Methoden können im Gegensatz zur Elektroporation längere Zeiträume erfordern und bieten oft nicht die Möglichkeit der Einzelzellkennzeichnung oder permanenten Langzeitverfolgung. Die Elektroporation bietet jedoch (neben der Einzelzellbeschriftung) die Möglichkeit, neue DNA in die Wirtszelle einzuführen. Darüber hinaus hat sich im Vergleich zu anderen Methoden der DNA-Übertragung in die Zellen gezeigt, dass die Elektroporation eine der effizientesten Methoden^16,17,18,19ist.

Hier wird ein Elektroporationsprotokoll vorgestellt, das verfeinert wurde, um einzelne ependymogliale Zellen im erwachsenen Zebrafischtelencephalon zu kennzeichnen. Dieses Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einzelner ependyglialer Zellen, um ihnen über einen längeren Zeitraum^{von 20} zu folgen oder bestimmte Wege zellautonom zu manipulieren^21,22.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll verwendeten Tiere wurden unter Standardhaltungsbedingungen gehalten, und die Versuche wurden gemäß den Handhabungsrichtlinien und -vorschriften der EU und der Regierung von Oberbayern durchgeführt (AZ 55.2-1-54-2532-0916).

1. Herstellung von Plasmidmischung zur Elektroporation

1. Verdünnen Sie das Plasmid von Interesse an sterilem Wasser und fügen Sie schnelle grüne Fleckenstammlösung [1 mg/ml] hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration des Plasmids 1 g/l beträgt. Fügen Sie den Fleck mit einer Konzentration von nicht mehr als 3% hinzu, da der einzige Zweck darin besteht, die Lösung zu färben und die ventrikuläre Injektion zu visualisieren.
2. Nach der Herstellung die Plasmidlösung mischen, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen oder mit dem Finger tippen. Lagern Sie bei Raumtemperatur (RT) bis zur Nutzung.
   HINWEIS: Für die Ko-Elektroporation von zwei Plasmiden in dieselbe Zelle stellen Sie sicher, dass die Konzentration jedes einzelnen Plasmids, das in der Mischung verwendet wird, mindestens 0,8 ng/l mit einem Molverhältnis von 1:1 beträgt, um eine Co-Elektroporationseffizienz von 80 %–90 % zu erzielen.

2. Vorbereitungen für Injektions- und Elektroporationsverfahren

1. Bereiten Sie die Glaskapillaren (Außendurchmesser 1 mm, Innendurchmesser 0,58 mm) vor, die für die Injektion in das Nadelzuggerät erforderlich sind.
2. Um die richtige Menge an Plasmid zu injizieren (siehe oben), ziehen Sie die Kapillare bei einer Temperatur von 68,5 °C mit zwei leichten und zwei schweren Gewichten (siehe Tabelle der Materialien für Abzieherspezifikationen).
   HINWEIS: Falls ein anderer Abzieher verwendet wird, kalibrieren Sie die Kapillare, um das entsprechende Volumen der Elektroporation zu liefern.
3. Stellen Sie die Einspritzvorrichtung manuell auf einen Einspritzdruck von 200 hPa (durch Drehen des Pi-Reglers) und einen konstanten Druck von 0 hPa ein. Stellen Sie die Einspritzzeit manuell auf den manuellen Modus ein und steuern Sie den Druck mit dem Fußpedal.
4. Stellen Sie das Elektroporationsgerät mit fünf Impulsen bei 54–57 V (je 25 ms mit 1 s Intervallen) auf "LV-Modus" ein. Schließen Sie die Elektroden an das Gerät an.
5. Bereiten Sie einen Fischtank mit sauberem Fischwasser vor, wo die Fische nach dem Elektroporationsverfahren aus der Anästhesie geweckt werden. Belüften Sie das Wasser, indem Sie den Luftstein während der gesamten Erholungsphase an der Luftpumpe befestigen, bis der Fisch vollständig erwacht ist.
6. Nehmen Sie einen normalen Küchenschwamm und machen Sie einen Längsschnitt in den Schwamm, um Fische während des Injektions- und Elektroporationsvorgangs zu halten (siehe vorherige Veröffentlichung³).
   HINWEIS: Der Küchenschwamm sollte regelmäßig gewaschen oder ausgetauscht werden, um mögliche giftige Chemikalien zu entfernen.
7. Legen Sie eine kleine Menge hochleitfähiges Mehrzweck-Ultraschallgel neben das Injektions- und Elektroporations-Setup.
   HINWEIS: Dadurch wird eine angemessene elektrische Leitfähigkeit und damit die Verteilung der elektropoierten Zellen über das gesamte Telencephalon gewährleistet.

