Ein fluoreszenzbasierter Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung der Lipidtropfenbildung bei menschlichen Darmorganoiden

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Test für die Charakterisierung der Lipidtröpfchenbildung (LD) bei menschlichen Darmorganoiden bei Stimulation mit Fettsäuren. Wir diskutieren, wie dieser Assay für die Quantifizierung der LD-Bildung verwendet wird, und wie er für ein Hochdurchsatz-Screening für Medikamente verwendet werden kann, die die LD-Bildung beeinflussen.

Zusammenfassung

Diätetische Lipide werden vom Darmepithel als freie Fettsäuren (FAs) aufgenommen. Diese FAs werden intrazellulär in Triglyceridmoleküle (TG) umgewandelt, bevor sie in Chylomikron für den Transport zur Lymphe oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) zur intrazellulären Lagerung verpackt werden. Ein entscheidender Schritt für die Bildung von LDs ist die katalytische Aktivität von Diacylglycerol-Acyltransferasen (DGAT) im letzten Schritt der TG-Synthese. LDs sind wichtig, um toxische Lipidarten zu puffern und den Zellstoffwechsel in verschiedenen Zelltypen zu regulieren. Da das menschliche Darmepithel regelmäßig mit hohen Lipidkonzentrationen konfrontiert wird, ist die LD-Bildung von großer Bedeutung, um die Homöostase zu regulieren. Hier beschreiben wir einen einfachen Test zur Charakterisierung und Quantifizierung der LD-Bildung (LDF) bei Stimulation mit der häufigsten ungesättigten Fettsäure, Ölsäure, bei menschlichen Darmorganoiden. Der LDF-Test basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD540, der die Quantifizierung von LDs durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie ermöglicht. Der LDF-Assay kann verwendet werden, um die LD-Bildung in menschlichen Darmepithelzellen zu charakterisieren oder menschliche (genetische) Störungen zu untersuchen, die den LD-Stoffwechsel beeinflussen, wie DGAT1-Mangel. Darüber hinaus kann dieser Assay auch in einer Hochdurchsatz-Pipeline verwendet werden, um neuartige therapeutische Verbindungen zu testen, die Defekte in der LD-Bildung bei Darm- oder anderen Organoiden wiederherstellen.

Einleitung

Lipide sind ein entscheidender Bestandteil der menschlichen Ernährung und spielen eine wichtige Rolle bei der systemischen Energiespeicherung und dem Stoffwechsel. Bei der Aufnahme werden diätetische Lipide durch Bauchspeicheldrüsenlipasen zu freien Fettsäuren (FFAs) und Monoglyceriden (MGs) abgebaut. Diese Substrate werden dann von den Enterozyten des Darmepithels aufgenommen, wo sie zunächst durch Monoglycerid-Acyltransferasen (MGAT)-Enzyme zu Diglyceriden (DG) und anschließend zu Triglyceriden (TG) durch Diacylglycerin reesterifiziert werden. Acyltransferase 1 (DGAT1)¹. Schließlich sind diese TGs entweder in Chylomicrons für den Export in das Lymphsystem oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) für die intrazelluläre Lagerung^2,3integriert. Obwohl Chylomicronen benötigt werden, um diätetische Lipide auf andere Organe zu verteilen, ist die Bedeutung der intrazellulären Fettspeicherung in LDs nicht ganz klar. Jedoch, LDs haben gezeigt, dass eine regulatorische Funktion im Darm zu erfüllen, wie sie langsam Lipide in den Kreislauf bis zu 16 h nach einer Mahlzeit⁴freisetzen. Darüber hinaus haben lDs gezeigt, dass sie vor toxischen Fettsäurekonzentrationen schützen, wie z. B. bei Mausadipozyten unter lipolytischen Bedingungen⁵.

