Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Zusammenfassung

Ubiquitin (ub) und ubiquitin-like (ubl) abhängige posttranslationale Modifikationen von Proteinen spielen grundlegende biologische regulatorische Rollen innerhalb der Zelle, indem sie Proteinstabilität, Aktivität, Wechselwirkungen und intrazelluläre Lokalisation kontrollieren. Sie ermöglichen es der Zelle, auf Signale zu reagieren und sich an Veränderungen in ihrer Umgebung anzupassen. Veränderungen innerhalb dieser Mechanismen können zu schweren pathologischen Situationen wie neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs führen. Ziel der hier beschriebenen Technik ist es, ub/ubls abhängige PTMs-Profile schnell und genau aus kultivierten Zelllinien zu erstellen. Der Vergleich verschiedener Profile, die unter verschiedenen Bedingungen gewonnen werden, ermöglicht die Identifizierung spezifischer Veränderungen, wie sie z. B. durch eine Behandlung induziert werden. Lentivirale, vermittelte Zelltransduktion wird durchgeführt, um stabile Zelllinien zu erzeugen, die eine Zwei-Tags-Version (6His und Flag) des Modifikators (Ubiquitin oder ein Ubl wie SUMO1 oder Nedd8) exdrücken. Diese Tags ermöglichen die Reinigung von Ubiquitin und damit von ubiquitinierten Proteinen aus den Zellen. Dies geschieht durch einen zweistufigen Reinigungsprozess: Der erste wird unter Denaturierung von Bedingungen mit dem 6His-Tag und der zweite unter systemeigenen Bedingungen mit dem Flag-Tag durchgeführt. Dies führt zu einer hochspezifischen und reinen Isolierung modifizierter Proteine, die anschließend durch Flüssigchromatographie identifiziert und halbquantifiziert werden, gefolgt von der Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Technologie. Die einfache informatierte Analyse von MS-Daten mit Excel-Software ermöglicht die Erstellung von PTM-Profilen durch eliminierung von Hintergrundsignalen. Diese Profile werden zwischen den einzelnen Bedingungen verglichen, um spezifische Veränderungen zu identifizieren, die dann genauer untersucht werden, beginnend mit ihrer Validierung durch Standard-Biochemie-Techniken.

Einleitung

Die hier vorgeschlagene Methode ist der Untersuchung von PTMs gewidmet, die von Ubiquitin-Familienmitgliedern aus kultivierten Säugetierzellen vermittelt werden, um potenzielle Veränderungen im Zusammenhang mit einer bestimmten Erkrankung (Behandlung, Differenzierung usw.) zu identifizieren. PTM stellen den letzten Schritt der Regulierung der Proteinfunktionen^{dar 1}. In der Tat, einmal von der translationalen Maschinerie produziert, die meisten, wenn nicht alle Proteine unterziehen verschiedene Arten von PTMs, die ihre Aktivität, molekulare Wechselwirkungen und intrazelluläre Lage^{modulieren 1}. Zu den vielen PTMs gehören die, die von der Ubiquitin-Familie von Proteinen vermittelt werden, Ubiquitin selbst und alle Ubiquitin-Likes, haben das Potenzial, alle intrazellulären oder teilweise zytoplasmatischen Proteine zu regulieren². Da sie selbst Proteine sind, können sie miteinander konjugiert werden und homogene und heterogene Ketten unterschiedlicher Topologien bilden, die jeweils mit spezifischen regulatorischen Funktionen verbunden sind². Werkzeuge werden benötigt, um zu versuchen, diese komplexe Maschinerie zu entschlüsseln und zu verstehen. Viele Ansätze wurden weltweit entwickelt, mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen, und hier schlagen wir einen mit hoher Leistung für kultivierte Zellen vor.

Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihre Genauigkeit. Tatsächlich wird die Reinheit isolierter modifizierter Proteine durch die kombinatorische Verwendung der beiden Tags (6His und Flag) und das Zwei-Stufen-Verfahren erheblich verbessert und ist daher viel selektiver als eine Single-Tag-Fusion Ub/Ubl^3,4. Das Vorhandensein des 6His-Tags ermöglicht einen ersten Schritt der Reinigung in einem vollständig denaturierenden Zustand, wodurch jede Ko-Reinigung von Proteinen, die Ubiquitin-bindende Domänen oder andere Proteine enthalten, die an die ubiquitinierten binden, vermieden wird. Dies ist ein technisches Problem, auf das mehrere andere Ansätze stoßen, die auf der Affinitätsreinigung ubiquitinierter Proteome basieren, die entweder spezifische Antikörper⁵ oder Tandem-Ubiquitin-Bindungselemente (TUBEs)⁶verwenden. Wichtig ist, dass diese Technik nicht zugunsten der Reinigung einer bestimmten Art von Ubiquitination voreingenommen ist, da es bei einigen anderen Ansätzen der Fall sein könnte, da sowohl Mono- als auch verschiedene Arten von Polyubiquitinationen identifiziert wurden⁷. Folglich muss, sobald eine Veränderung der Ubiquitination gefunden wurde, durch biochemische Standardansätze genauer untersucht werden, um die genaue Art der Ubiquitination zu ermitteln.

