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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein 3D-Human-Human-Extrazellmatrix-Adipozyten-In-vitro-Kultursystem, das die Zerlegung der Rollen der Matrix und der Adipozyten bei der Kodipierung des metabolischen Phänotyps des Fettgewebes ermöglicht.

Zusammenfassung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Gewebehomöostase, die Einbeziehung in Crosstalk mit Zellen und die Regulierung mehrerer Aspekte der zellulären Funktion. Das ECM spielt eine besonders wichtige Rolle bei der Fettgewebefunktion bei Adipositas, und Veränderungen im Fettgewebe ECM Ablagerung und Zusammensetzung sind mit Stoffwechselerkrankungen bei Mäusen und Menschen verbunden. Tractable In-vitro-Modelle, die eine Zerlegung der Rolle des ECM und der Zellen bei der Beteiligung am globalen Gewebephänotyp ermöglichen, sind spärlich. Wir beschreiben ein neuartiges 3D-In-vitro-Modell der humanen ECM-Adipozytenkultur, das die Untersuchung der spezifischen Rollen des ECM und der Adipozyten bei der Regulierung des metabolischen Phänotyps des Fettgewebes ermöglicht. Das menschliche Fettgewebe wird dezellularisiert, um ECM zu isolieren, das anschließend mit Präsipozyten wieder aufgefüllt wird, die dann innerhalb des ECM zu reifen Adipozyten differenziert werden. Diese Methode erstellt ECM-Adipozytenkonstrukte, die metabolisch aktiv sind und Eigenschaften der Gewebe und Patienten, von denen sie abgeleitet werden, beibehalten. Wir haben dieses System verwendet, um krankheitsspezifische ECM-Adipozyten-Überlauf im menschlichen Fettgewebe nachzuweisen. Dieses Kulturmodell bietet ein Werkzeug zur Zersebung der Rolle des ECM und der Adipozyten bei der Teilnahme am globalen metabolischen Fettgewebe-Phänotyp und ermöglicht die Untersuchung der Rolle des ECM bei der Regulierung der Fettgewebehomöostase.

Einleitung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) stellt nicht nur ein mechanisches Gerüst für Gewebe bereit, sondern greift auch in komplexe Übersprachen mit Zellen ein, die sich in ihr befinden, und reguliert verschiedene Prozesse, die für die Gewebehomöostase notwendig sind, einschließlich der Zellproliferation, Differenzierung, Signalisierung und Stoffwechsel1. Während gesundes ECM eine wesentliche Rolle für die Aufrechterhaltung der normalen Gewebefunktion spielt, wurde dysfunktionales ECM in mehrere Krankheiten verwickelt2.

Adipose-Gewebe spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Stoffwechselerkrankungen. Adipositas ist verbunden mit übermäßiger Adipozytenhypertrophie und zellulärer Hypoxie, Defekten im Adipozyten-Zellstoffwechsel und adipose Gewebe endoplasmatischere Retikulum und oxidativen Stress und Entzündungen. Obwohl schlecht verstanden, konspirieren diese komplexen Prozesse, um Fettgewebe PufferungKapazität zu beeinträchtigen, was zu Nährstoffüberlauf aus Fettgewebe, Toxizität in mehreren Geweben, und systemische Stoffwechselerkrankung3,4 ,5. Die Abfolge der Ereignisse und spezifische Mechanismen, die dem Versagen des Fettgewebes zugrunde liegen, sind schlecht verstanden, aber Veränderungen im Fettgewebe ECM wurden involviert. Die ECM-Zusammensetzung wird innerhalb des Fettgewebes bei menschlicher und muriner Fettleibigkeit verändert, mit erhöhter Ablagerung von ECM-Protein zusammen mit qualitativen biochemischen und strukturellen Unterschieden im Fettgewebe ECM im Zusammenhang mit menschlichen Stoffwechselerkrankungen, einschließlich Typ-2-Diabetes und Hyperlipidämie6,7,8,9,10,11.

