Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein motorbetriebenes zentrifugales mikrofluidisches Gerät, das Zellsphäride kultivieren kann. Mit diesem Gerät können Sphäroide von einzelnen oder mehreren Zelltypen leicht unter hohen Schwerkraftbedingungen kokultiviert werden.

Zusammenfassung

Eine dreidimensionale sphäroide Zellkultur kann in Zellexperimenten nützlichere Ergebnisse erzielen, da sie Zellmikroumgebungen des lebenden Körpers besser simulieren kann als zweidimensionale Zellkulturen. In dieser Studie haben wir eine elektrische motorgesteuerte Lab-on-a-CD-Plattform (Compact Disc) hergestellt, ein so genanntes zentrifugales mikrofluidisches Sphäroid-basiertesphärisches Sphäroid (CMS)-Kultursystem, um dreidimensionale (3D) Zellsphäride zu erstellen, die eine hohe Zentrifugalkraft implementieren. Dieses Gerät kann die Drehzahlen variieren, um Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gzu erzeugen. Das CMS-System hat einen Durchmesser von 6 cm, hat hundert 400 m Mikroschäbe und wird durch Formen mit Polydimethylsiloxan in einer Polycarbonatform hergestellt, die von einer numerischen Computersteuerungsmaschine vorgefertigt wurde. Eine Barrierewand am Kanaleingang des CMS-Systems nutzt Fliehkraft, um Zellen gleichmäßig im Chip zu verteilen. Am Ende des Kanals befindet sich ein Diabereich, der es den Zellen ermöglicht, in die Mikrobrunnen einzudringen. Als Demonstration wurden Sphäroide durch Monokultur und Kokultur menschlicher, aus Fettgewonnener Stammzellen und menschlicher Lungenfibroblasten unter Hochgravitationsbedingungen mit Hilfe des Systems erzeugt. Das CMS-System verwendete ein einfaches Betriebsschema, um Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturen von Konzentrisch, Janus und Sandwich zu produzieren. Das CMS-System wird in Zellbiologie- und Gewebe-Engineering-Studien nützlich sein, die Sphäroide und organoide Kultur von einzelnen oder mehreren Zelltypen erfordern.

Einleitung

Es ist einfacher, biologische In-vivo-Mikroumgebungen mit dreidimensionaler (3D) Sphäroid-Zellkultur zu simulieren als mit zweidimensionaler (2D) Zellkultur (z. B. konventionelle Petrischalenzellkultur), um physiologisch realistischere experimentelle Ergebnisse¹. Derzeit verfügbare Sphäroid-Bildungsmethoden umfassen die Hängetropfentechnik², Flüssigkeits-Overlay-Technik³, Carboxymethyl-Zellulose-Technik⁴, magnetische kraftbasierte mikrofluidische Technik⁵, und die Verwendung von Bioreaktoren⁶. Obwohl jede Methode ihre eigenen Vorteile hat, ist eine weitere Verbesserung der Reproduzierbarkeit, Produktivität und Erzeugung von Cokultursphäroiden erforderlich. Während beispielsweise die magnetkraftbasierte mikrofluidische Technik⁵ relativ kostengünstig ist, müssen die Auswirkungen starker Magnetfelder auf lebende Zellen sorgfältig geprüft werden. Die Vorteile der Sphäroidkultur, insbesondere bei der Untersuchung der mesenchymalen Stammzelldifferenzierung und -proliferation, wurden in mehreren Studien^7,8,9berichtet.

