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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Blut - Hirn-Schranke Integrität ist entscheidend für die Funktion des Nervensystems. Bei Drosophila melanogasterwird die Blut-Hirn-Schranke bei der späten Embryogenese durch Gliazellen gebildet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Bildung und Erhaltung von Blut-Hirn-Barrieren bei D. melanogaster Embryonen und dritten Instarlarven.

Zusammenfassung

Die richtige Entwicklung des Nervensystems umfasst die Bildung der Blut- und Hirnschranke, der Diffusionsbarriere, die den Zugang zum Nervensystem streng reguliert und das Nervengewebe vor Giftstoffen und Krankheitserregern schützt. Defekte bei der Bildung dieser Barriere wurden mit Neuropathien korreliert, und der Abbau dieser Barriere wurde bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet. Daher ist es wichtig, die Gene zu identifizieren, die die Bildung und Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke regulieren, um potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Um die genaue Rolle dieser Gene bei der neuronalen Entwicklung zu verstehen, ist es notwendig, die Auswirkungen der veränderten Genexpression auf die Integrität der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. Viele der Moleküle, die bei der Etablierung der Blut - Hirn-Schranke funktionieren, wurden gefunden, um über eukaryotische Arten konserviert werden, einschließlich der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster. Fruchtfliegen haben sich als ausgezeichnetes Modellsystem zur Untersuchung der molekularen Mechanismen zur Regulierung der Entwicklung und Funktion des Nervensystems erwiesen. Dieses Protokoll beschreibt ein Schrittweiseverfahren zur Untersuchung der Integrität der Blut- und Hirnschranke während der embryonalen und larven endenden Stadien der D. melanogaster Entwicklung.

Einleitung

Während der Entwicklung sind Zell-Zell-Kommunikation und Wechselwirkungen entscheidend für die Etablierung von Gewebe- und Organstruktur und -funktion. In einigen Fällen versiegeln diese Zell-Zell-Wechselwirkungen Organe aus der Umgebung, um eine ordnungsgemäße Organfunktion zu gewährleisten. Dies gilt für das Nervensystem, das durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) isoliert wird. Dysfunktion der BBB beim Menschen wurde mit neurologischen Erkrankungen einschließlich Epilepsie verbunden, und Abbau der Barriere wurde bei neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Multipler Sklerose und amyotrophe Lateralsklerose beobachtet1. Bei Säugetieren wird das BBB durch enge Kreuzungen zwischen den Endothelzellen2,3gebildet. Andere Tiere, einschließlich der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, haben ein BBB, das aus Gliazellen besteht. Diese Gliazellen bilden eine selektiv durchlässige Barriere, um die Bewegung von Nährstoffen, Abfallprodukten, Toxinen und großen Molekülen in und aus dem Nervensystem zu kontrollieren4. Dies ermöglicht die Aufrechterhaltung des elektrochemischen Gradienten, der notwendig ist, um Einwirkungspotentiale abzufeuern, was Mobilität und Koordination ermöglicht4. In D. melanogasterschützen die Glia das Nervensystem vor der kaliumreichen, blutähnlichen Hämolymphe5.

Im Zentralnervensystem (ZNS) und peripheren Nervensystem (PNS) von D. melanogasterbilden zwei äußere Gliaschichten, die subperineuriale Glia und die perineuriale Glia, sowie ein äußeres Netzwerk extrazellulärer Matrix, die neuronale Lamelle, die Hämolymphe-Gehirn und Hämlymph-Nerven-Barriere6, in diesem Artikel als BBB bezeichnet. Während der Entwicklung subperineurialglia werden polyploid und vergrößern, um das Nervensystem zu umgeben5,6,7,8,9,10,11 . Die subperineurialen Glia bilden Septat-Kreuzungen, die die Hauptdiffusionsbarriere zwischen der Hämolymphe und dem Nervensystem5,6,12. Diese Kreuzungen ähneln molekular den septatartigen Kreuzungen, die an den Paranoden der myelinierenden Glia in Wirbeltieren gefunden werden, und sie erfüllen die gleiche Funktion wie enge Kreuzungen in der BBB von Säugetieren13,14, 15 , 16 , 17. Die perineuriale Glia teilen, wachsen und wickeln um die subperineuriale Glia, um die Diffusion von Metaboliten und großen Molekülenzuregulieren 6,10,18,19. Die BBB-Formation ist nach der Eiablage (AEL) bei 25 °C5,8um 18,5 h abgeschlossen. Frühere Studien haben Gene identifiziert, die kritische Regulatoren der BBB-Bildung20,21,22sind. Um die genauen Rollen dieser Gene besser zu verstehen, ist es wichtig, die Auswirkungen der Mutation dieser potenziellen Regulatoren auf die BBB-Integrität zu untersuchen. Während frühere Studien Ansätze für die Prüfung der BBB-Integrität in Embryonen und Larven skizziert haben, muss ein umfassendes Protokoll für diesen Test noch beschrieben werden5,7. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll beschreibt Methoden zur Prüfung der BBB-Integrität während der D. melanogaster embryonalen und dritten instar larval Enden.