Trotz dieser Beobachtungen ist die Rolle des Fettgewebes ECM bei der Vermittlung von Fettgewebedysfunktion nicht genau definiert. Dies ist zum Teil auf einen Mangel an belastbaren experimentellen Modellen zurückzuführen, die eine Zerlegung der spezifischen Rollen von ECM und Adipozyten bei der Regulierung der ultimativen Fettgewebefunktion ermöglichen. Die ECM-Adipozytenkultur simuliert die In-vivo-Umgebung des nativen Fettgewebes in mindestens zwei Punkten. Erstens bietet die ECM-Kultur eine molekulare Umgebung, die nativem Fettgewebe ähnelt, einschließlich nativer Kollagene, Elastine und anderer Matrixproteine, die in der Standard-2D-Kultur fehlen. Zweitens hat sich gezeigt, dass die Kultur auf 2D-Kunststoff den Adipozytenstoffwechsel durch mechanische Effekte durch verminderte Elastizität des Kunststoffsubstrats12verändert, was die ECM-Kultur eliminiert.

Methoden zur Konstruktion biologischer Gerüste durch Isolierung von ECM aus dezellularisiertem Fett und anderen Geweben wurden im Rahmen der regenerativen und rekonstruktiven Medizin und Gewebetechnik untersucht13,14, 15,16,17,18. Wir haben bereits eine Methodik veröffentlicht, in der wir diese Methoden angepasst haben, um ein in vitro 3D-Modell der menschlichen ECM-Adipozytenkultur zu entwickeln, mit ECM und Adipozytenstammzellen (Preadipozyten), die aus humanen viszeralen Fettgeweben abgeleitet sind11. Im vorliegenden Artikel beschreiben wir diese Methoden ausführlich. Das Dezellularisierungsverfahren für menschliches Fettgewebe ist ein viertägiger Prozess, bei dem mechanische und enzymatische Behandlungen zur Entfernung von Zellen und Lipiden durchgeführt werden, wodurch ein biologisches Gerüst zurückbleibt, das die Eigenschaften des Gewebes beibehält, aus dem es gewonnen wird. Dezellularisiertes ECM unterstützt die adipogene Differenzierung menschlicher Präadiipozyten und bei Rekonstitution mit Adipozyten, behält mikrochemische und biochemische und krankheitsspezifische Eigenschaften intakten Fettgewebes bei und beteiligt sich an metabolischen Funktionen, die für natives Fettgewebe charakteristisch sind. Diese Matrix kann allein untersucht oder mit Zellen neu gesät werden, was eine Untersuchung von Wechselwirkungen und Übersprechen zwischen den zellulären und extrazellulären Komponenten des Fettgewebes ermöglicht.

Protokoll

Adipose Gewebe werden von menschlichen Probanden, die wahlelektrische bariatrische Chirurgie unter institutioneller Überprüfung Board Genehmigung beschafft.

1. Preadipozytenisolation und Kulturreagenzzubereitung

  1. Bereiten Sie 2% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x Phosphat gepufferte Kochsalinelösung (PBS) vor. Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.
  2. Bereiten Sie Typ II Kollagennase: 2 mg/ml in 2% BSA in 1x PBS. Bereiten Sie sich unmittelbar vor der Verwendung vor.
  3. Vorbereiten der Red Blood Cell (RBC) Lysing Lösung: 1,5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM Dinatrium EDTA in entionisiertem Wasser (DI/H2O). Bei 4 °C lagern. Bereiten Sie 1x RBC Lysing Solution aus 10x Lagerlösung in DI/H2O unmittelbar vor Gebrauch vor.
  4. Vorbereiten von Wachstumsmedien: 15% fetales Rinderserum (FBS), 1% antimykotische Lösung (ABAM) in Dulbecco es Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12). Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.
  5. Vorbereiten von Preadipozyten-Gefrierlösung: 10% Dimethylsulfoxid, 15% FBS in DMEM/F12-Medien. Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.
  6. Vorbereiten von Differenzierungsmedien: 10 mg/L Transferrin, 33 'M Biotin, 0,5 'M Humaninsulinlösung, 17 'M D-Pantothensäure Hemicalciumsalz, 100 nM Dexamethason, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-Thyronin-Natriumsalz (T3), 1 Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX),1% ABAM in DMEM/F12. Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.