Das zentrifugale mikrofluidische System, auch Lab-on-a-CD (Compact Disc) genannt, ist nützlich, um die Flüssigkeit im Inneren leicht zu steuern und die Rotation des Substrats zu nutzen und wurde daher in biomedizinischen Anwendungen wie Immunoassays¹⁰eingesetzt. kolorimetrische Assays zum Nachweis biochemischer Marker¹¹, Nukleinsäure-Amplifikation (PCR) Assays, automatisierte Blutanalysesysteme¹²und All-in-One-Zentrifugal-Mikrofluidika¹³. Die treibende Kraft, die die Flüssigkeit steuert, ist die Zentripetalkraft, die durch Rotation entsteht. Darüber hinaus können mehrere Funktionen des Mischens, Valvings und Sample-Splittings einfach in dieser einzigen CD-Plattform durchgeführt werden. Im Vergleich zu den oben genannten biochemischen Analysemethoden gab es jedoch weniger Versuche, CD-Plattformen auf Kulturzellen anzuwenden, insbesondere Sphäroide¹⁴.

In dieser Studie zeigen wir die Leistungsfähigkeit des zentrifugalen mikrofluidischen Sphäroid-basierten Sphäroid-Systems (CMS) durch Monokultur oder Kokultur von humanen Adipose-abgeleiteten Stammzellen (hASC) und menschlichen Lungenfibroblasten (MRC-5). In diesem Beitrag wird die Forschungsmethodik unserer Gruppe ausführlich beschrieben¹⁵. So kann die Sphäroid-Kultur-Lab-on-a-CD-Plattform einfach reproduziert werden. Ein CMS-Erzeugungssystem bestehend aus einem CMS-Kulturchip, einem Chiphalter, einem Gleichstrommotor, einer Motorhalterung und einer rotierenden Plattform wird vorgestellt. Die Motorhalterung ist 3D mit Acrylnitril Butadien-Styrol (ABS) bedruckt. Der Chiphalter und die rotierende Plattform sind CNC (Computer numerische Steuerung) mit dem PC (Polycarbonat) bearbeitet. Die Drehzahl des Motors wird von 200 bis 4.500 Umdrehungen pro Minute durch Kodierung eines PID-Algorithmus (proportional-integral-derivative) auf Basis der Pulsweitenmodulation gesteuert. Seine Abmessungen sind 100 mm x 100 mm x 150 mm und wiegt 860 g, so dass es einfach zu handhaben. Mit dem CMS-System können Sphäroide unter verschiedenen Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gerzeugt werden, so dass die Untersuchung der Zelldifferenzierungsförderung unter hoher Schwerkraft von den 2D-Zellen^16,17 bis 3D erweitert werden kann. Sphäroid. Kokultur verschiedener Zelltypen ist auch eine Schlüsseltechnologie, um die in vivo-Umgebung effektiv nachzuahmen¹⁸. Das CMS-System kann problemlos Monokultur-Sphäroide sowie Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturtypen (z. B. konzentrisch, Janus und Sandwich) erzeugen. Das CMS-System kann nicht nur in einfachen Sphäroidstudien, sondern auch in 3D-Organoidstudien genutzt werden, um menschliche Organstrukturen zu berücksichtigen.

Protokoll

1. Zentrifugal mikrofluidische Basis Sphäroid (CMS) Kultur Chip Herstellung

1. Machen Sie PC-Formen für die oberen und unteren Schichten des CMS-Kulturchips durch CNC-Bearbeitung. Detaillierte Abmessungen des Chips sind in Abbildung 1angegeben.
2. Mischen Sie PDMS-Basis und PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 (w/w) für 5 min und legen Sie sie in einen Trockengrund für 1 h, um Luftblasen zu entfernen.
3. Nachdem Sie das PDMS-Gemisch in die Formen des CMS-Kulturchips gegossen haben, entfernen Sie Luftblasen für 1 h mehr und härten Sie in einer Wärmekammer bei 80 °C für 2 h aus.
4. Legen Sie sie in den gesaugten Plasmareiniger mit den zu verklebenden Oberflächen nach oben und setzen Sie sie mit einer Leistung von 18 W für 30 s luftunterstütztem Plasma aus.
5. Die beiden Schichten des CMS-Kulturchips verkleben und 30 min bei 80 °C in die Wärmekammer legen, um die Haftfestigkeit zu erhöhen.
6. Sterilisieren Sie den CMS-Kulturchip in einem Autoklavensterilisator bei 121 °C und 15 psi.

2. Zellvorbereitung

1. Die 1 ml der Durchstechflasche mit 5 x 10⁵x 1 x 10⁶ hASCs oder MRC-5s-Zellen in einem Wasserbad bei 36,5 °C für 2 min auftauen.
2. Fügen Sie 1 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) in eine Durchstechflasche und mischen Sie sie vorsichtig mit einer 1.000 L Pipette.
3. 15 ml des DMEM auf 36,5 °C in eine Petrischale mit 150 mm Durchmesser mit einer Pipette geben und die Zellen aus der Durchstechflasche hinzufügen.
4. Nach 1 Tag die DMEM ansaugen und durch 15 ml frischeDMEM ersetzen. Wechseln Sie anschließend alle 2 oder 3 Tage die Medien.
5. Um die Zellen von der Petrischale zu lösen, fügen Sie 4 ml Trypsin in die Petrischalen ein und legen Sie sie in einen Inkubator bei 36,5 °C und 5%_CO2 für 4 min.

3. Monokultur Sphäroidbildung

1. Legen Sie 2,5 ml 4% (w/v) pluronische F-127-Lösung in das Einlassloch des CMS-Kulturchips (Abbildung 2A) und drehen Sie den Chip bei 500–1.000 U/min und drehen Sie den Chip dann mit 3 min mit dem CMS-System um 4.000 U/min (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Die pluronische Beschichtung verhindert die Zellbefestigung am Einlassanschluss, während sich der Chip dreht. Stellen Sie sicher, dass die Luft nicht in den Mikrobrunnen eingeschlossen ist.
2. Inkubieren Sie den cmS-Kulturchip, der über Nacht bei 36,5 °C in 5%_CO2mit pluronischer Lösung gefüllt ist.
3. Entfernen Sie die pluronische Lösung, waschen Sie die verbleibende pluronische Lösung mit DMEM aus und trocknen Sie den Chip für 12 h auf einer sauberen Bank.
4. Fügen Sie dem CMS-Kulturchip 2,5 ml DMEM hinzu und drehen Sie den Chip um 3 min für 3 min, um die Innenseite des Chips vorzuvernetzen.
5. Stoppen Sie die Drehung und ziehen Sie 100 l DMEM heraus, um Platz für die Injektion der Zellsuspension zu schaffen.
6. Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die entweder 5 x 10⁵ hASCs oder 8 x 10⁵ MRC-5s enthalten, indem Sie die Zellen gleichmäßig verteilen, indem sie 3–5x zur Resuspension pipetieren.
7. Drehen Sie den Chip bei 3.000 U/min für 3 min, um Zellen in jedem Mikrobrunnen durch Zentrifugalkraft einzufangen.
   HINWEIS: Übermäßige Rotationsgeschwindigkeit kann zu Zellaustritt enden durch Lösungsauswurflöcher.
8. Kultur die Zellen für 3 Tage im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%_CO2,rotieren d.h. bei 1.000–2.000 U/min. Ändern Sie Kulturmedium jeden Tag.

4. Coculture Sphäroidbildung

1. Konzentrische Sphäroide Bildung
   1. Fügen Sie die ersten Zellen, 2,5 x 10⁵ hASCs, und drehen Sie den Chip bei 3.000 U/min. Nach 3 min fügen Sie die zweiten Zellen, 4 x 10⁵ MRC-5s, hinzu und drehen Sie den Chip bei 3.000 U/min für 3 min. Injizieren Sie insgesamt 100 l Zellsuspensionen durch Pipetten. Wenn die Zellen injiziert werden, verschieben Sie die Rotationsgeschwindigkeit auf 500-1.000 Rpm.
   2. Kultur die Zellen im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit% und 5%_CO2 durch Drehen bei 1.000–2.000 U/min. Die konzentrischen Sphäroide werden innerhalb von 24 h erstellt. Für eine langfristige Kultur, ändern Sie das Kulturmedium jeden Tag.
2. Janus Sphäroid-Formation
   1. Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die ersten Zellen enthalten, 2,5 x 10⁵ hASCs, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.
   2. Inkubieren Sie den Chip bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%_CO2, indem Sie bei 1.000–2.000 U/min für 3 h rotieren.
   3. Fügen Sie 100 l der Zellsuspensionen hinzu, die den zweiten Satz von Zellen, 4 x 10⁵ MRC-5s, enthalten, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.
   4. Kultur die Zellen im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%_CO2 durch Drehen bei 1.000–2.000 U/min. Die Janus Sphäroide werden innerhalb von 24 h erstellt. Für eine langfristige Kultur, ändern Sie das Kulturmedium jeden Tag.
3. Sandwich-Sphäroid-Formation
   1. Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die ersten Zellen enthalten, 1,5 x 10⁵ hASCs, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.
   2. Inkubieren Sie den Chip bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%_CO2, indem Sie bei 1.000–2.000 U/min für 3 h rotieren.
   3. Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die zweiten Zellen enthalten, 3 x 10⁵ MRC-5s, durch Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.
   4. Inkubieren Sie den Chip bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit% und 5%_CO2, indem Sie bei 1.000–2.000 U/min für 3 h rotieren.
   5. Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die dritten Zellen enthalten, 1,5 x 10⁵ hASCs, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.
   6. Kultur die Zellen im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit% und 5%_CO2 durch Drehen bei 1.000–2.000 U/min. Die Sandwich-Sphäroide werden innerhalb von 12 h erstellt. Für eine langfristige Kultur, ändern Sie das Kulturmedium jeden Tag.

5. Zellfärbung

1. Erwärmen Sie den Zellfluoreszenzfarbstoff auf Raumtemperatur (20 °C).
2. Fügen Sie 20 l wasserfreies Dimethylsulfoxid (DMSO) pro Durchstechflasche hinzu, um eine 1 mM-Lösung herzustellen.
3. Verdünnen Sie die Fluoreszenz mit DMEM auf eine Endarbeitskonzentration von 1 m.
4. Fügen Sie die Fluoreszenz in die Zellsuspension und setzen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette wieder auf.
5. 20 min bei 36,5 °C inkubieren, Luftfeuchtigkeit von >95% und 5%_CO2.

Ergebnisse

Der CMS-Kulturchip mit einem Durchmesser von 6 cm (Abbildung 2) wurde erfolgreich nach dem obigen Protokoll hergestellt. Zunächst wurde der Chip getrennt von einer oberen und einer unteren Schicht hergestellt und dann durch Plasmabindung miteinander verbunden. Die resultierenden Sphäroide können leicht durch Lösen des Chips gesammelt werden. Der Kanal des CMS-Kulturchips besteht aus einem Einlassanschluss und zentralen, gleitenden und Microwell-Regionen (Abbildung 3<...

Diskussion

Das CMS ist ein geschlossenes System, bei dem alle injizierten Zellen ohne Abfall in den Mikrobrunnen gelangen, was es effizienter und wirtschaftlicher macht als herkömmliche mikrowellbasierte Sphäroid-Erzeugungsmethoden. Im CMS-System wird das Medium alle 12–24 h durch ein Saugloch ersetzt, das entwickelt wurde, um die Medien im Chip zu entfernen (Abbildung 3A). Während des Mediensaugvorgangs entweicht kaum ein Medium aus dem Inneren des Mikrobrunnens aufgrund der Oberflächenspannung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Cubicon	3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)	ATCC	PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
DC motor	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020	Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	Surface Treated
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC)	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsin	Gibco	12604021