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Protokoll

1. Entnahme von Proben

  1. Embryo-Sammlung
    1. Verwenden Sie in jedem Embryo-Entnahmekäfig mindestens 50 jungfräuliche Weibchen mit 20 bis 25 Männchen für Sammlungen. Inkubieren Sie diese Fliegen in einer Flasche mit Maismehl-Agar-Lebensmittel (Tabelle der Materialien) für 1 bis 2 Tage vor Beginn der Sammlungen23.
      HINWEIS: Es können mehr Fliegen verwendet werden, aber das Verhältnis zwischen Frau und Mann sollte bei 2:1 gehalten werden.
    2. Vorwarme Apfelsaft-Agar-Teller (Tabelle 1) bei 25 °C über Nacht.
      HINWEIS: Dies ist für die ordnungsgemäße Inszenierung von Embryonen erforderlich. Wenn Die Platten schnell austrocknen, fügen Sie eine Schüssel mit Wasser in den Inkubator, um die Feuchtigkeit der Kammer zu erhöhen.
    3. Anästhesidien fliegen ab Schritt 1.1.1 mit CO2 und übertragen Fliegen in einen Sammelkäfig. Legen Sie einen vorgewärmten Apfelsaft Agar Teller mit einem kleinen Abstrich von Hefepaste auf dem offenen Ende und sichern Sie den Käfig mit der roten Hülse (Tisch der Materialien). Um ältere Embryonen zu löschen, lassen Sie Fliegen Embryonen/Eier 1 h bei 25 °C auf einen Apfelsaft-Agarteller legen.
    4. Entfernen Sie den Sammelkäfig aus dem Inkubator. Invertieren Sie das Käfignetz seite nach unten und tippen Sie auf den Boden des Käfigs. Ersetzen Sie den Apfelsaft-Agar durch einen neuen vorgewärmten Apfelsaft-Agarteller mit einem kleinen Abstrich aus Hefepaste. Entsorgen Sie die erste Platte.
    5. Lassen Sie Fliegen Embryonen/Eier auf den neuen Apfelsaft-Agarteller legen, 1 h bei 25 °C. Entsorgen Sie diese Platte nach der 1 h-Sammlung und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, um Embryonen zur Injektion zu sammeln.
    6. Um 17-Embryon im späten Stadium (20 bis 21 h AEL) zu sammeln, lassen Sie Fliegen des gewünschten Genotyps aus den Schritten 1.1.1-1.1.5 auf eine neue vorgewärmte Apfelsaft-Agarplatte mit einem kleinen Abstrich von Hefepaste bei 25 °C für 1 h legen. , so embryonen werden 20 bis 21 h alt zum Zeitpunkt der Bildgebung.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann wie gewünscht für mehrere Runden der Probenentnahme, Injektion und Bildgebung wiederholt werden.
    7. Sammeln Sie Embryonen aus Platten zu einem Zellsieb mit 70 m Nylongewebe, indem Sie phosphatgepufferte Kochchen (PBS) mit 0,1% nichtionischem Tensid (PBTx; Tabelle 1) um die Oberfläche der Platte zu bedecken und Embryonen mit einem Pinsel von der Oberfläche zu lösen.
    8. Dechorionate Embryonen im Zellsieb in einer 50% Bleichlösung gesammelt (Tabelle 1) in einer 100 mm Petrischale für 5 min mit gelegentlicher Erregung bei Raumtemperatur. Spülen Sie Embryonen 3x, indem Sie das Zellsieb in PBTx in einer Petrischale wirbeln, wobei sie jedes Mal eine frische Schale PBTx verwenden.