2. ECM-Reagenzzubereitung

  1. Vorbereiten der Gefrierpufferlösung: 10 mM Tris-Basis, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in DI/H2O. Stir-Lösung zur Auflösung von EDTA. PH mit HCl oder NaOH.Store bei 4 °C für bis zu 3 Monate auf 8,0 einstellen.
  2. Bereiten Sie enzymatische Lösung #1: 1% ABAM in 0,25% Trypsin-EDTA vor. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
  3. Vorbereiten spülen PufferLösung: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 1% ABAM, 1% PMSF in sterilisiertem DI/H2O. Salze unterrühren. Stellen Sie pH auf 8.0 mit HCl oder NaOH ein. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
  4. Vorbereiten der enzymatischen Lösung #2: 55 mM Na2HPO4, 17 mM KH2PO4, 4,9 mM MgSO47H2O, 1% ABAM, 1% PMSF in DI/H2O. 4 °C für bis zu 3 Monate lagern. Salze umrühren. Unmittelbar vor der Anwendung 80 U/ml Lipase aus schweinerinder Bauchspeicheldrüse, Typ VI-S; 160 U/ml Desoxyribonuklease I aus Rinderbauchspeicheldrüse, Typ II-S; und 100 g/ml Ribonuklease A aus Rinderbauchspeicheldrüse, Typ III-A.
  5. Bereiten Sie Polar Solvent Extraction Solution vor: 1% ABAM, 1% PMSF in Isopropanol.
    VORSICHT: Isopropanol ist entzündlich; in einem brennbaren Schrank bei 25 °C aufbewahren und in brennbaren Abfällen entsorgen.
  6. Bereiten Sie 70% Ethanol, 1% ABAM, 1%PMSF in DI/H2 O vor. Fügen Sie ABAM und PMSF kurz vor der Verwendung hinzu.
    VORSICHT: Ethanol ist entzündlich; in einem brennbaren Schrank bei 25 °C aufbewahren und in brennbaren Abfällen entsorgen.
  7. Vorbereiten der Speicherlösung: 1% ABAM, 1% PMSF in 1x PBS. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.

3. Metabolische Phänotypisierungsreagenzzubereitung

  1. Glukoseaufnahme
    1. Serum Starvation Media vorbereiten: DMEM/F12, 1% ABAM. Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern
    2. Bereiten Sie 200 nM Humaninsulinlösung in 1x PBS unmittelbar vor der Anwendung vor.
    3. Bereiten Sie 200 nM Humaninsulin, 0,1 mM 2-Deoxy-D-Glucose, 1 Ci/well Deoxy-D-Glucose, 2-[1,2-3H(N)]-, in 1x PBS vor. Bereiten Sie sich unmittelbar vor der Verwendung vor.
  2. Lipolyse
    1. Bereiten Sie Isoproterenol in PBS verdünnt: 3 mM Stammlösung. Verdünnen Sie für den Assay eine Arbeitskonzentration von 3 m.
  3. Öl Rot-O Färbung
    1. Bereiten Sie 4% Formalin in DI/H2O. Bei Raumtemperatur auf.
    2. Bereiten Sie Öl Red-O Arbeitslösung. Dilute Oil Red-O Solution (ORO) mit DI/H2O im Verhältnis 3:2 (ORO:DI/H2O). Bereiten Sie sich unmittelbar vor der Verwendung vor. Filtern durch Filterpapier (Materialtabelle).

4. Adipische Gewebebeschaffung

HINWEIS: Viszerales Fettgewebe (MwSt.) wird zu Beginn der Operation vom Chirurgen aus dem größeren Omentum entnommen und zur sofortigen Verarbeitung auf Eis zurück ins Labor transportiert. Universelle Vorsichtsmaßnahmen sollten beim Umgang mit allen menschlichen Geweben und ätzenden Reagenzien angewendet werden, einschließlich der Durchführung aller Arbeiten in einer laminaren Durchflusshaube, unter Verwendung von vollständigem Laborsicherheitsverschleiß und ohne Rückfall von Nadeln.