Ein weiterer technischer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Lentiviren, die leicht und schnell stabile zelllösende Zelllinien mit einem angemessenen Ausdrucksgrad des markierten Modifizierers erzeugen, ohne das normale Zellverhalten zu stören.

Während eine wichtige Rolle der Ubiquitination darin besteht, Proteine auf den proteasomalen Abbau auszurichten, ist es inzwischen bekannt, dass sie viele andere regulatorische Eigenschaften für potenziell die meisten intrazellulären oder teilweise intrazellulären Proteine hat¹. Die Anzahl dieser Funktionen wird durch die Existenz vieler Ubiquitin-ähnlicher Proteine noch verstärkt, wodurch eine Familie von Proteinen gebildet wird, die fast jeden Zellmechanismus regulieren¹. Ihre Veränderungen können drastische Auswirkungen auf die Zellbiologie haben und können zu pathologischen Situationen führen oder daran teilnehmen⁸, wie Krebs⁹. Daher sind Werkzeuge erforderlich, um diese weite Landschaft zu erforschen und die Veränderungen zu identifizieren, die mit einem pathologischen Zustand verbunden sind, der als neuartige therapeutische Ziele dienen könnte.

Dieses Protokoll ist Zellen in der Kultur gewidmet, da sie transduziert werden müssen, um exogene markierte Ub/Ubl auszudrücken. Nach der Erstellung können diese stabilen Zelllinien verwendet werden, um Ubl-Profile aus Kultur in 2D- oder 3D- oder Xenografts zu generieren und so den Horizont der verschiedenen experimentellen Modelle zu erweitern, die zum Studium von PTMs-Profilen angewendet werden können.

Protokoll

1. Erzeugung stabiler Zelllinien, die 6His-Flag-Ubl exdrücken

HINWEIS: Ko-Transfektion von HEK-293T-Zellen mit pCCL-6HF-Ubl, pVSVG und Delta-Helper.

1. Tag 0: Samen 293T Zellen in einer 6-Well-Platte, um 50-70% Zusammenfluss am Tag danach zu erhalten.
2. Tag 1: Ko-Transfekte 50-70% konfluente Zellen mit einer Mischung aus 1 g pCCL-6HF-Ubl oder pCCL-GFP, 1 g pVSVG und 1 g Delta-Helper-Vektoren unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes und eines Protokolls für die Lentivirus-Produktion. Nach 6 h Transfektion das Medium in ein frisches zu verändern, das den zu transduzierenden Zellen entspricht. Säen Sie die Zellen, die in einer 6-Well-Platte transduziert werden sollen, um einen 10-20% Zusammenfluss am Tag danach zu erhalten (der Tag des Beginns der Transduktion).
3. Tag 2: 24 h nach der Transfektion, das Medium mit lentiviralen Partikeln und Filter mit 0,45 m Filtern wiederherstellen. Fügen Sie bei Bedarf an dieser Stelle frisches Medium hinzu, um eine zweite Charge von Lentiviren herzustellen. Ersetzen Sie das Medium der zu transduzierenden Zellen (10-20% Zusammenfluss) durch das Medium, das Lentiviren enthält.
   HINWEIS: Das Lentivirale Medium kann mehrere Tage vor der Transduktion bei +4 °C aufbewahrt oder monatelang bei -80 °C gelagert werden.
4. Inkubieren Sie die Zellen mit Lentiviren zwischen 24 h und 72 h in einem Standard-Inkubator (37 °C, 5%_CO2), und wechseln Sie dann das Medium für frische Standard-Inkubator. Wenn möglich, überprüfen Sie die GFP-Expression mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, um die Effizienz der Transduktion zu bewerten: Prozentsatz der exlomitierenden Zellen und relativer Expressionsgrad pro Zelle. Wenn keine Fluoreszenz erkannt wird, warten Sie auf weitere 2-3 Tage, da die Expression je nach Zelltyp länger dauern kann.
5. Wenn die GFP-Kontrolle positiv ist, wachsen alle Zellen, bis sie genug haben, um eine Expressionskontrolle von 6HF-Ubl durch Immunfluoreszenz und Western Blot mit Anti-Flag-Antikörper durchzuführen.