3. Zebrafisch Anästhesie

1. Vor der Anästhesisierung eine Anästhesielösung mit 0,2% MS222 in destilliertem Wasser vorbereiten und den pH-Wert mit Tris-HCl-Puffer auf 7 einstellen. Verdünnen Sie diesen Bestand 1:10 (d.h. auf 0,02% MS222) mit Fischwasser.
2. Anästhesisieren Sie die Fische, indem Sie sie in dieser Arbeitslösung halten, bis die Bewegung des Körpers und der Kiemen nachlässt (in der Regel für ein paar Minuten).

4. Plasmid-Lösungsinjektion

1. Füllen Sie die vorbereitete Glaskapillare mit 10 L Plasmidlösung mit Mikroladerspitzen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen innerhalb der Kapillare.
2. Drücken Sie Menü/Änderungskapillare am Injektionsgerät. Setzen Sie die Nadel ein und befesten Sie sie.
3. Unter einem Stereomikroskop mit einer Vergrößerung von 3,2x oder 4x nur die Spitze der Kapillare mit feinen Enden schneiden. Schalten Sie die Injektionsvorrichtung aus dem Kapillarmodus ändern in den Inject-Modus, und drücken Sie dann mit einem Fußpedal, um sicherzustellen, dass die Plasmidlösung leicht aus der Nadel herausläuft und ungehindert.
4. Den Fisch aus dem Haltungsbehälter mit Anästhesielösung in den Behälter (Kunststoffbox) geben. Warten Sie einige Minuten, bis die Bewegung der Kiemen nachlässt.
5. Legen Sie den Fisch in den vorbenetzten Schwamm mit der dorsalen Seite nach oben. Führen Sie alle folgenden Injektionsschritte unter dem Stereomikroskop durch, um die Genauigkeit des Verfahrens zu gewährleisten.
6. Mit einem sezierenden Mikromesser aus Edelstahl mit 40 mm Schneide und 0,5 mm Dicke, schaffen Sie ein kleines Loch im Fischschädel an der hinteren Seite des Telencephalons (Abbildung 1B), direkt neben der Grenze mit optischem Tectum.
   HINWEIS: Dieser Schritt sollte sorgfältig durchgeführt werden, da das Loch sehr klein und oberflächlich sein sollte, nur in den Schädel eindringen, um Hirnschäden zu vermeiden.
7. Neigen Sie den Fisch nach Bedarf und richten Sie die Spitze der Glaskapillare in den richtigen Winkel, um das Eindringen der Kapillarspitze durch das Loch zu erleichtern.
8. Legen Sie die Spitze der Kapillare vorsichtig durch das Loch in den Schädel, bis er die telenzephalische Herzkammer erreicht (siehe Abbildung 1B). Dies erfordert das Eindringen durch die dorsale ependymale Zellschicht. Achten Sie besonders darauf, die Kapillare nicht zu tief einzufügen, um den Kontakt mit dem Hirngewebe zu vermeiden. Halten Sie die Kapillare genau zwischen den Hemisphären und bleiben Sie innerhalb der Herzkammer, kurz nachdem sie die dorsale ependymale Schicht durchbohrt hat.
   HINWEIS: Das ist ein sehr heikler Schritt. Die Genauigkeit dieses Verfahrens wird durch Pigmentierung mutierte Linien wie messingy²⁴verbessert, so dass eine bessere Visualisierung der Glaskapillarposition während der Injektion.
9. Mit der Kapillarspitze im Inneren des Ventrikels, injizieren Sie die Plasmidlösung, indem Sie Druck mit dem Fußpedal für ca. 10 s, was etwa 1 l Plasmidlösung entspricht.
   HINWEIS: Beim Wechsel des Nadelziehers, der Kapillaren oder des Injektors sollte das System kalibriert werden, um immer eine Plasmidlösung von 1 L zu liefern. Die Kalibrierung kann durchgeführt werden, indem der Durchmesser des in ein Mineralöl ausgestoßenen Plasmidtröpfchens (z. B. Paraffinöl) gemessen und anschließend das Volumen des Tröpfchens berechnet wird. Nach 10 s Injektion sollte in das Mineralöl 1 L Plasmidflüssigkeit ausgestoßen werden.
10. Bestätigen Sie den Erfolg des vorherigen Schritts, indem Sie die Ausbreitung der Flüssigkeit im gesamten Ventrikel beobachten.