    9. Wenn alle Embryonen vom richtigen Genotyp sind, fahren Sie direkt mit Schritt 1.1.10 fort. Wenn die Erzeugung von Embryonen des richtigen Genotyps ein Kreuz mit heterozygoten Fliegen erfordert, wählen Sie Embryonen des richtigen Genotyps unter Verwendung des Vorhandenseins oder Fehlens fluoreszierend markierter Balancer-Chromosomen aus. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit Fluoreszenzfunktionen für die Genotypauswahl.
      HINWEIS: Balancer-Chromosomen, die mit deformiertem-gelbem fluoreszierendem Protein gekennzeichnet sind; Kruppel-Gal4,UAS-grünes fluoreszierendes Protein (GFP); und twist-Gal4, UAS-GFP funktionieren gut für die Genotyp-Auswahl in der späten Embryogenese (Tabelle 2)24,25,26.
    10. Mit einer Glaspipette Embryonen in PBTx auf eine 2% Agarose-Gelplatte übertragen (Tabelle 1). Überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier entfernen. Richten Sie die Embryonen auf die 2% Agarose-Gelplatte mit hinterder nach rechts und dorsaler Seite nach oben aus (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Die Mikropyle, das kleine Loch, durch das Spermatozoen in das Ei gelangen, befindet sich am vorderen Ende des Embryos. Das hintere Ende ist runder. Die Luftröhre erscheint weiß und befindet sich dorsal im Embryo, so dass die Unterscheidung der dorsalen und ventralen Seiten des Embryos ermöglicht wird (Abbildung 1B).
    11. Bereiten Sie eine Folie mit einem Stück doppelseitigem Klebeband vor. Drücken Sie die Folie fest auf die Embryonen, um sie auf das doppelseitige Band zu übertragen.
    12. Entibung von Embryonen durch Inkubation bei Raumtemperatur von 25 min (es wird kein Entsatikmittel verwendet). Nach der Austrocknung Embryonen mit Halocarbonöl bedecken.
      HINWEIS: Die Austrocknungszeiten können je nach Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Belüftung im Raum variieren. Die Inkubationszeit sollte verwendet werden, um das Injektionsgerät und das konfokale Mikroskop für die Bildgebung einzurichten, wie in den Abschnitten 2 und 3 dieses Protokolls beschrieben.
  2. Larval-Sammlung
    1. Richten Sie ein Kreuz mit 5-10 jungfräulichen weiblichen Fliegen des gewünschten Genotyps und halb so vielen Männchen des gewünschten Genotyps in einer Durchstechflasche mit Maismehl-Agar-Nahrung ein und brüten bei 25 °C23.
    2. Nach 5 bis 7 Tagen, je nach Genotyp, wandernde dritte Instar Larven aus der Durchstechflasche sanft mit Zange sammeln. Spülen Sie Larven in 1x PBS, um Lebensmittel zu entfernen, die an den Larven kleben. Larven zur Genotypisierung, wie in Schritt 1.1.9 beschrieben, auf einen Apfelsaft-Agarteller übertragen.
    3. Rollen Sie Larven auf einem Gewebe mit einem Pinsel, um sie abzutrocknen. Übertragen Sie 6 x 8 Larven auf eine Folie, die mit doppelseitigem Klebeband mit Zangen vorbereitet wird.

2. Herstellung von Nadeln und Probeninjektion

  1. Ziehen Sie Nadeln auf einem Micropipette-Puller vor der Einführung dieses Protokolls. Kapillarrohre in den Nadelzieher sichern und nach der Standardnadelform und Parametern für D. melanogaster Injektionen ziehen (Tabelle 3)27. Bewahren Sie Nadeln in einer Petrischale auf, indem Sie sie in Ton verankern, bis sie zur Injektion verwendet werden.
  2. Laden Sie eine Nadel mit 5 l von 10 kDa dextran konjugiert zu Sulforhodamin 101 Säurechlorid(Materialtabelle) mit einer 20 L Gel-Ladepipettenspitze während der 25-min-Entweigungszeit für Embryonen (Schritt 1.1.12) oder unmittelbar nach der Übertragung von Larven zur Rutsche (Schritt 1.2.3).
  3. Laden Sie die Nadel in einen Nadelhalter und positionieren Sie sich in einem Mikromanipulator, der an einem Stahlsockel befestigt ist (Materialtabelle).
    HINWEIS: Die Nadel sollte für die Embryoinjektion nahezu parallel zum Mikroskopstadium sein und für Larveninjektionen leicht nach unten gewinkelt sein.
  4. Stellen Sie das Injektionsgerät (Materialtabelle) auf 50 psi, 5 x 10 ms mit einem Bereich von 10.
    HINWEIS: Es kann notwendig sein, diese Einstellungen für das verwendete Injektionsgerät zu ändern.
  5. Platzieren Sie die Folie auf der Bühne und bürsten Sie die Nadelkante gegen die Kante des doppelseitigen Bandes in einem 45°-Winkel, um eine abgewinkelte, gebrochene Spitze zu erstellen.
    HINWEIS: Für Embryonen ist es nur notwendig, die Spitze so zu brechen, dass der Fluss der 10 kDa dextran möglich ist. Eine perfekte Nadel hat eine leicht abgewinkelte Spitze und nur ein kleiner Tropfen Farbstoff wird mit jeder Injektion herauskommen. Für Larven ist es notwendig, die Spitze mehr zu brechen, aber mit einer abgewinkelten Spitze, um die Larvenkörperwand zu durchdringen. Ein größerer Tropfen Farbstoff wird herauskommen.
  6. Pumpen Sie das Fußpedal, bis sich der Farbstoff an der Spitze der Nadel befindet.
  7. Richten Sie die Nadel so aus, dass sie parallel zum Embryo ist oder leicht nach unten zur Larve abgewinkelt ist.
  8. Bewegen Sie die Nadel, um das hintere Ende der Probe zu durchstechen und injizieren Sie die Probe durch Pumpen des Fußpedals. Injizieren Sie 2 nL Farbstoff in Embryonen und 220 nL Farbstoff in Larven.
    HINWEIS: Der Embryo oder die Larve sollte mit Farbstoff überfluten, wenn die Injektion erfolgreich ist.
  9. Beachten Sie den Zeitpunkt der Injektion für Inkubationszwecke. Inkubieren Sie Embryonen für 10 min bei Raumtemperatur. Larven 30 min bei Raumtemperatur bebrüten.
  10. Fahren Sie auf der Folie fort, um zusätzliche Proben zu injizieren, wobei Sie die Injektionszeit für jede Probe notieren.
    HINWEIS: Je nach Geschwindigkeit, mit der nachfolgende Sezier- und Bildgebungsschritte durchgeführt werden können, können 4-8 Proben gleichzeitig injiziert werden.

3. Vorbereitung von Proben für die Bildgebung

  1. Bildgebung von Embryonen
    1. Bereiten Sie nach der Injektion Embryonen auf die Bildgebung vor. Tragen Sie Petroleumgelee mit einem baumwollgekippten Applikator auf der rechten und linken Seite der Proben auf der Rutsche als Abstandsraum auf, um Schäden an den Embryonen bei der Platzierung des Deckellipss zu verhindern.
    2. Bildproben mit einem konfokalen Mikroskop in der gesamten Tiefe des Embryos mit einem 20-fachen Objektiv. Berechnen Sie den Prozentsatz der Gesamtproben mit Farbstoff, der in der ventralen Nervenschnur (VNC) beobachtet wurde, mit der folgenden Gleichung: % der Proben mit kompromittiertem BBB = Anzahl der Proben mit Farbstoffakkumulation in der VNC/Gesamtanzahl der untersuchten Proben.
  2. Zerlegung und Abbildung von Larven
    1. Bereiten Sie Folien für Larvenproben im Voraus vor. Montieren Sie zwei Abdeckungen, die etwa 0,5 cm voneinander entfernt sind, um die Rutsche mit Nagellack zu halten.
      HINWEIS: Die Coverlips fungieren als Abstandshalter für das Gehirn, so dass es während des Montageprozesses nicht beschädigt wird.
    2. Nach der 30 min Inkubation sezieren Sie die Larven in 1x PBS direkt auf dem Dia, das in der Bildgebung verwendet wird. Verwenden Sie zunächst ein Zangenpaar, um die Larve auf halbem Weg nach unten im Larvenkörper zu greifen, und verwenden Sie ein zweites Zangenpaar, um die vordere und die hintere Hälfte der Larve zu trennen.
    3. Als nächstes verwenden Sie ein Paar Zangen, um den vorderen Bereich an den Mundhaken zu greifen, und verwenden Sie ein zweites Zangenpaar, um die Körperwand über der Spitze der Zange umzukehren, die die Mundhaken packt. Das Gehirn und VNC werden exponiert.
    4. Trennen Sie das Gehirn und VNC von der Körperwand, indem Sie die Nerven trennen, und entfernen Sie die Körperwand von der Folie (Abbildung 1C,D). Entfernen Sie imaginäre Scheiben, falls gewünscht.
    5. Bedecken Sie die Probe mit 10 l 80 % Glycerin und legen Sie einen Deckelschlupf zur Bildgebung auf die Probe.
    6. Bild durch die Tiefe des Nervensystems Gewebe mit einem 20x Objektiv. Berechnen Sie den Prozentsatz der Gesamtproben mit Farbstoff, der im VNC beobachtet wurde.