2. Doppelte Reinigung modifizierter Proteine

HINWEIS: Puffer 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8,0, 0,5% Triton X-100.
Puffer 2: 50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Glycerin, pH 8.0.
Puffer 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8.0.

1. Zelllyse: Nach der Bereitenise Kulturgeschirr mindestens einmal mit phosphatgepufferter Saline (PBS) bei Raumtemperatur (RT) waschen und zur Zelllyse oder alternativ zum Blitzeinfrieren in Flüssigkeit N₂ führen und bei -80 °C lagern. Für die Lyse 2 ml Puffer 1 pro 15 cm Schale bei RT hinzufügen. Verwenden Sie einen Zellschaber, um alle Lysate in 50 ml konischen Zentrifugenrohren (Endvolumen ca. 20 ml) zurückzugewinnen.
2. Beschallen Sie die Lysate dreimal für 30 s durch eine 1 min Pause getrennt.
3. Zentrifugieren Sie die beschallten Lysate bei 15.000 x g für 15 min.
4. Übertragen Sie den Überstand mit einem Zellsieb (40 m) in ein neues Rohr.
5. Bestimmen Sie die Konzentration der Proben und passen Sie bei Bedarf die gleiche Menge an Proteinen und das gleiche Volumen an. Verwenden Sie eine Gesamtmenge an Protein zwischen 50 und 100 mg (10 Gerichte mit 15 cm Durchmesser für MiaPaCa-2 Zellen).
6. Fügen Sie Ni²⁺-NTA Perlen, mit 2 l Perlen pro 1 mg Protein.
7. Drehen Sie bei 30 Rpm während 2,5 h bei RT.
8. Pellet die Perlen bei 500 x g für 5 min.
9. Waschen Sie die Perlen mit 1 ml Puffer 1, übertragen Sie die Proben in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, und übertragen Sie dann die Rohre auf Eis. Führen Sie alle nächsten Schritte auf Eis oder bei 4 °C aus.
10. Zweimal mit 1 ml eiskaltem Puffer 2 mit 10 mM Imidazol waschen.
11. Um gebundene Proteine zu elute gebunden, fügen Sie 600 l Puffer 2 mit 250 mM Imidazol hinzu und drehen Sie 2 h bei 4 °C.
12. Pellet die Perlen durch Zentrifugation bei 500 x g für 1 min. Übertragen Sie die Unterranten auf neue, vorgekühlte, 1,5 ml Rohre und fügen Sie 50 l Anti-Flag M2 Antikörper konjugierte Perlen hinzu.
13. Drehen Sie bei 30 Rprossen für 2,5 h bei 4 °C, dann waschen Sie 2 mal mit 500 l Puffer 2, dann 2 mal mit 500 l Puffer 3.
14. Für die endende Elution 100 l Puffer 3 hinzufügen, der ein Flag-Peptid bei 0,1 g/l enthält, und bei 4 °C für 1,5 h drehen.
15. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 1 min und übertragen Sie die Unterräuer in neue vorgekühlte Rohre.
16. Nehmen Sie 10% (10 l), um Auf SDS-PAGE zu laden und führen Sie eine Silberfärbung des Gels durch, um die Reinigungsqualität zu kontrollieren. Wenn die Reinigung gut aussieht, analysieren Sie die 90 %, die von LC-MS/MS übrig bleiben.

3. Verarbeitung von Massenspektrometriedaten zur Generierung von Profilen von Ub/Ubls PTMs und zur Ermittlung signifikanter Unterschiede zwischen ihnen

HINWEIS: Die Ergebnisse der MS-Analyse enthalten viele Informationen, einschließlich der Gesamtzahl der Peptide sowie der Spitzenflächenwerte (Mittelwert der TOP 3-Peptidfläche¹⁰) für jedes in jeder Probe identifizierte Protein. Diese Daten können entweder mit den Peptidanzahlnummern oder den Spitzenflächenwerten oder beidem verarbeitet werden. Für die Berechnung mit Spitzenflächen, da diese Werte in der Regel im Bereich von 10⁶liegen, ist es notwendig, sie durch diese Reihenfolge zu dividieren, bevor die gleichen Formeln wie unten angewendet werden. Die Ergebnisse, die mit beiden Methoden der Zählung erzielt wurden, sollten eine starke Korrelation aufweisen, wie es normalerweise der Fall ist. Verwenden Sie für jedes identifizierte Protein die folgenden Formeln:
v1 Peptide Werte in nicht behandelter Ubiquitin-Probe (z. B. Ub-Medikament)
v2-Peptide-Werte in Gemcitabin behandelter Ubiquitin-Probe (z. B. Ub + Medikament)
k1 Peptide Werte in nicht behandelter GFP-Probe (z.B. GFP - Medikament)
k2-Peptide-Werte in der von Gemcitabin behandelten GFP-Probe (z. B. GFP + Medikament).