5. Elektroporation

1. Entfernen Sie den Fisch aus dem Injektionssetup, während Sie ihn noch im Schwamm halten.
2. Tauchen Sie die Innenseite der Spitze der Elektroden in das Ultraschallgel ein.
3. Bedecken Sie den Fisch Telencephalon mit einer kleinen Menge Ultraschallgel.
4. Positionieren Sie den Fischkopf zwischen den Elektroden, platzieren Sie die positive Elektrode an der ventralen Seite des Fischkopfes und die negative Elektrode auf der dorsalen Seite(Abbildung 1C), während Sie den Körper des Fisches noch im Schwamm halten. Dadurch wird die Strömungsrichtung des Stroms festgelegt, der erforderlich ist, um Ependymoglia in der subventrikulären Zone zu elektroporatieren.
5. Drücken Sie die Elektroden vorsichtig und präzise gegen das Telencephalon (Abbildung 1C). Den Strom mit dem Fußpedal abstellen. Halten Sie die Elektroden an Ort und Stelle, bis alle fünf Impulse fertig sind.

6. Fischrückgewinnung

1. Lassen Sie die Fische im zuvor vorbereiteten, kontinuierlich belüfteten Tank erholen, bis er aufwacht. Lidocain-Gel könnte auf den Schädel aufgetragen werden, um eventuell entwickelte Schmerzen zu lindern.

Ergebnisse

Die beschriebene Elektroporationsmethode ermöglicht die Abgabe von Plasmid-DNA in ependymogliale Zellen, die sich oberflächlich im Zebrafischtelencephalon und knapp unter der dorsalen ependymalen Zellschicht befinden (Abbildung 1A).

Wenn das Ergebnis der Elektroporation positiv ist, können markierte einzelne ependygliale Zellen (rote Zellen in Abbildung 2A,B) unter anderen ependy...

Diskussion

Dieses Elektroporationsprotokoll ist eine zuverlässige In-vivo-Methode zur Kennzeichnung einzelner ependymotaler Zellen. Das Protokoll kann eine weitere Anpassung benötigen, um andere Zelltypen wie Neuronen oder Oligodendrozyten zu kennzeichnen. Um eine erfolgreiche Kennzeichnung zu erreichen, können Plasmide verwendet werden, die verschiedene Promotoren enthalten. Chicken-beta Actin Promoter, eF1alpha, CMV und Ubiquitin Promoter wurden zuvor verwendet, um die Expression von verschiedenen Transgenen in Ependymoglia un...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258-25G	For coloring plasmid solution
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC.	15-60	Electrode Gel
Equipment
Air pump	TetraTec APS 50, 10l-60l		Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1 mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662
Injection device	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary	Warner Instruments	64-0766	Model No: G100-4
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micro-knife	Fine Science Tools	10056-12
Joystick micromanipulator	Narishige Japan	MN - 151
Needle holder	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device	Narishige Japan	Model No: PC-10	The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes	Greiner Bio-One International	633161