Das DGAT1-Protein befindet sich auf der endoplasmatischen Retikulummembran (ER) und spielt eine entscheidende Rolle bei der LD-Bildung im Darmepithel. Homozygote Mutationen in DGAT1 führen zu früh auftretendem schweren Durchfall und/oder Erbrechen, Hypoalbuminämie und/oder (tödlicher) Proteinverlust-Enteropathie mit Darmversagen bei Fettaufnahme, was die Bedeutung von DGAT1 bei der Lipidhomöostase des Menschen Darmepithel^6,7,8,9,10. Da das Auftreten von DGAT1-Mangel beim Menschen selten ist, ist der Zugang zu primären, vom Patienten abgeleiteten Zellen nur knapp. Darüber hinaus ist die Langzeitkultur der Darmepithelzellen seit langem auf tumorabgeleitete Zelllinien beschränkt, die die normale Physiologie nur bedingt darstellen. Daher wurde die DGAT1-vermittelte LD-Bildung meist in Fibroblasten oder tierischen Zelllinien^7,10,11,12untersucht. Als solche wurde kürzlich gezeigt, dass DGAT1-defizienten Patienten-abgeleiteten Fibroblasten weniger LDs ansammeln als gesunde Kontrollzellen nach Stimulation mit Ölsäure (OA)⁸.

Zuvor wurden Protokolle zur Kultur epitheliale Stammzellen aus jedem Magen-Darm-Organ in Form von dreidimensionalen (3D) Organoiden¹³etabliert. Diese Darmorganoide können über einen längeren Zeitraum¹³in kulturerhalten und ermöglichen die funktionelle Untersuchung patienten- und darmortspezifischer Epithelmerkmale¹⁴. Sie sind genetisch und phänotypisch stabil und können gelagert werden, was eine langfristige Expansion und Biobanking¹³ermöglicht.

Wir haben vor kurzem gezeigt, dass LD-Bildung leicht in menschlichen Darmorganoiden in einem LD-Formationstest (LDF) Assay⁶gemessen werden kann. Wenn sie OA für 16 h ausgesetzt sind, erzeugen Organoide LDs, um die Zellen vor lipidinduzierter Toxizität zu schützen. Wenn die OA-Konzentrationen zu hoch sind, sterben die Zellen durch Caspase-vermittelte Apoptose⁶ab. Der LDF-Test war zuvor weitgehend von DGAT1 abhängig, wie durch Organoide von DGAT1-mutierten Patienten und durch die Verwendung von DGAT1-spezifischen Inhibitoren⁶angezeigt wurde.

Für den hier ausführlich beschriebenen LDF-Assay werden 3D-Organoide aus Darmbiopsien kultiviert und wöchentlich durch Unterbrechung in einzelne Zellen geleitet, die leicht neue Organoide bilden. Für den LDF-Assay werden in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte 7.500 organoidabgeleitete Einzelzellen plattiert. Organoide werden über mehrere Tage gebildet, über Nacht mit 1 mM OA inkubiert und mit LD540, einem fluoreszierenden zelldurchlässigen LD-spezifischen Farbstoff, der die Bildgebung erleichtert, gebeizt. Die LD-Bildung wird dann durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie quantifiziert.

Durch die Skalierung dieses LD-Formationstests auf ein 96-Well-Format kann der Assay auch für die Hochdurchsatzanalyse der LD-Bildung verwendet werden, um neuartige Medikamente zu untersuchen, die die LD-Bildung in menschlichen Darmorganoidkulturen beeinflussen, oder um (menschliche genetische) Störungen zu untersuchen, die LD-Stoffwechsel.

Protokoll

Alle Hierbeschriebenen mit menschlichen Geweben wurden von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Utrecht (UMCU) genehmigt. Die informierte Zustimmung zur Gewebeentnahme, -erzeugung, -speicherung und -verwendung der Organoide wurde von Patienten der Wilhelmina-Kinderklinik (WKZ)-UMCU eingeholt.

1. Vorbereitung von Kulturmedien

HINWEIS: Dieses Protokoll sollte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Die Organoide sollten nach Standard-Zellkulturrichtlinien behandelt werden.

1. Bereiten Sie Basalkultur Medium.
   HINWEIS: Kulturmedium ohne Wachstumsfaktoren wird als Basalmedium (BM) bezeichnet.
   1. Fügen Sie 5 ml HEPES (1 M), 5 ml L L-Glutamin (100x) und 5 ml Penicillin-Streptomycin (5.000 U/ml) zu 500 ml des modifizierten Dulbecco-modifizierten Eagle-Mediums mit Hams Nährstoffmischung F-12 hinzu, um BM-Medium vorzubereiten.
   2. Das vorbereitete BM-Medium bei 4 °C aufbewahren und maximal 2 Monate verwenden.
2. Bereiten Sie R-Spondin und Noggin konditioniertes Medium (CM) nach dem Herstellerprotokoll vor.
   1. Kurz gesagt, wachsen die Zellen auf die gewünschte Menge in Hyperflasken mit 5 x 10⁷ Zellen in 555 ml Medium ohne selektives Antibiotikum pro Kolben.
   2. Wachsen Sie die Zellen für 4 Tage, bis sie konfluent sind.
   3. Ersetzen Sie das Medium durch BM und Kultur für 8 weitere Tage.
   4. Nach 8 Tagen Kultur bei 37 °C das Kulturmedium und die Zentrifuge für 5 min bei 450 x g sammeln, um die verbleibenden Zellen zu pellet.
   5. Filter sterilisieren Sie den Überstand und lagern Sie Aliquots des R-Spondin oder Noggin CM bei -20 °C für maximal 6 Monate.
3. Bereiten Sie Wnt3A-CM nach Boj et al.¹⁵vor.
   1. Kurz gesagt, wachsen die Zellen auf die gewünschte Menge in 145 mm Schalen mit 2 x 10⁶ Zellen in 20 ml Medium ohne selektives Antibiotikum pro Schale. Wickeln Sie jede Schale mit Plastikfolie, um eine Verdunstung des Kulturmediums zu vermeiden.
   2. Nach 8 Tagen Kultur bei 37 °C das Kulturmedium und die Zentrifuge für 5 min bei 450 x g sammeln, um die verbleibenden Zellen zu pellet.
   3. Filter sterilisieren Sie den Überstand und lagern Sie Aliquots des Wnt3A-CM bei 4 °C für maximal 2 Monate.
4. Bereiten Sie organoide Expansionsmedium.
   HINWEIS: Menschliches kleines Darmorganoid-Expansionsmedium (siehe Rezept in Ergänzender Tabelle 1) wird als hSI-EM bezeichnet. Die folgenden Schritte erzeugen ein Endvolumen von 1 L hSI-EM und können bei Bedarf nach oben oder unten skaliert werden.
   1. 1,46 g Nicotinamid in 12 ml zellkulturtauglicher Phosphat-gepufferter Kochchen (PBS) auflösen, um eine endgültige Verdünnung von 1 M zu erzeugen.
   2. Lösen Sie 245 mg n-Acetyl-Cystein in 3 ml Zellkultur-PBS auf, um eine endgültige Verdünnung von 500 mM zu erzeugen.
      HINWEIS: Um die Bildung einer Lösung zu beschleunigen, können Nicotinamid und n-Acetyl-Cystein in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert werden. Beide Lösungen können in Chargen, Aliquoted nmöglich und bei -20 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden.
   3. Filter sterilisieren beide Lösungen durch einen 0,22 m Filter in ein steriles 15 ml-Rohr.
   4. 167 ml BM zu einem sterilen 500 ml Kulturmittelkolben geben. Fügen Sie 200 ml R-Spondin-CM, 100 ml Noggin-CM und 100 l rekombinantem mEGF (500 g/ml) zu einer Endkonzentration von 50 ng/ml hinzu.
   5. 10 ml der sterilisierten Nicotinamidlösung und 2,5 ml der sterilisierten n-Acetyl-Cystein-Lösung hinzufügen. Fügen Sie 20 ml B27 Ergänzung (50x).
      HINWEIS: In diesem Stadium wird das Medium als hSI-EM ohne WAS (Wnt3A-CM, A83-01 und SB202190) bezeichnet und kann bei -20 °C gespeichert werden. Wenn das Medium in kleinere Volumina eingegliedert ist, passen Sie die Konzentrationen der folgenden Schritte entsprechend an.
   6. Auf 500 ml hSI-EM ohne WAS 10 ml Wnt3A-CM der letzten frisch zubereiteten Charge und 10 ml Wnt3A-CM der vorletzten Charge hinzufügen, um Variabilitätsänderungen in den Wnt3A-CM-Bedingungen zu minimieren.
   7. Fügen Sie A83-01 zu einer Endkonzentration von 500 nM und SB202190 zu einer Endkonzentration von 10 m hinzu.
   8. Die vorbereitete hSI-EM (mit WAS) bei 4 °C aufbewahren und maximal 2 Wochen verwenden.
      HINWEIS: Fügen Sie zusätzlichey-27632 zu einer Endkonzentration von 10 M (bezeichnet als hSI-EM+Y) hinzu, wenn Krypten oder einzelne Zellen kultiviert oder Organoide aus der Kryokonservierung gestartet werden.
5. Vorbereiten des fluoreszierenden aktivierten Zellsortierpuffers (FACS).
   1. Fügen Sie 10 ml fetales Wadenserum (FCS) zu 40 ml PBS ohne Ca²⁺/Mg²⁺ für eine Endkonzentration von 10% FCS hinzu.
      HINWEIS: Der FCS verhindert, dass Zellen an Labware haften.

2. Kulturverfahren für menschliche kleine Darmorganoide

HINWEIS: Dieses Protokoll sollte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Die Organoide sollten nach Standard-Zellkulturrichtlinien behandelt werden. Beim Umgang mit Organoiden oder organoiden Zellen sollten die Zellen nach Möglichkeit auf Eis gehalten werden. Die Zellen bleiben für einige Stunden nach der Ernte lebensfähig, wenn dies sichergestellt ist. Organoide sollten in einem Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5%_CO2kultiviert werden. Diese Bedingungen gelten für alle Inkubationsschritte mit Organoiden, die in die Kellermembranmatrix (BMM; d.h. Matrigel) in diesem Protokoll eingebettet sind. Die Autoren haben für diese Assays von Zwölffingerdarm abgeleitete Organoide verwendet.

1. Passaging-Organoide
   notiz: Jede organoide Kultur hat ihre eigene Verdoppelungszeit. Normalerweise können kleine Darmorganoide alle 7 bis 10 Tage 1:3 bis 1:5 durchführt werden. Wenn sie als einzelne Zellen durchlaufen werden, kann die Passaging-Effizienz je nach Zelldichte bis zu 1:20 betragen. Für die Einrichtung und Wartung werden Organoide in 24-Well-Platten kultiviert; für den LDF-Assay, entweder in 24- oder 96-Well-Platten.
   1. vorbereitung
      1. Vorwarm ausgepackte 24-Well-Gewebekulturplatten in einem Inkubator bei 37 °C, 5 %_CO2 mindestens über Nacht und vorzugsweise 5 Tage im Voraus.
         HINWEIS: Die Vorerwärmung der Gewebekulturplatten im Zellkultur-Inkubator sorgt für die richtige Bildung und Anhaftung von organoidhaltigen Tröpfchen von BMM.
      2. Um die Anzahl der Frost-Tau-Zyklen zu reduzieren, bereiten Sie 1 ml Aliquots BMM vor und lagern Sie bei -20 °C. Eine Durchstechflasche Mit BMM mindestens 30 min auf Eis auftauen, bevor Sie mit dem organoiden Passaging beginnen.
      3. Halten Sie ein 50 ml Rohr BM als Waschmedium auf Eis.
      4. Bereiten Sie hSI-EM wie in Abschnitt 1.4 beschrieben vor und bereiten Sie eine entsprechende Menge hSI-EM+Y vor, z. B. 15 ml für eine volle 24-Well-Platte.
   2. Organoide sammeln.
      1. Saugen Sie vorsichtig das Kulturmedium, ohne die Tröpfchen von BMM zu stören.
      2. Fügen Sie 500 l kaltebm in den ersten Brunnen der Organoide, und stören Sie die BMM Tröpfchen mit Organoiden durch Pipettieren sanft nach oben und unten mit einer P1000 Pipetette.
      3. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem gleichen Medium im nächsten Gut wie erforderlich, aber ernten Sie nicht mehr als 2 Brunnen pro 500 l BM.
      4. Sammeln Sie die Organoide in einem niedrigbindenden 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und drehen Sie sich in einer Mini-Tischzentrifuge für 15 bis 20 s (max. 2.000 x g). Den Überstand vollständig aspirieren und das letzte Medium mit einer P200 Pipette entfernen.
         HINWEIS: Wenn die Organoidkulturen unter dem Mikroskop sauber aussehen und keine abgestorbenen Zellen oder andere Trümmer enthalten, können die BMM-Tropfen in Schritt 2.1.2. direkt in Trypsin statt bm geerntet werden. Fahren Sie nach Schritt 2.1.2.3 in Schritt 2.1.3.1 direkt mit der Inkubation fort.
   3. Dissoziieren Sie die Organoide in einzelne Zellen.
      1. Fügen Sie den gesponnenen Organoiden 400 L Trypsin hinzu. Die Organoide bei 37 °C für 5 min in einem Wasserbad inkubieren.
      2. Unterbrechen Sie die verbleibenden Aggregate der Zellen, indem Sie mit einer P200-Pipette sanft nach oben und unten pfeifen. Erneut die Organoide bei 37 °C für 5 min in einem Wasserbad inkubieren.
      3. Überprüfen Sie den Fortschritt der Zelldissoziation unter dem Mikroskop mit 4-facher Vergrößerung. Wiederholen Sie manuelle Unterbrechung und Inkubation, wenn große Zellklumpen verbleiben.
      4. Wenn nur noch einzelne Zellen übrig sind, fügen Sie 1 ml BM hinzu und drehen Sie die Zellen in einer Mini-Tischzentrifuge für 15 bis 20 s herunter.
      5. Aspirieren Sie den Überstand vollständig. Setzen Sie die einzelnen Zellen in 200 l frischer hSI-EM mit einer P200 Pipette wieder aus. Fügen Sie weitere 800 L hSI-EM hinzu.
      6. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in der Suspension.
         HINWEIS: Im Labor der Autoren liefert die manuelle Zählung dissoziierter Organoidzellen zuverlässigere Ergebnisse als ein automatisierter Zellzähler. Wenn ein automatisierter Zellzähler verwendet wird, sollte die Zelldichte für nachgeschaltete Anwendungen intern getestet und angepasst werden, wenn zu wenig oder zu viele Organoide herauswachsen.
   4. Samenorganoide für die Wartung oder Lipid Tropfen Bildung Assay.
      1. Berechnen Sie das Volumen der Zellen, das für die endgültige Zelldichte benötigt wird.
         HINWEIS: Ungefähr 250 Zellen/L ist eine angemessene Dichte. In einer 24-Well-Platte werden in jedem Brunnen 30 l gesät, während 5 l in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte gesät werden.
      2. Nehmen Sie das entsprechende Volumen der Suspension heraus und passen Sie die Dichte auf 750 Zellen/L an (oder drehen Sie sich ab und suspendieren Sie, wenn die Dichte zu niedrig ist).
      3. Fügen Sie BMM der Zellsuspension im Verhältnis 2:1 hinzu. Die endgültige Zelldichte in diesem Gemisch beträgt 250 Zellen/L. Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch Pipettieren, vorsichtig vermeiden Sie Blasen.
      4. In einer vorgewärmten Gewebekulturplatte säen Sie drei 10 L Tröpfchen pro Brunnen in einer 24-Well-Platte oder ein einzelnes 5-L-Tröpfchen pro Brunnen in einer 96-Well-Platte aus.
      5. Legen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 °C, 5%_CO2 für 10 bis 15 min, um die BMM-Tröpfchen zu erstarren. In der Zwischenzeit eine angemessene Menge hSI-EM+Y in einem Wasserbad bei 37 °C vorerwärmen.
      6. Jedem Brunnen einer 24-Well-Platte oder 100 l vorsichtig 500 l vorgewärmtes hSI-EM+Y zu jeder Bohrung einer 96-Well-Platte hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C, 5%_CO2 und nach 2 bis 3 Tagen ändern Sie das Medium in hSI-EM (ohne Y) und erfrischen Sie es 2-3 mal pro Woche.
         HINWEIS: Nach 7 bis 10 Tagen sollte eine Pflegekultur der Organoide wieder durchgehen.

3. Lipid Droplet Formation Assay

1. Herstellung von Ölsäurekonjugat
   HINWEIS: Da Ölsäure (OA) hydrophob und nicht in Wasser löslich ist, wird sie mit Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert. BSA kann mehrere Fettsäuremoleküle binden und wird in diesem Fall im Verhältnis 1:8 verwendet, um Ölsäure für die Darmzellen zugänglich zu machen. Freie Fettsäuren und BSA können beide an Kunststoff-Laborware binden. Um eine ordnungsgemäße Endkonzentration zu gewährleisten, verwenden Sie Glasfläschchen und Glaspipetten, wann immer möglich.
   1. Wiegen Sie 0,2 g flüssige Ölsäure bei Raumtemperatur. 1,5 ml kulturtaugliches steriles PBS hinzufügen und das Gemisch für 1 h auf 70 °C erhitzen.
   2. 5,89 g fettsäurefreie BSA wiegen und in 33,9 ml PBS auflösen. Erwärmen Sie das Gemisch in einem Wasserbad bei 37 °C, bis die BSA vollständig aufgelöst ist.
   3. Wirbeln Sie die OA-Mischung wieder, um eine Emulsion von feinen Tröpfchen zu erzeugen und fügen Sie es sofort in die BSA-Lösung mit einer Glaspipette. Halten Sie die endletzte Lösung nach dem Hinzufügen des OA in der Nähe von 37 °C. Die Endmischung besteht aus 20 mM OA in 2,5 mM BSA.
   4. Halten Sie die Mischung 30 min bei 37 °C, bis eine klare gelbliche Lösung verbleibt.
   5. Das OA-BSA-Konjugat kann mindestens 6 Monate lang bei -20 °C eingefroren werden. Beim Auftauen eines Aliquots bei 37 °C bebrüten, bis sich die Trübung auflöst und die Mischung wieder klar ist.
      HINWEIS: Aufgrund des hohen Protein- und Lipidgehalts der kann die Mischung nicht gefiltert oder autoklaviert werden. Wenn die Komponenten mit Sorgfalt behandelt wurden, in einer laminaren Durchflusshaube, wenn möglich und mit sterilem PBS, die Autoren nicht mit mikrobiellen Infektionen.
2. LDF konfokaler Test
   1. Probenvorbereitung
      1. Passage-Organoide, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Säen Sie die organoiden Einzelzellen in einer schwarzen Klarboden-96-Well-Platte aus.
      2. Ersetzen Sie am 6. Tag der Kultur auf hSI-EM das Kulturmedium durch hSI-EM mit 1 mM OA-BSA Konjugat.
      3. Inkubieren Sie die Zellen für 16-17 h (über Nacht) bei 37 °C in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 M DGAT1-Hemmer. Einschließen einer Fahrzeugsteuerung von 2,5 mM BSA.
      4. Nach 16-17 h das Medium ansaugen, ohne die BMM-Tröpfchen zu stören. Fixieren Sie die Organoide, indem Sie den Brunnen 30 min bei Raumtemperatur 100 l neutral gepuffertes Formaldehyd zu4 % neutral gepuffertes Formaldehyd hinzufügen.
         HINWEIS: Das Formaldehyd löst das BMM teilweise auf, während die Organoide auf den Boden sinken und an der Unterseite der Platte haften.
      5. Entfernen Sie das Formaldehyd vorsichtig, und waschen Sie die Brunnen vorsichtig mit 150 l PBS pro Brunnen.
      6. Stain die Zellen für LDs mit 0,025 mg/ml LD540 und 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in PBS für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
      7. Waschen Sie die Brunnen sorgfältig mit PBS.
         HINWEIS: Das Protokoll kann hier bei Bedarf angehalten werden. Halten Sie die Proben in PBS im Dunkeln bei 4 °C. Die LD540 Färbung bleibt bis zu einer Woche stabil. Dieser Assay kann auch mit lebenden Zellen durchgeführt werden, um die LD-Bildung über einen bestimmten Zeitraum zu überwachen. Dazu muss die Fixierung aus dem Protokoll weggelassen werden, und die DAPI sollte durch Hoechst-Färbung ersetzt werden. LD540 kann LDs in lebenden Zellen in der gleichen Konzentration wie beschrieben färben.
   2. Konfokale Bildgebung
      HINWEIS: Die Bildgebung kann an vorbereiteten Organoidproben in der schwarzen Klarbodenplatte 96-Well durchgeführt werden.
      1. Für Übersichtsbilder ganzer Organoide verwenden Sie ein 40-faches Objektiv, das für konfokale Fluoreszenzaufnahmen geeignet ist.
      2. Stellen Sie das Mikroskop ein, um den DAPI-Kanal bei einer Anregung von 405 nm und einer Emissionswellenlänge von ca. 410 bis 535 nm abzubilden. Für den Farbstoff LD540 wählen Sie einen Anregungslaser bei 540 nm (543 nm ist optimal) und stellen Sie die Emissionsfilter auf 545 x 700 nm ein.
         HINWEIS: In diesem Protokoll wurde ein laserscannendes Konfokalsystem mit einem Weißlichtlaser, einem akusto-optischen Strahlsplitter (AOBS), einem 10x/20x Objektiv und einem Spektraldetektionssystem verwendet. Dies ermöglicht eine exakte Abstimmung auf die spezifischen Wellenlängen. Wenn kein vergleichbares System verfügbar ist, wählen Sie Laserlinien und Kurz-/Langpassfilter in der Nähe der oben genannten Spezifikationen. Für die Ganzorganoid-Bildgebung reicht eine Auflösung von 512 x 512 oder 1024 x 1024 für die nachgeschaltete Bildanalyse aus.
      3. Stellen Sie die Lochgröße auf 1 luftige Einheit (AU) für eine ausreichende Z-Achsen-Auflösung ein.
      4. Um die Hälfte eines kugelförmigen Organoids abzubilden, stellen Sie einen Z-Stack auf ca. 85 m.
   3. Bildanalyse
      HINWEIS: Für die Bildanalyse wurde Fidschi/ImageJ^16,17 verwendet, um maximale Projektionen zu generieren. Die Analyse kann mit jedem Bildanalyse-Softwarepaket durchgeführt werden, das maximale Projektion, manuelle Schwellenwerte und Partikelanalyse ermöglicht.
      1. Mit Fidschi/ImageJ wird der Z-Stack jedes Organoids in eine maximale Projektion transformiert: Bild | Stapel | Z-Projekt.
      2. Legen Sie den Schwellenwert für die maximale Projektion auf einen Pegel fest, in dem kein LD540-Signal in der BSA-Fahrzeugsteuerungsprobe sichtbar ist: Bild | Anpassen | Schwellenwert. Verwenden Sie diese Einstellungen, um jedes Bild zu beschumen.
      3. Messen Sie die Gesamtfluoreszenzfläche für jede maximale Projektion mit der Funktion Analysieren | Analysieren Sie Partikel.
         HINWEIS: Obwohl die Assay-Auflösung mit einem konfokalen Mikroskop besser ist, kann dieser Test auch mit einem Fluoreszenzplattenleser mit ähnlichen Filtern analysiert werden. Um die Organoidanzahl pro Brunnen zu normalisieren, sollte das LD540-Signal durch das DAPI-Signal geteilt werden. Schließlich sollte das Signal der BSA-Fahrzeugsteuerung subtrahiert werden, um die Messungen zu normalisieren. Dieser Ansatz ermöglicht es, den Assay auf ein 96-Well-Plattenformat zu skalieren.
3. LDF-Flow-Zytometrischer Assay
   1. Probenvorbereitung
      1. Passage-Organoide, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Säen Sie die organoiden Einzelzellen in einer 24-Well-Gewebekulturplatte aus. Zwei Brunnen pro Zustand reichen für die Durchflusszytometrie aus.
      2. Ersetzen Sie am 10. Tag der Kultur auf hSI-EM das Kulturmedium durch hSI-EM mit 1 mM OA-BSA Konjugat.
         HINWEIS: Im Gegensatz zur konfokalen Analyse wurden 10 Tage Wachstum in EM für den Flow Cytometry Assay anstelle von 6 Tagen gewählt. Die zusätzlichen 4 Tage Expansion führen zu optisch überlappenden Organoiden, die den mikroskopischen Assay erschweren würden. Die größere Anzahl von Zellen erleichtert jedoch die Analyse der Durchflusszytometrie.
      3. Inkubieren Sie die Zellen für 16-17 h (über Nacht) bei 37 °C in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 M DGAT1-Hemmer. Einschließen einer Fahrzeugsteuerung von 2,5 mM BSA.
      4. Sammeln Sie die Organoide nach 16-17 h, wie in Abschnitt 2.1.2 beschrieben.
      5. Dissoziieren Sie die Organoide in einzelne Zellen, wie in Abschnitt 2.1.3 beschrieben.
         HINWEIS: Obwohl nicht unbedingt erforderlich, wird empfohlen, die Zellenanzahl in jeder Probe zu überprüfen. Eine Gesamtanzahl von 10.000 Zellen pro Probe ist das absolute Minimum, das für eine ausreichende Auflösung erforderlich ist. Für optimale Ergebnisse verwenden Sie ca. 50.000 bis 100.000 Zellen.
      6. Drehen Sie die Zellen in einer Mini-Tischzentrifuge für 15 bis 20 s.
      7. Beflecken Sie jede Probe mit 500 l 0,025 mg/ml LD540 und 1 g/ml Hoechst in PBS für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
      8. Drehen Sie die Zellen in einer Mini-Tischzentrifuge für 15 bis 20 s und waschen Sie 3x mit PBS.
      9. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 15 min bei Raumtemperatur in 500 l neutral gepuffertem Formaldehyd in 500 l neutralgepuffertem Formaldehyd wieder aufhängen.
      10. Drehen Sie die Zellen herunter und waschen Sie 3x mit FACS-Puffer.
      11. Vorspülen von FACS-Rohren mit FACS-Puffer, um zu verhindern, dass Zellen an der Rohrwand kleben.
      12. Setzen Sie die Zellen in 200 L FACS-Puffer wieder aus und übertragen Sie die Zellsuspension in die vorgespülten FACS-Röhren.
   2. Zytometrische Durchflussanalyse
      1. Legen Sie die Gating-Parameter fest, um abgestorbene Zellen und Zellklumpen auszuschließen (siehe Abschnitt repräsentative Ergebnisse).
      2. Messen Sie in der endgültigen Gated Population mindestens 10.000 Zellen für zuverlässige Ergebnisse.
         HINWEIS: Aus dieser Population liefern die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von LD540 und das mittlere SSC-A-Signal zusammen ein Maß für das Gesamtvolumen der LD-Bildung pro Zelle.

Ergebnisse

Für eine ordnungsgemäße Analyse der LD-Bildung sollten die Organoide vor der Stimulation mit OA und anschließender Färbung nicht zu dicht gesät werden. Dies ist besonders wichtig für die Konfokal- und Plattenleser-Auslesung, da überlappende Organoide die Fluoreszenz stören könnten. Ein Beispiel für die richtige organoide Saatdichte (Abbildung 1A) und eine Kultur mit überlappenden Organoiden wird gezeigt (Abbil...

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll zur Bestimmung der LD-Bildung bei menschlichen Darmorganoiden bei der Inkubation mit Ölsäure zur Verfügung. Diese Methode basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD540¹⁸, der eine Charakterisierung und Quantifizierung des Gesamtvolumens von Lipidtröpfchen innerhalb einer organoiden Kultur ermöglicht. Die Verfahren zur Etablierung und Erhaltung menschlicher Darmorganoidkulturen wurden vor¹³veröffentlicht, und ein visueller Le...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-028
B27 supplement	Gibco	17504-044
Basement membrane matrix (matrigel)	BD Biosciences	356231
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG
DGAT1 inhibitor (AZD 3988)	Tocris Bioscience	4837/10
Fatty acid free BSA	Sigma-Aldrich	A7030
Formaldehyde	Klinipath	4078-9001
Glutamin (GlutaMAX, 100x)	Gibco	15630-056
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Laser scanning confocal microscope	Leica	SP8X
LD540			kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University
mEGF	Peprotech	315-09_500ug
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-100G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-500G
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)			MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Oleic acid	Sigma-Aldrich	O1008-5G
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	Sigma-Aldrich	S7067-25MG
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML
PBS without Ca2+/Mg2+	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)	R&D systems	3710-001-01
TC-treated 24 well plates	Greiner-One	662160
TC-treated black clear-bottom 96 well plates	Corning Life Sciences	353219
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)	Tocris Bioscience	2939/10
Trypsin (TrypLE Express)	Life Technologies	12604021
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)			MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)	Abcam	ab120129-10