1. Normalisierung: Normalisieren Sie die Werte zwischen medikamentös behandelten Zellen und unbehandelten Zellen für Ubiquitin und GFP mit den folgenden Formeln. Normalisiert v = V und normalisiert k = K.
   V1=v1. (-v1+ -v2) / (2. V1) ; V2=v2. (-v1+ -v2) / (2. V2)
   K1=k1. (-k1+ k2) / (2. K1) ; K2=k2. k1+ k2/ (2. k2)
2. Entfernung des Hintergrunds: Subtrahieren Sie anhand der folgenden Formeln Werte in der Kontrollprobe (GFP) von den Werten in der Ubiquitin-Probe, um spezifische Werte (V'1 und V'2) für jedes identifizierte Protein unter beiden Bedingungen zu erhalten.
   V'1=V1-K1, wenn V1-K1-0 ; V'1=0, wenn V1-K1<0
   V'2=V2-K2, wenn V2-K2-0 ; V'2 =0 wenn V2-K2<0
3. Variation (Var) der Ubiquitination. Um einen Wert (zwischen -100 und +100) für positive und negative Schwankungen von PTM zu erhalten, die durch ein Medikament induziert werden, verwenden Sie die folgende Formel, in der die Differenz zwischen bestimmten Werten der behandelten und der unbehandelten Proben durch die Summe aller Werte, einschließlich der (um Proteine zu bestrafen, die auch in kontrollierbarer GFP identifiziert wurden), und multiplizieren Sie mit 100.
   Var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100 ; -100Abweichungen unter -50 (Repression von PTM) oder über 50 (Induktion von PTM) werden in der Regel als signifikant angesehen.
4. Vertrauen (Conf). Verwenden Sie die folgende Formel, um einen Konfidenzwert zwischen 0 und 100 % zu erhalten:
   Conf = ((V1+V2)²/(1+V1+V2+K1+K2)²)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; =0, wenn <0
   Werte über 50 gelten in der Regel als zuversichtlich.
5. Um eine schönere Verteilung der Induktions-/Repressionswerte zu erhalten und sowohl Variations- als auch Konfidenzparameter zu berücksichtigen, multiplizieren Sie Var- und Conf-Werte mit der folgenden Formel, wobei V Var und C
   =SI(V2>0;((V2*C2)-2)/(10-6);-(V2*C2)-2)/(10-6))
   HINWEIS: Da Spitzenflächenwerte in der Regel genauer sind als Peptidzählung, ist es möglich, spezifische Software zu verwenden, die der Interpretation dieser Art von Daten wie Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus) gewidmet ist, Nutzungsempfehlungen.

Ergebnisse

Transduktion von Kultur-Säugetierzellen zur Erzeugung von GFP- und 6HF-Ub-exemitten Zellen
Zur Herstellung von Lentiviren, die später zur Transduce von MiaPaCa-2-Zellen verwendet werden, werden 70% konfluente HEK-293T-Zellen mit einer gleichen Menge der drei Vektoren, pCCL-6HF-Ubiquitin oder GFP/Delta-Helper/pvSvG, kotransfiziert. Nach 24 h Produktion wird das Medium, das lentivirale Partikel enthält, zurückgewonnen und gefiltert. An dieser Stelle ist es möglich, ...

Diskussion

Wir haben eine robuste und zuverlässige Methodik entwickelt, um Profile von Proteinen zu generieren, die von den wichtigsten Ubiquitin-Familienmitgliedern modifiziert wurden. In der Tat haben wir dieses Protokoll erfolgreich angewendet, um Profile von PTMs durch Ubiquitin, aber auch durch SUMO und Nedd8 zu generieren und Veränderungen im Zusammenhang mit einer Behandlung zu erkennen⁷, als Reaktion auf die Überexpression oder den Knockdown eines bestimmten Gens (Daten nicht und in Zellen, die ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag