Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip

Zusammenfassung

Dieser Bericht beschreibt eine mikrofluidische Chip-basierte Methode zum Einrichten eines Einzelzellkulturexperiments, bei dem eine hocheffiziente Kopplung und mikroskopische Analyse mehrerer Einzelzellen erreicht werden kann.

Zusammenfassung

Zell-Co-Kultur-Assays wurden häufig für die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen verwendet, um die Biologie von Krankheiten einschließlich Krebs besser zu verstehen. Es ist jedoch schwierig, den komplexen Mechanismus interzellulärer Wechselwirkungen in hochheterogenen Zellpopulationen mithilfe konventioneller Kokultursysteme zu klären, da die Heterogenität der Zellsubpopulation durch die Durchschnittswerte verdeckt wird; die herkömmlichen Co-Kultur-Systeme können nur verwendet werden, um das Populationssignal zu beschreiben, sind aber nicht in der Lage, das Verhalten einzelner Zellen zu verfolgen. Darüber hinaus haben herkömmliche einzellige experimentelle Methoden aufgrund der Poisson-Verteilung eine geringe Effizienz bei der Zellmanipulation. Mikrogefertigte Geräte sind eine neue Technologie für Einzelzellstudien, da sie einzelne Zellen mit hohem Durchsatz genau manipulieren und den Proben- und Reagenzverbrauch reduzieren können. Hier beschreiben wir das Konzept und die Anwendung eines mikrofluidischen Chips für mehrere einzellige Kokulturen. Der Chip kann effizient mehrere Arten von Einzelzellen in einer Kulturkammer erfassen (ca. 46%) und verfügt über einen ausreichenden Kulturraum, der nützlich ist, um das Verhalten der Zellen (z. B. Migration, Proliferation usw.) unter Zell-Zell-Interaktion auf einzelzeller Ebene zu untersuchen. Lymphatische Endothelzellen und orales Plattenepithelkarzinom wurden verwendet, um ein einzelliges Kokulturexperiment auf der mikrofluidischen Plattform für live multiple Einzelzell-Interaktionsstudien durchzuführen.

Einleitung

Effiziente Erfassung verschiedener Typen von Einzelzellen und Bereitstellung von ausreichend Kulturraum sind für Einzelzell-Kokulturexperimente mehrerer Typen von Einzelzellen^{erforderlich 1}. Die Begrenzung der Verdünnung ist aufgrund der geringen Kosten der erforderlichen Ausrüstung die am häufigsten verwendete Methode, um die einzelnen Zellen auf solche Experimente vorzubereiten. Aufgrund der Poisson-Verteilungsbeschränkung beträgt die maximale Einzelzellerfassungswahrscheinlichkeit jedoch nur 37 %, was die experimentelle Operation mühsam und zeitaufwändig macht². Im Gegensatz dazu kann die Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) die Poisson-Verteilungsbeschränkung überwinden, um hocheffiziente Einzelzellen vorzubereiten³. FACS ist jedoch aufgrund teurer Instrumentierungs- und Wartungskosten für einige Laboratorien möglicherweise nicht zugänglich. Mikrofabrizierte Geräte wurden vor kurzem für Einzelzellen-Trapping^4,Einzelzellen-Kopplung⁵und Einzelzellen-Kulturanwendungen entwickelt. Diese Geräte sind vorteilhaft aufgrund ihrer Fähigkeit, einzelne Zellen genau zu manipulieren⁶, durchführen Hochdurchsatzexperimente, oder reduzieren Proben- und Reagenzverbrauch. Die Durchführung einzelliger Kokulturexperimente mit mehreren Zelltypen mit den aktuellen mikrofluidischen Geräten ist jedoch immer noch eine Herausforderung, da die Poisson-Verteilung^1,7,8oder die Unfähigkeit die Geräte, um mehr als zwei Arten von einzelnen Zellen^zuerfassen 4^,5,6,9,10.

Zum Beispiel berichteten Yoon et al. über ein mikrofluidisches Gerät für die Zell-Zell-Interaktionsstudie¹¹. Dieses Gerät verwendet die probabilistische Methode, um Zellen in einer Kammer zu koppeln. Es kann jedoch nur die Kopplung von zwei verschiedenen Zelltypen aufgrund geometrischer Einschränkungen in der Gerätestruktur erreichen. Ein weiterer Bericht von Lee et al. zeigte eine deterministische Methode, einzelne Zellen zu erfassen und zu paaren¹². Dieses Gerät erhöht die Kopplungseffizienz durch die deterministische Methode, ist jedoch durch die längere Betriebszeit begrenzt, die zum Koppeln von Zellen erforderlich ist. Insbesondere kann die zweite Zellaufnahme erst durchgeführt werden, nachdem die erste gefangene Zelle nach 24 h an die Oberfläche angeschlossen wurde. Zhao et al. berichteten von einem tropfenbasierten mikrofluidischen Gerät, um zwei Arten einer einzelnen Zelle zu erfassen¹³. Wir können feststellen, dass das tropfenbasierte mikrofluidische Gerät immer noch auf die Poisson-Verteilung beschränkt ist und nur auf nicht angeschlossenen Zellen verwendet werden kann, und es ist nicht möglich, die Kulturlösung während des Kultivierungsprozesses zu ändern.

Zuvor haben wir einen mikrofluidischen "hydrodynamischen Abschaltchip" entwickelt, der deterministische hydrodynamische Kräfte nutzt, um mehrere Arten von Einzelzellen in die Kulturkammer einzufangen und anschließend ein Zell-Kokulturexperiment durchführen kann, um individuelles Zellmigrationsverhalten unter Zell-Zell-Wechselwirkungen¹⁴. Der hydrodynamische Abschaltchip besteht aus einem arrayierten Einheitensatz, der jeweils einen Serpentin-By-Pass-Kanal, einen Capture-Site und eine Kulturkammer enthält. Durch die Verwendung des Differenzwiderstands zwischen dem Serpentin-Umgehungskanal und der Kulturkammer und einem speziell entwickelten Operationsverfahren können verschiedene Arten von Einzelzellen wiederholt in die Kulturkammer eingefangen werden. Insbesondere kann der große Raum der Kulturkammer nicht nur verhindern, dass die Zelle während der Zellaufnahme gespült wird, sondern auch genügend Raum für die Zellausbreitung, Vermehrung und Migration bieten, was die Beobachtung lebender einzelliger Wechselwirkungen ermöglicht. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Produktion dieses Geräts und detaillierte Protokollschritte.

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Protokoll

1. Herstellung einer Waferform durch weiche Lithographie

HINWEIS: Maskenmusterdaten sind in unserer vorherigen Publikation¹⁴verfügbar.

1. Einen 4-Zoll-Siliziumwafer in einem 120 °C-Ofen für 15 min dehydrieren.
2. Spin Coat 4 g SU-8 2 negative Photoresist auf einen 4-Zoll-Silizium-Wafer bei 1.000 U/min für 30 s, um eine 5 'm dicke Schicht (Schicht #1) zu schaffen.
3. Weiche Backschicht #1 auf einer 65 °C-Kochplatte für 1 min und übertragen Sie die Schicht dann für 3 min auf eine 95 °C-Kochplatte #1.
4. Kühle Schicht #1 raumtemperatur, legen Sie sie auf den Halter des halbautomatischen Maskenausrichters und richten Sie sie #1 verchromte Fotomaske (Capture-Site-Layer) aus.
5. Schicht #1 mit 365 nm UV-Licht bei einer Dosis von 150 mJ/cm²aussetzen.
6. Schicht #1 aus dem Aligner entfernen und auf einer 65 °C-Kochplatte für 1 min nachbacken. Schicht #1 1 min auf eine 95 °C-Kochplatte übertragen.
7. Kühlschicht #1 Raumtemperatur. Tauchen Sie in eine Propylenglykol-Monomethyletheracetat-Lösung ein, um den unvernetzten Photoresist für 2 min wegzuwaschen. Sanft mit Stickstoffgas trocknen, um eine Schicht #1 Ausrichtungsmarkierung zu offenbaren.
8. Bedecken Sie die Schicht #1 Ausrichtungsmarke mit einem Klebeband, drehen Sie die Schicht 4 g SU-8 10 negativer Photowiderstand auf die Schicht #1 bei 1.230 U/min für 30 s, um eine 25 m dicke Schicht #2 zu erzeugen.
9. Entfernen Sie das Band, weiche Backschicht #2 auf einer 65 °C Kochplatte für 3 min, und übertragen Sie dann Schicht #2 auf eine 95 °C Kochplatte für 7 min.
10. Kühlen Sie die #2 auf Raumtemperatur, legen Sie die Schicht #2 auf den Halter des halbautomatischen Maskenausrichters und richten Sie die Schicht #2 verchromten Fotomaske (Bypass-Kanalschicht) auf die #1-Ausrichtungsmarkierung aus.
11. Schicht #2 mit 365 nm UV-Licht bei einer Dosis von 200 mJ/cm²aussetzen.
12. Schicht #2 aus dem Aligner entfernen und auf einer 65 °C-Kochplatte für 1 min nachbacken und Schicht #2 3 min auf eine 95 °C-Kochplatte übertragen.
13. Kühlschicht #2 raumtemperatur und bedecken Sie die Schicht #1 Ausrichtungsmarke mit Klebeband. Spin Coat 4 g SU-8 2050 negativer Photowiderstand auf Schicht #2 bei 1.630 U/min für 30 s, um eine 100 m dicke Schicht #3 zu erzeugen.
14. Entfernen Sie das Band, weiche Backschicht #3 auf einer 65 °C Kochplatte für 5 min, und übertragen Sie dann Schicht #3 auf eine 95 °C Kochplatte für 20 min.
15. Kühle Schicht #3 raumtemperatur, legen Sie schicht#3 auf den Halter des halbautomatischen Maskenausrichters und richten Sie die Schicht #3 verchromten Fotomaske (Kulturkammerschicht) auf die #1 Ausrichtungsmarkierung aus.
16. Schicht #3 mit 365 nm UV-Licht bei einer Dosis von 240 mJ/cm²aussetzen.
17. Schicht #3 aus dem Aligner entfernen und auf einer 65 °C-Kochplatte für 5 min nachbacken. Schicht #3 10 min auf eine 95 °C-Kochplatte übertragen.
18. Kühlschicht #3 raumtemperatur. Tauchen Sie in eine Propylenglykolmonomethyletheracetatlösung ein, um den unvernetzten Photoresist 10 min lang wegzuwaschen und mit Stickstoffgas sanft zu trocknen.

2. PDMS-Gerätevorbereitung für mehrere Einzelzellen-Erfassungen

1. Die Waferform und die Wägeschale mit 100 l Trichlorsilan in einen Trockenbaumittel legen (nur zur Silanisierung) und 15 min ein Vakuum (-85 kPa) auftragen.
   HINWEIS: Silanisieren Sie die Waferoberfläche mit Trichlorosilane, um hydrophobe Oberflächeneigenschaften vor PDMS-Gussso zu erzeugen, dass sie mühelos von der Wafer-PDMS-Form abgeschält werden kann.
2. Stoppen Sie das Vakuum, und silanisieren Sie dann die Waferform im Trockenbau (nur zur Silanisierung) bei 37 °C für mindestens 1 h.
3. Mischen Sie PDMS-Basis und PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 10:1. Gießen Sie insgesamt 20 g gemischtes PDMS in einer 15 cm Schale auf die Waferform.
4. Die 15 cm große Schale in einen Trockentrockner geben und Vakuum (-85 kPa) für 1,5 min auftragen. Dann die 15 cm Schale aus dem Trockener ziehen. Halten Sie für 20 min bei Raumtemperatur. Schließlich entfernen Sie Restluftblasen in PDMS mit Stickstoffgas.
5. Legen Sie die 15 cm Schale in einen Ofen bei 65 °C für 2-4 h, um PDMS auszuhärten.
6. Entfernen Sie das PDMS-Replikat aus der Waferform, und stanzen Sie dann einen 1,5 mm-Einlass und einen 0,5 mm Auslass auf das PDMS mit einem Innendurchmesser von 1,5 mm und einem Stanzer mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm(Abbildung 1C).
7. Reinigen Sie das PDMS-Replikat und die Gleitfläche mit abnehmbarem Klebeband und behandeln Sie die Oberfläche dann mit Sauerstoffplasma (100 W für 14 s).
8. Richten Sie die PDMS-Replikate manuell an der Folie aus und bringen Sie sie miteinander in Kontakt.
9. Legen Sie das PDMS-Dia 1 Tag lang in einen 65 °C-Ofen.
   HINWEIS: Eine dauerhafte Verbindung zwischen dem Dia und dem PDMS-Replikat wird erreicht, um das Gerät zu bilden.
10. Tauchen Sie das PDMS-Gerät in einen mit Phosphat gepufferten Salzsäure gefüllten Behälter ein und legen Sie es in einen Trockenbau. Dann Vakuum (-85 kPa) für 15 min anwenden, um Luftblasen zu entfernen.
11. Legen Sie das PDMS-Gerät in eine Zellkulturhaube und sterilisieren Sie das Gerät 30 min lang mit UV-Licht (Lichtwellenlänge: 254 nm).
12. Ersetzen Sie den PDMS-Gerätepuffer durch Medium (DMEM-F12 Basalmedium mit 1% Antibiotikum und 10% fetalem Rinderserum) und inkubieren Sie das PDMS-Gerät bei 4 °C für 1 Tag. Dadurch wird verhindert, dass Zellen an der PDMS-Oberfläche haften.

3. Herstellung einer einzelzelligen Suspension

HINWEIS: Zu den Zelltypen gehören menschliche lymphatische Endothelzellen (LECs), menschliche OSCC TW2.6-Zellen, die WNT5B-spezifische shRNA (WNT5B sh4) exdrücken, und Vektorkontrolle (pLKO-GFP), die aus unserer vorherigen Studie¹⁵gewonnen wurden. Detaillierte Anbauschritte finden Sie in unserer vorherigen Publikation.

1. Entfernen Sie das Kulturmedium, wenn die Zellen 70-80% Zusammenfluss erreichen. Dann waschen Sie die Zellen mit 5 ml sterilem PBS dreimal vorsichtig.
2. Fügen Sie 1 ml DMEM-F12-Medium mit 1 M Fluoreszenzfarbstoff in WNT5B sh4 und pLKO-GFP-Zellen ein (verwenden Sie MV2-Medium für LECs) und inkubieren Sie die Zellen dann 30 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: LECs wurden mit grünem Chlormethylfluorescein-Diacetat (CMFDA) Farbstoff, WNT5B sh4-Zellen mit blauem 7-Amino-4-Chlormethylcoumarin (CMAC) Farbstoff und pLKO-GFP-Zellen mit rotem Dil-Fluoreszenzfarbstoff gefärbt.
3. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml sterilem PBS dreimal.
4. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 2 ml von 0.25% Trypsin-EDTA (0.05% Trypsin-EDTA für LECs).
5. Inkubieren Sie die Zellen für 4 min bei Raumtemperatur und tippen Sie dann vorsichtig auf die Gewebekulturschale, um die Zellablösung zu fördern.
6. Fügen Sie 4 ml DMEM-F12 Medium hinzu, um WNT5B sh4 und pLKO-GFP-Zellen zu dispergieren (Für LECs verwenden Sie 3 ml MV2 Medium und 1 ml Trypsin-Neutralisatorlösung). Dann übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Rohr, und Zentrifuge bei 300 x g für 3 min.
7. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml DMEM-F12-Medium vorsichtig wieder auf. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen in einem Hämozytometer mit der standardmäßigen Trypan Blue-Ausschlussmethode¹⁶. Bereiten Sie 1 ml Zellsuspension bei 3 x 10⁵ Zellen/ml Konzentration im DMEM-F12-Medium vor und halten Sie die Zellen dann auf Eis, um eine Zellaggregation zu verhindern.
   HINWEIS: Um die Effizienz der Einzelzellenerfassung zu verbessern, ist eine sorgfältige Vorbereitung der einzelzelligen Suspension mit gut dissoziierten Suspension erforderlich.

4. Mehrfache einzellige Erfassung und dreifache Einzelzellkultur

1. Schließen Sie ein Polytetrafluorethen-Rohr (PTFE) zwischen dem Auslass des Geräts und der Spritzenpumpe an. Entfernen Sie das Medium, und fügen Sie dem Einlass des PDMS-Geräts 1 L Zellsuspension mit einer Konzentration von 3 x 10⁵ Zellen/ml hinzu.
2. Laden Sie die Zellsuspension mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,3 l/min in das Gerät(Abbildung 2A). Die Strömungsrichtung erfolgt vom Einlass zum Auslass.
   HINWEIS: Laden Sie sofort nach dem Hinzufügen der Zellsuspension in den Einlass, um eine Zellsedimentation zu verhindern.
3. Fügen Sie nach Schritt 4.2 1 L DMEM-F12-Medium in den Einlass des PDMS-Geräts ein(Abbildung 2B). Die Strömungsrichtung floss vom Einlass zum Auslass.
4. Mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 10 l/min(Abbildung 2C)wird 0,3 l DMEM-F12-Medium in das Gerät geladen. Die Strömungsrichtung floss vom Auslass zum Einlass.
5. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.4, um andere Zelltypen in das Gerät zu laden.
6. Nachdem Sie die Zellaufnahme abgeschlossen haben, verwenden Sie ein Mikroskop mit 4x Linse, um jede Kulturkammer abzubilden.
   HINWEIS: Die Fluoreszenzemissionen der Zellen wurden verwendet, um die Anzahl der einzelnen Zellen in jeder Kulturkammer zu identifizieren und zu zählen.
7. Entfernen Sie das PTFE-Rohr und versiegeln Sie den Einlass und den Auslass mit Polyolefinband, um ein geschlossenes Kultursystem zu schaffen.
8. Verschieben Sie das PDMS-Gerät auf eine 10 cm große Kulturschale und fügen Sie 10 ml sterile PBS um das PDMS-Gerät herum, um eine Verdunstung des Mediums vom Gerät zu vermeiden.
9. Übertragen Sie das Kulturgericht in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit) für dreifache einzellige Kultur.
10. Mikroskopisch beobachten und fotografieren Sie das Zellwachstum alle 12 h.

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Ergebnisse

Das Gerät hat eine dreilagige Struktur, wie das Querschnittsfoto eines geschnittenen PDMS-Geräts zeigt (Abbildung 1A). Die erste Schicht enthält eine Erfassungsstelle (6,0 m in der Breite und 4,6 m in der Höhe), die die Kulturkammer mit dem Umgehungskanal verbindet. Der Unterschied im Strömungswiderstand zwischen der Kulturkammer und dem Umgehungskanal bewirkt, dass die Zellen in die Erfassungsposition fließen und den Eingang des kleine...

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Diskussion

Die interzellulären Wechselwirkungen verschiedener Zellen in der Tumormikroumgebung spielen eine wichtige Rolle bei der Progression des Tumors¹⁷. Um den Mechanismus der Zell-Zell-Wechselwirkungen zu verstehen, werden Co-Kultur-Systeme als gemeinsame analytische Methode verwendet. Mehrere Zelltypen und die Heterogenität der Zellen selbst haben jedoch zu experimenteller Komplexität und analytischen Schwierigkeiten geführt.

Der hydrodynamische Abschaltchip ermöglicht ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape	3M Company	9795R
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC Dye	Invitrogen	C2110
CellTracker Green CMFDA Dye	Invitrogen	C7025
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
DMEM-F12 medium	Gibco	11320-082
Endothelial Cell Growth Medium MV 2	PromoCell	C-22022
Fetal bovine serum Hyclone	Thermo	SH30071.03HI
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )	Hamilton	80630	100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15075	with 1.5mm inner-diameter
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15071	with 0.5mm inner-diameter
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
Oxygen plasma	NORDSON MARCH	AP-300
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE)	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
SU-8 10 negative photoresist	MicroChem	Y131259
SU-8 2 negative photoresist	MicroChem	Y131240
SU-8 2050 negative photoresist	MicroChem	Y111072
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Trypsin Neutralizer Solution	Gibco	R-002-100