Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

Zusammenfassung

Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Zusammenfassung

Der neuroinflammatorische Zustand des Zentralnervensystems (ZNS) spielt bei physiologischen und pathologischen Erkrankungen eine Schlüsselrolle. Mikroglia, die ansässigen Immunzellen im Gehirn und manchmal die infiltrierenden Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs), regulieren das entzündungshemmende Profil ihrer Mikroumgebung im ZNS. Es wird nun akzeptiert, dass die extrazellulären Vesikelpopulationen (EV) aus Immunzellen als Immunmediatoren fungieren. Daher sind ihre Sammlung und Isolierung wichtig, um ihren Inhalt zu identifizieren, aber auch ihre biologischen Auswirkungen auf Empfängerzellen zu bewerten. Die vorliegenden Daten heben die chronologischen Anforderungen an die EV-Isolierung von Mikrogliazellen oder Blutmakrophagen hervor, einschließlich der Schritte zur Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie (SEC). Eine nicht zielgerichtete proteomische Analyse ermöglichte die Validierung von Proteinsignaturen als EV-Marker und charakterisierte den biologisch aktiven EV-Gehalt. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden auch funktionell auf der Primärkultur von Neuronen verwendet, um ihre Bedeutung als Immunmediatoren im Neuritenwachstum zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge dazu beitragen, das Neuritenwachstum in vitro zu erleichtern. Parallel dazu wurden von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge funktionell als Immunmediatoren in Sphäroidkulturen von C6-Gliomzellen eingesetzt, die Ergebnisse zeigten, dass diese EVs die Gliomzellinvasion in vitro kontrollieren. Dieser Bericht hebt die Möglichkeit hervor, die EV-vermittelten Immunzellfunktionen zu bewerten, aber auch die molekularen Grundlagen einer solchen Kommunikation zu verstehen. Diese Entschlüsselung könnte die Verwendung natürlicher Vesikel und/oder die In-vitro-Vorbereitung von therapeutischen Vesikeln fördern, um Immuneigenschaften in der Mikroumgebung von ZNS-Pathologien nachzuahmen.

Einleitung

Viele Neuropathologien stehen im Zusammenhang mit dem neuro-inflammatorischen Zustand, der ein komplexer Mechanismus ist, der zunehmend in Betracht gezogen wird, aber immer noch schlecht verstanden wird, weil die Immunprozesse vielfältig sind und von der Zellumgebung abhängen. Tatsächlich beinhalten die ZNS-Erkrankungen nicht systematisch die gleichen Aktivierungssignale und Immunzellpopulationen, so dass die pro- oder entzündungshemmenden Reaktionen als Ursachen oder Folgen von Pathologien schwer zu bewerten sind. Die hirnresidenten Makrophagen, die als "Mikroglia" bezeichnet werden, scheinen an der Schnittstelle zwischen Nerven- und Immunsystem zu sein¹. Mikroglia haben einen myeloischen Ursprung und werden aus dem Dottersack während der primitiven Hämatopoese abgeleitet, um das Gehirn zu kolonisieren, während periphere Makrophagen von der fetalen Leber während der definitiven Hämatopoese abgeleitet werden, um periphere Makrophagen zu werden². Die Mikrogliazellen kommunizieren mit Neuronen und neuronabgeleiteten Gliazellen wie Astrozyten und Oligodendrozyten³. Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass Mikroglia an neuronaler Plastizität während der ZNS-Entwicklung und der Homöostase von Erwachsenengewebe beteiligt ist, und auch im entzündlichen Zustand, der mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert ist^4,5. Andernfalls kann die Integrität der Blut-Hirn-Schranke in anderen ZNS-Pathologien beeinträchtigt werden. Die Immunantworten, insbesondere bei Glioblastom-Multiforme-Krebs, werden nicht nur von Mikroglia-Zellen unterstützt, da die Blut-Hirn-Schranke durch angiogene Prozesse und das Vorhandensein von Lymphgefäßen^6,7reorganisiert wird. Daher tritt eine große Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs) Infiltration im Hirntumor durch tumorabhängige Angiogenesemechanismen⁸auf. Die Krebszellen üben einen signifikanten Einfluss auf infiltrierte BMDMs aus, was zu immunsuppressiven Eigenschaften und Tumorwachstum⁹führt. So ist die Kommunikation zwischen den Immunzellen und ihrer Gehirnmikroumgebung schwer zu verstehen, da der Zellursprung und die Aktivierungssignale unterschiedlich sind^10,11. Es ist daher interessant, die Funktionen immunzellassoziierter molekularer Signaturen unter physiologischen Bedingungen zu erfassen. In diesem Zusammenhang kann die Zell-Zell-Kommunikation zwischen Immunzellen und Zellmikroumgebung durch die Freisetzung von extrazellulären Vesikeln (EVs) untersucht werden.

Die Elektrofahrzeuge werden mehr und mehr in der Regulierung von Immunfunktionen unter gesunden sowie pathologischen Bedingungen untersucht^12,13. Zwei Populationen, Exosomen und Mikrovesiken, können berücksichtigt werden. Sie präsentieren unterschiedliche Biogenese und Größenbereiche. Die Exosomen sind Vesikel von 30 bis 150 nm Durchmesser und werden aus dem endosomalen System erzeugt und bei der Fusion von multivesicularen Körpern (MVBs) mit der Plasmamembran abgesondert. Die Mikrovesiken haben einen Durchmesser von etwa 100–1.000 nm und werden durch einen nach außen gerichteten Aufblühen aus der Zellplasmamembran¹⁴erzeugt. Da die Exosome n.A.-Mikrovesik-Diskriminierung je nach Größe und molekularen Mustern immer noch schwer zu realisieren ist, werden wir im vorliegenden Bericht nur den Begriff Elektrofahrzeuge verwenden. Die EV-assoziierte Kommunikation im ZNS stellt einen Ahnenmechanismus dar, da Studien ihre Beteiligung an wirbellosen Arten wie Nematoden, Insekten oder Anneliden^15,16zeigten. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, die zeigen, dass Elektrofahrzeuge mit Zellen verschiedener Arten kommunizieren können, diesen Mechanismus als Schlüsselschlosssystem, das zunächst auf der Oberflächenmolekülerkennung zwischen Vesikeln und Empfängerzellen basiert und dann die Aufnahme von Mediatoren^16,17ermöglicht. Tatsächlich enthalten die Elektrofahrzeuge viele Moleküle wie Proteine (z. B. Enzyme, Signaltransduktion, Biogenesefaktor), Lipide (z. B. Ceramid, Cholesterin) oder Nukleinsäuren (z. B. DNA, mRNA oder miRNAs), die als direkte oder indirekte Regulatoren der Empfängerzellaktivitäten¹⁴wirken. Deshalb wurden auch methodische Studien an Immunzellen durchgeführt, um Elektrofahrzeuge zu isolieren und ihre Proteinsignaturen vollständig zu charakterisieren^18,19.

Die frühesten Studien zeigten die Freisetzung von Exosomen aus primär kultivierter Rattenmikroglia als induzierbaren Mechanismus nach einer Wnt3a- oder Serotonin-abhängigen Aktivierung^20,21. Funktionell im ZNS regulieren mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge die synaptische Vesikelfreisetzung durch präsynaptische Terminals in Neuronen, die zur Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit beitragen^22,23. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge könnten auch Zytokine-vermittelte Entzündungsreaktionen in großen Hirnregionen^24,25vermehren. Wichtig ist, dass die verschiedenen Liganden für die gebührenähnliche Rezeptorfamilie bestimmte Produktionen von Elektrofahrzeugen in der Mikroglia²⁶aktivieren könnten. Beispielsweise zeigen In-vitro-Studien, dass LPS-aktivierte Mikroglia BV2-Zelllinien differenzielle EV-Gehalte einschließlich pro-inflammatorische Zytokine^{produzieren 27}. Daher könnte die funktionelle Vielfalt von Immunzellsubpopulationen in den ZNS-, Mikroglia- und infiltrierenden BMDMs durch ihre eigenen EV-Populationen bewertet werden, einschließlich der Auswirkungen von Elektrofahrzeugen auf Empfängerzellen und der Identifizierung von EV-Inhalten.

Wir haben zuvor Methoden beschrieben, um die funktionellen Eigenschaften von Mikroglia- und BMDM-abgeleiteten Elektrofahrzeugen nach deren Isolierung zu bewerten^16,19. Im vorliegenden Bericht schlagen wir vor, die Wirkung von mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeugen auf das Neuritenwachstum und die Wirkung von makrophageabgeleiteten Elektrofahrzeugen auf die Kontrolle von Gliomzellaggregaten unabhängig zu bewerten. Diese Studie schlägt auch eine breit angelegte proteomische Analyse der EV-Fraktionen vor, um das EV-Isolationsverfahren zu validieren und die biologisch aktiven Proteinsignaturen zu identifizieren. Die wohltuende Wirkung und die molekulare Entschlüsselung von EEV-Inhalten könnten ihnen helfen, sie zu manipulieren und als therapeutische Mittel bei Hirnerkrankungen zu verwenden.

Protokoll

1. Primärkultur von Mikroglia/Makrophagen

1. Primärkultur der Mikroglia
   1. Kultur kommerzielle Ratte primäre Mikroglia (2 x 10⁶ Zellen) (siehe Tabelle der Materialien) in Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% exosomenfreies Serum, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin und 9,0 g/L Glukose bei 37 °C und 5% CO₂.
   2. Sammeln Sie das konditionierte Medium nach einer 48-Stunden-Kultur und gehen Sie zur Isolierung von Elektrofahrzeugen.
2. Primärkultur von Makrophagen
   1. Kultur kommerzielle Rattenprimärmakrophagen (1 x 10⁶ Zellen) im vom Hersteller zur Verfügung gestellten Medium (siehe Materialtabelle) bei 37 °C und 5%_CO2mit exosomenfreiem Serum.
   2. Sammeln Sie das konditionierte Medium nach einer 24-Stunden-Kultur und gehen Sie zur Isolierung von Elektrofahrzeugen.

2. Isolierung von Elektrofahrzeugen

1. Vorisolation von Elektrofahrzeugen von konditioniertem Medium
   1. Übertragen Sie das konditionierte Kulturmedium aus Mikroglia- oder Makrophagenkulturen (Schritte 1.1.2 oder 1.2.2) in ein konisches Rohr.
   2. Zentrifuge bei 1.200 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT), um die Zellen zu pellet.
   3. Übertragen Sie den Überstand in eine neue konische Röhre. Zentrifuge bei 1.200 x g für 20 min bei RT, um apoptotische Körper zu eliminieren.
   4. Übertragen Sie den Überstand in ein 10,4 ml Polycarbonatrohr und übertragen Sie das Rohr in einen 70,1 Ti Rotor. Ultrazentrifuge bei 100.000 x g für 90 min bei 4 °C, um die EVs zu pellet.
   5. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet, das EVs enthält, in 200 l mit gefilterter Phosphatpuffer-Saline (PBS) um 200 l von 0,20 m aus.
2. Isolierung von Elektrofahrzeugen
   1. Erstellung der hausgemachten Kolumne für Größenausschlusschromatographie (SEC)
      1. Entleeren Sie eine Glaschromatographiesäule (Länge: 26 cm; Durchmesser: 0,6 cm) (siehe Materialtisch),waschen und sterilisieren.
      2. Platzieren Sie einen 60-mm-Filter am unteren Rand der Säule.
      3. Stapeln Sie die Säule mit vernetzter Agarose-Gel-Filtrationsbasismatrix, um eine stationäre Phase mit einem Durchmesser von 0,6 cm und einer Höhe von 20 cm zu schaffen.
      4. Spülen Sie die Phase mit 50 ml von 0,20 m gefilterten PBS. Bei 4 °C aufbewahren, falls erforderlich, später verwendet werden.
   2. Legen Sie das resuspendierte EV-Pellet auf die stationäre Phase der SEC-Säule.
   3. Sammeln Sie 20 sequentielle Brüche von 250 l, während Sie weiterhin 0,20 m gefilterte PBS oben in der stationären Phase hinzufügen, um eine Trocknung der Säule zu verhindern. Bewahren Sie die Fraktionen bei Bedarf bei -20 °C auf.
      HINWEIS: Eine längere Lagerung als eine Woche kann bei -80 °C durchgeführt werden, um die EV-Integrität für die molekulare Analyse zu erhalten.
3. Matrixunterstützte Laser-Desorptionsionisierung (MALDI) Massenspektrometrie-Analyse der SEC-Fraktionen
   1. Fahren Sie mit der EV-Isolierung fort, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben.
   2. Setzen Sie das EV-Pellet mit einer Peptid-Kalibriermischlösung mit 200 l aus (siehe Tabelle der Materialien).
   3. Fahren Sie mit der EV-Sammlung fort, wie in den Abschnitten 2.2.1 bis 2.2.3 beschrieben.
   4. Die Fraktion mit einem Vakuumkonzentrator vollständig trocknen.
   5. Rekonstituieren Sie die Fraktionen mit 10 l 0,1% Trifluoressigsäure (TFA).
   6. Mischen Sie 1 l rekonstituierte Fraktion mit 1 l der Matrix von '-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) auf einer MALDI polierten Stahl-Zielplatte.
   7. Analysieren Sie alle Fraktionen mit einem MALDI-Massenspektrometer.
   8. Analysieren Sie generierte Spektren mit dedizierter Software (siehe Tabelle der Materialien).

3. Charakterisierung von Elektrofahrzeugen

1. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
   HINWEIS: Die NTA-Analyse wird mit einem Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument (siehe Materialtabelle)und einer automatisierten Spritzenpumpe durchgeführt.
   1. Machen Sie eine Verdünnung (Bereich von 1:50 bis 1:500) von jedem SEC-Anteil ab Schritt 2.2.3 mit 0,20 m gefilterten PBS.
   2. Vortex die Lösung, um EV-Aggregate zu eliminieren.
   3. Die verdünnte Lösung in eine 1 ml Spritze geben und in die automatische Spritzenpumpe geben.
   4. Passen Sie die Kameraeinstellung auf Bildschirmverstärkungsstufe (3) und Kameraebene (13) an.
   5. Klicken Sie auf Ausführen und starten Sie das folgende Skript.
      1. Laden Sie die Probe in die Analysekammer (Infusionsrate: 1.000 für 15 s).
      2. Verringern und stabilisieren Sie den Geschwindigkeitsfluss für Videoaufnahmen (Infusionsrate: 25 für 15 s). Erfassen Sie drei aufeinander folgende 60 s Videos des Partikelflusses.
      3. Passen Sie den Kamerapegel (13) und den Erkennungsschwellenwert (3) vor der Videoanalyse an. Klicken Sie auf Einstellungen| Ok, um die Analyse zu starten und klicken Sie auf Exportieren, wenn die Analyse abgeschlossen ist.
   6. Zwischen jeder Bruchanalyse mit 1 ml 0,20 m gefiltertem PBS waschen.
2. Elektronenmikroskopische (EM) Analyse
   1. Isolieren Sie Elektrofahrzeuge, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
      HINWEIS: Sterile Bedingungen sind nicht erforderlich.
   2. Wiederholen Sie Abschnitt 3.1, um Elektrofahrzeuge zu quantifizieren.
      HINWEIS: Für die EM-Analyse werden nur positive Fraktionen verwendet.
   3. Verwenden Sie einen 50 kDa Zentrifugalfilter (siehe Materialtabelle), um EV-haltige SEC-Fraktionen zu konzentrieren.
   4. Resuspend konzentrierte Elektrofahrzeuge in 30 l mit 2% Paraformaldehyd (PFA).
   5. Laden Sie 10 l der Probe auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter.
   6. Inkubieren Sie für 20 min in einer nassen Umgebung.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.5 und 3.2.6 für eine gute Absorption der Probe auf dem Raster.
   8. Übertragen Sie das Netz in einen Tropfen von 1% Glutaraldehyd in PBS für 5 min bei RT.
   9. Waschen Sie die Probe mehrmals mit Reinstwasser.
   10. Die Probe 10 min auf Eis mit einer Mischung aus 4% Uranylacetat und 2% Methylcellulose (1:9, v/v) kontrastieren. Entfernen Sie die überschüssige Mischung mit einem Filterpapier.
   11. Trocknen Sie die Probe und beobachten Sie sie unter einem Transmissionselektronenmikroskop bei 200 kV (siehe Materialtabelle).
3. Western Blot-Analyse
   1. Proteinextraktion
      1. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 bis 3.2.3, um Elektrofahrzeuge zu isolieren und zu konzentrieren.
      2. Mischen Sie 50 l RIPA-Puffer (150 mM Natriumchlorid [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Ethylenglykol-bis(2-Aminoethylether)-N,N,N,N-Tetraessigsäure [EGTA], 2 mM Ethylendiamin-Tetraessigsäure [EDTA], 100 mM Natriumfluorid [NaF], 10 mM Natriumpyrophosphat, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid [PMSF], 1x Protease-Inhibitor) mit der EV-Probe (25 l aus der EV-Konzentration auf Filter) für 5 min auf Eis, um Proteine zu extrahieren.
      3. Beschallung für 5 s (Amplitude: 500 W; Frequenz: 20 kHz), 3 mal auf Eis.
      4. Entfernen Sie vesikuläre Ablagerungen durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C.
      5. Sammeln Sie den Überstand und messen Sie die Proteinkonzentration mit der Bradford Protein-Assay-Methode.
   2. Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blotting
      1. Mischen Sie Proteinextrakte (30 g) mit 5c Laemmli Probenpuffer (v/v).
      2. Die Proteinmischung auf ein 12% Polyacrylamid-Gel auftragen.
      3. Migrieren Sie die Proteine im Gel mit TGS-Puffer (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM Glycin und 0,1% SDS), bei 70 V für 15 min und 120 V für 45 min.
      4. Übertragen Sie die Proteine 30 min mit halbtrockenem System auf die Nitrozellulosemembran.
      5. Sättigen Sie die Membran für 1 h bei RT mit Sperrpuffer (0,05% Tween 20 w/v, 5% Milchpulver w/v in 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C mit monoklonalen Anti-Human-Wärmeschockprotein 90 (HSP90) Antikörper, der im Blockierpuffer (1:100) verdünnt wird.
      7. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) für 15 min.
      8. Inkubieren Sie die Membran für 1 h bei RT mit Ziegenmeerrettich peroxidase-konjugierte Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper, der im Sperrpuffer verdünnt wird (1:10.000).
         HINWEIS: Eine negative Kontrolle wird allein mit sekundärem Antikörper durchgeführt.
      9. Wiederholen Sie den Waschschritt (Schritt 3.3.2.7).
      10. Enthüllen Sie die Membran mit verbessertem Chemilumineszenz (ECL) Western Blotting Substrat Kit (siehe Tabelle der Materialien).
4. Proteomische Analyse
   1. Proteinextraktion und In-Gel-Verdauung
      1. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 bis 3.2.3, um die Elektrofahrzeuge zu isolieren und zu konzentrieren. Wiederholen Sie Schritt 3.3.1 für die Extraktion von EV-Proteinen.
      2. Führen Sie die Proteinmigration im Stapelgel eines 12% Polyacrylamid-Gels durch.
      3. Fixieren Sie die Proteine im Gel mit Coomassie blau für 20 min bei RT.
      4. Verbrauchen Sie jedes farbige Gelstück und schneiden Sie es in kleine Stücke von 1 mm³.
      5. Waschen Sie die Gelstücke sukzessive mit 300 l jeder Lösung: Reinstwasser für 15 min, 100% Acetonitril (ACN) für 15 min, 100 mM Ammoniumbicarbonat (NH₄HCO₃) für 15 min, ACN:100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) für 15 min und 100% ACN für 5 min mit kontinuierlichem Rühren.
      6. Vollständig gelen mit Vakuumkonzentrator trocknen.
      7. Führen Sie eine Proteinreduktion mit 100 l von 100 mM NH₄HCO₃ mit 10 mM Dithiothreitol für 1 h bei 56°C durch.
      8. Führen Sie eine Proteinalkylieation mit 100 l von 100 mM NH₄HCO₃ mit 50 mM Iodoacetamid für 45 min im Dunkeln bei RT durch.
      9. Waschen Sie die Gelstücke sukzessive mit 300 l jeder Lösung: 100 mM NH₄HCO₃ für 15 min, ACN:20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) für 15 min und 100% ACN für 5 min mit einem kontinuierlichen Rühren.
      10. Die Gelstücke vollständig mit einem Vakuumkonzentrator trocknen.
      11. Führen Sie die Proteinverdauung mit 50 l Trypsin (12,5 g/ml) in 20 mM NH₄HCO₃ über Nacht bei 37 °C durch.
      12. Extrahieren Sie die verdauten Proteine aus dem Gel mit 50 l 100% ACN für 30 min bei 37 °C und dann 15 min bei RT mit kontinuierlichem Rühren.
      13. Wiederholen Sie die folgenden Extraktionsverfahren zweimal: 50 l von 5% TFA in 20 mM NH₄HCO₃ Lösung für 20 min mit kontinuierlichem Rühren.
      14. Fügen Sie 100 l von 100% ACN für 10 min mit kontinuierlichem Rühren hinzu.
      15. Trockene verdaute Proteine mit einem Vakuumkonzentrator und resuspendieren in 20 l von 0,1% TFA.
      16. Die Probe mit einer 10-L-Pipettenspitze mit C18-Reverse-Phasen-Medien zur Entsalzung und Konzentration von Peptiden (siehe Materialtabelle)und Elutepeptiden mit ACN:0,1% Ameisensäure (FA) (80:20, v/v) entsalzen.
      17. Die Probe mit einem Vakuumkonzentrator vollständig trocknen und in 20 l ACN:0,1% FA (2:98, v/v) für die flüssige Chromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) wieder aufsetzen.
   2. LC-MS/MS-Analyse
      1. Laden Sie das verdautes Peptid in das LC-MS/MS-Instrument und führen Sie eine Proben- und Datenanalyse gemäß den an anderer Stelle beschriebenen Parametern durch⁴².
   3. Rohdatenanalyse
      1. Verarbeiten Sie Massenspektrometriedaten, um Proteine zu identifizieren und identifizierte Proteine jeder Probe mit einem quantitativen Proteomik-Softwarepaket unter Verwendung von Standardparametern zu vergleichen.
      2. Exportieren Sie mit Hilfe von Standardparametern die Liste der exklusiven und überrepräsentierten Proteine aus EV-positiven Proben in einer Software, die Proteinnetzwerke und biologische Prozesse vorhersagt.
      3. Vergleichen Sie die Liste der identifizierten Proteine in den Fraktionen mit den Top 100 EV-Markern aus der Exocarta Open Access Datenbank (siehe Materialtabelle).

4. Funktionelle EVs Effekte Assay

1. Neuriten-Auswuchs-Assay auf PC-12-Zelllinie
   1. Kultur PC12 Zelllinie in komplettem DMEM-Medium (2 mM L-Glutamin, 10% fetales Pferdeserum (FHS), 5% fetales Rinderserum (FBS), 100 UI/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin).
      HINWEIS: Die Seren sind im gesamten Verfahren exosomefrei.
   2. Fügen Sie ein Deckglas (alle Brunnen) zu einer 24-Well-Platte; beschichten Sie die Platte mit Poly-D-Lysin (0,1 mg/ml) und Samen 260.000 Zellen/well.
   3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C unter 5%_CO2.
   4. Nach 24 h Inkubation das Medium in DMEM-Differenzierungsmedium (DMEM mit 2 mM L-Glutamin, 0,1% FHS, 100 UI/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin) mit 1 x 10⁶ Mikroglia-EVs (ab Schritt 1.1.2) ändern.
      HINWEIS: Die Kontrollbedingung wird ohne Mikroglia-Elektrofahrzeuge im Differenzierungsmedium durchgeführt.
   5. Laden Sie an Tag 4 nach der Aussaat alle Brunnen mit 100 l komplettem DMEM-Medium.
   6. Fixieren Sie die Zellen an Tag 7 nach der Aussaat mit 4% PFA für 20 min bei RT und spülen Sie dreimal (jeweils 10 min) mit PBS.
   7. Die Zellen mit rhodeminkonjugiertem Phalloidin 30 min bei 4 °C beflecken und 3 Mal (jeweils 10 min) mit PBS abspülen.
   8. Die Zellen mit verdünntem Hoechst 33342 (1:10,000) 30 min bei RT färben und 3 mal (jeweils 10 min) mit PBS ausspülen.
   9. Montieren Sie das Deckglas auf einem Dia mit fluoreszierendem Montagemedium (siehe Materialtabelle).
   10. Analysieren Sie das Dia mit einem konfokalen Mikroskop, nehmen Sie 5 zufällige Bilder von jedem Dia.
   11. Messen Sie das Neuritenwachstum mit einer automatisierten Quantifizierungssoftware (Gesamtneuritenlänge), wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben⁴³.
2. Neuritenwachstum auf Rattenprimärneuronen
   1. Beschichten Sie ein 8-Well-Glasschlitten mit Poly-D-Lysin (0,1 mg/ml) und Laminin (20 g/ml).
   2. Kultur ratten kommerzielle Primärneuronen in einem geeigneten Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien), indem sie 50.000 Zellen pro Brunnen plattieren und die Zellen bei 37 °C unter 5%_CO2 für 48 h inkubieren.
      HINWEIS: Die seren sind im gesamten Verfahren exosome-frei.
   3. Fügen Sie 1 x 10⁶ Mikroglia-EVs zu Neuronenkulturmedium hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C unter 5%_CO2 für 48 h mehr.
      HINWEIS: Kontrollzustand wird ohne Mikroglia-EVs im Neuronenkulturmedium durchgeführt.
   4. Befolgen Sie die Schritte 4.1.6 bis 4.1.9, um die Zellen zu fixieren und zu färben.
   5. Führen Sie die Schritte 4.1.10 und 4.1.11 aus, um die Folie zu analysieren.
3. Gliom-Zellinvasion
   1. Resuspend C6 Rattengliomzellen in vollständigem DMEM-Medium (DMEM mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1x Antibiotika) mit 5% Kollagen in einer Endkonzentration von 8.000 Zellen in 20 l.
      HINWEIS: Die seren sind im gesamten Verfahren exosome-frei.
   2. Legen Sie 5 ml PBS AT an den Boden einer 60 mm Gewebekulturschale. Invertieren Sie den Deckel und legen Sie Tropfen von 20 l (8.000 Zellen) der Zellsuspension auf den Boden des Deckels ab.
   3. Invertieren Sie den Deckel auf die PBS-gefüllte Bodenkammer und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5%_CO2 für 72 h, bis Zellsphäroide gebildet werden.
   4. Fügen Sie 1 x 10⁸ Makrophagen-EVs (ab Schritt 1.2.2) zu einem 2,2 mg/ml Kollagengemisch hinzu (2 ml Rinderkollagen-Lösung Typ I [3 mg/ml] mit 250 l mit 10x minimalem essentiellen Medium (MEM) und 500 l 0,1 m Natriumhydroxid).
      HINWEIS: Die Kontrollbedingung wird ohne Makrophagen-EVs in der Kollagenmischung durchgeführt.
   5. Verteilen Sie die Kollagenmischung mit Elektrofahrzeugen in einer 24-Well-Platte zum Einbetten von Zellsphäroiden.
   6. Implantieren Sie die neu gebildeten Zellsphäroide in der Mitte jedes Brunnens.
   7. Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37°C und 5%_CO2, um das Gel zu erstarren.
   8. Danach überlagern Sie 400 l komplettes DMEM-Medium auf der Kollagenmatrix in jedem Brunnen.
   9. Inkubieren Sie das komplette System für insgesamt 6 Tage bei 37 °C und 5%_CO2.
      HINWEIS: Die Zellinvasion aus dem Sphäroid wird durch digitale Fotografie mit einem invertierten Lichtmikroskop mit einem 4x/0.10 N.A.-Objektiv überwacht.
   10. Erfassen Sie jeden Tag Bilder von jedem Brunnen.
   11. Verarbeiten Sie Bilder und quantifizieren Invasion von Zellsphäroid-Bereiche mit der Software, wie zuvor im Detail beschrieben⁴².
       HINWEIS: Invasionundundsphäride Gebiete wurden für jeden Tag zu den Invasions- und Sphäroidbereichen normalisiert, die am Tag 0 gemessen wurden.

Ergebnisse

Eine der größten Herausforderungen bei der Zuordnung von bioulären Vesikeln (EVs) ist die Fähigkeit, die Elektrofahrzeuge vom gesamten Kulturmedium zu isolieren. In diesem Bericht stellen wir eine Methode mit Ultrazentrifugation (UC) und Größenausschlusschromatographie (SEC) vor, die an die groß angelegte Analyse von Proteinsignaturen gekoppelt ist, um EV-Marker zu validieren und bioaktive Verbindungen zu identifizieren. Die makrophagen- oder mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeuge wurden nach einer 24-h- bzw. 48-...