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Ergebnisse

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die Visualisierung der Integrität des BBB im gesamten ZNS in D. melanogaster Embryonen und Larven (Abbildung 1). Nach Abschluss der BBB-Bildung in der späten Embryogenese funktioniert das BBB, um große Moleküle aus dem Gehirn und VNC5auszuschließen. Dieses Protokoll nutzt diese Funktion, um die BBB-Bildung zu assayen. Als Wildtyp (Oregon R) spätes Stadium 17 (20-21 h alt) Embryonen mit 10 kDa Dextran konjugie...

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Diskussion

Dieses Protokoll enthält eine umfassende Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um die BBB-Integrität während der späten embryonalen und dritten instar larvalen Stadien der D. melanogaster Entwicklung zu assay. Ähnliche Ansätze wurden an anderer Stelle beschrieben, um die Integrität des BBB während der Entwicklung sowie in erwachsenen Stadien5,7,29,30zu bewerten. Die...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. F. Bryan Pickett und Dr. Rodney Dale für die Verwendung von Injektionsgeräten. Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder von der Loyola University Chicago an M.D., D.T. und J.J. finanziert.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) DextranThermoFisher ScientificD1863Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette TipsEppendorf22351656
100% Ethanol (200 proof)Pharmco-Aaper11000200
Active Dry YeastRed Star
AgarFisher ScientificBP1423
AgaroseFisher ScientificBP160-500
Air CompressorDeWaltD55140
Apple JuiceMott's Natural Apple Juice
BleachHousehold Bleach1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-4
Bottle PlugsFisher ScientificAS-277
Cell StrainersBD Falcon352350
Confocal MicroscopeOlympusFV1000Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped ApplicatorPuritan19-062614
Double-Sided Tape 1/2"Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm TipRobozRS-5015
Fly Food BottlesFisher ScientificAS-355
Fly Food VialsFisher ScientificAS-515
Foot PedalTreadlite IIT-91-S
Gel CasterBio-Rad1704422
Gel TrayBio-Rad1704436
Glass PipetteVWR14673-010
GlycerolFisher ScientificBP229-1
Granulated sugarPurchased from grocery store.
Halocarbon OilLab Scientific, Inc.FLY-7000
Light SourceSchottAce I
Manipulator StandWorld Precision InstrumentsM10
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsKITE-R
Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
Needle HolderWorld Precision InstrumentsMPH310
Nightsea Filter SetsElectron Microscopy ScienceSFA-LFS-CYFor visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light HeadElectron Microscopy ScienceSFA-RBFor visualization of GFP
PaintbrushSimply SimmonsChisel Blender #6
PipetterFisher Scientific13-683C
Pneumatic PumpWorld Precision InstrumentsPV830This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium ChlorideFisher ScientificBP366-500
Potassium Phosphate DibasicFisher ScientificBP363-500
Small Embryo Collection CagesGenesee Scientific59-100
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-212
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Steel Base PlateWorld Precision Instruments5052
StereomicroscopeCarl ZeissStemi 2000Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light sourceBaytronixUsed for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)Genesee Scientific20-258
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500Nonionic surfactant
Vial PlugsFisher ScientificAS-273

Referenzen

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