Diskussion

Das zentralnervöse System (ZNS) ist ein komplexes Gewebe, in dem die Zell-zu-Zell-Kommunikation normale neuronale Funktionen reguliert, die für die Homöostase³⁰notwendig sind. Elektrofahrzeuge werden heute weithin untersucht und als wichtige molekulare Ladungen für die Zell-zu-Zell-Kommunikation beschrieben³¹. Sie liefern speziell einen Cocktail von Mediatoren an Empfängerzellen und beeinflussen so ihre Funktionen unter gesunden und pathologischen Bedingungen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-rad	4561045EDU
Acetonitrile	Fisher Chemicals	A955-1
Amicon 50 kDa centrifugal filter	Merck	UFC505024
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659)	Santa-cruz	sc-13119
B27 Plus supplement	Gibco	A3582801
BenchMixer V2 Vortex Mixer	Benchmark Scientific	BV1003
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)	Bio-Rad	5000006
C18 ZipTips	Merck Millipore	ZTC18S096
C6 rat glioma cell	ATCC	ATCC CCL-107
Canonical tubes	Sarstedt	62.554.002
Centrifuge	Eppendorf	5804000010
CO2 Incubator	ThermoFisher
Confocal microscope LSM880	Carl Zeiss	LSM880
Cover glass	Marienfeld	111580
Culture Dish (60 mm)	Sarstedt	82.1473
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
DMEM	Gibco	41966029
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph	ThermoFisher
Electron microscope JEM-2100	JEOL
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03777-10G
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	ED-100G
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)			http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum	Gibco	16140071
Fetal Horse Serum	Biowest	S0960-500
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe	Fisherbrand	12893543
FlexAnalysis	Brucker
Fluorescence mounting medium	Agilent	S3023
Formic Acid	Sigma-Aldrich	695076
Formvar-carbon coated copper grids	Agar scientific Ltd	AGS162-3
Glucose	Sigma-Aldrich	G8769
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	340855
Hoechst 33342	Euromedex	17535-AAT
Idoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Expedeon	ISB1L
Invert light microscope CKX53	Olympus
L-glutamine	Gibco	25030-024
LabTek II 8 wells	Nunc	154534
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Laminin	Corning	354232
MaxQuant software (proteins identification software)			https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell	Brucker	8268711
MEM 10x	Gibco	21090-022
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385-100G
MiliQ water	Merck Millipore
Milk	Regilait	REGILAIT300
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC
MonoP FPLC column	GE Healthcare		no longer available
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	NS300
NanoSight NTA software v3.2	Malvern Panalytical
NanoSight syringe pump	Malvern Panalytical
Neurobasal	Gibco	21103-049
Nitrocellulose membrane	GE Healthcare	10600007
Nonidet P-40	Fluka	56741
Nunc multidish 24 wells	ThermoFisher	82.1473
Paraformaldehyde	Electro microscopy Science	15713
PC-12 cell line	ATCC	ATCC CRL-1721
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peptide calibration mix	LaserBio Labs	C101
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
Perseus software (Processing of identified proteins)			https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate	Santa-cruz	sc-362065
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	78830
Phosphate Buffer Saline	Invitrogen	14190094	no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm	pluriSelect	43-50060
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407
Polycarbonate centrifuge tubes	Beckman Coulter	355651
Protease Inhibitor	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
PureCol	Cell Systems	5005
Q-Exactive mass spectrometer	ThermoFisher
rapifleX mass spectrometer	Brucker
Rat cortical neurons	Cell Applications	R882N-20	Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium	Cell Applications	R620K-100	Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages	Cell Applications	R8818-10a
Rat primary microglia	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Healthcare	17014001
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Slide	Dustsher	100204
Sodium Chloride	Scharlau	SO0227
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Sodium hydroxide	Scharlab	SO0420005P
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	S6422-100G
SpeedVac Vacuum Concentrator	ThermoFisher
String software (functional protein association networks)			https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate	ThermoFisher	34075
Syringe 1.0 mL	Terumo	8SS01H1
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell	Bio-Rad	1703940
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508
Tris	Interchim	UP031657
Tris-Glycine	Euromedex	EU0550
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95765
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
Uranyl acetate	Agar Scientific Ltd	AGR1260A
Whatman filter paper	Sigma-Aldrich	WHA10347510
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	C2020-25G