  1. Fügen Sie 5-10 g intakte Mehrwertsteuer zu 15-25 ml Gefrierpufferlösung in ein 50 ml konisches Rohr, um die Gewebeprobe einzutauchen. Proben bei -80 °C bis zur Dezellularisierung bis zu 1 Monat lagern.
  2. Verwenden Sie eine separate frische Probe der Mehrwertsteuer für die Prereadipozytenisolierung, wie in Abschnitt 5 beschrieben.

5. Preadipozyten-Isolierung

  1. 2 g intakte Mehrwertsteuer in 20 ml der Kollagenase, Typ II, Lösung in einem 50 ml konischen Rohr. Dann gründlich zerkleinern, indem Sie sterile Scheren in das konische Rohr einsetzen und das Gewebe in der Röhre zerkleinern. Einmal vollständig in eine feine Gülle gehackt, inkubieren Sie das Gewebe in der Kollagenaselösung auf einem Orbitalshaker bei 130 Rpm und 37 °C für 60 min.
  2. Filtern Sie das resultierende Gärrest durch ein 100 m aus Nylongewebe in ein frisches 50 ml konisches Rohr, indem Sie das Gärgut aus einem konischen Rohr durch ein Übereine über die Oberseite eines frischen konischen Rohres gefaltetes Netz gießen. Das Gärgut sollte an dieser Stelle eine gelb-orange Flüssigkeit mit mäßiger Viskosität sein, mit kleinen Mengen an Reststrängen von unverdautem Fasergewebe. Das Netz sollte größere Stücke von unverdautem Gewebe erfassen, die verworfen werden.
  3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 270 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 2 ml 1x 1x RBC Lysing Solution mit einer Pipette wieder auf.
    1. 1 min bei 25 °C inkubieren und dann 10 ml von 15% FBS-DMEM/F12 hinzufügen. Zentrifuge bei 270 x g für 10 min.
  4. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 10 ml von 15% FBS-DMEM/F12 mit einer Pipette wieder auf. Die Zellsuspension mit einer Pipette auf 100 mm Petrischale übertragen und bei 37 °C und 5%CO2inkubieren, bis die Zellen 80-100% Zusammenfluss erreichen, in der Regel 2-6 Tage. Wechseln Sie die Medien alle 2-3 Tage.
  5. Lösen und waschen Sie Zellen.
    1. Entfernen Sie Medien mit einer Pipette und wenden Sie 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA auf anhaftende Zellen an. 10 min bei 37 °C inkubieren und die Platte regelmäßig sanft wirbeln, um die Zellen zu lösen.
    2. Fügen Sie 20 ml von 15% FBS-DMEM/F12 hinzu und setzen Sie die getrennten Zellen in diesem Medium mit einer Pipette wieder auf. Dann in ein frisches 50 ml konisches Rohr und Zentrifuge 270 x g für 10 min übertragen.
    3. Entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Waschen Sie das Zellpellet einmal in 1x PBS, und setzen Sie das Zellpellet dann in 20 ml frischem 15% FBS-DMEM/F12 mit einer Pipette wieder auf. Übertragen Sie die Zellsuspension in einen T-150-Kulturkolben.
  6. Kulturzellen bei 37 °C und 5%CO2. Teilen und erweitern Sie Zellen alle 2-3 Tage, wenn sie 80-100% Zusammenfluss erreichen, indem Sie 7 ml 0,25% Trypsin-EDTA anwenden und sich von einem Kolben auf 8 Kolben ausdehnen.
    HINWEIS: Dies erfordert in der Regel 3-4 Passagen, die eine angemessene Expansion ermöglichen und adipogene Potenzial und patienten- und depotspezifische zelluläre metabolische Phänotypen behält. Passaging Preadipocytes über 4-5 Passagen führt zum Verlust des adipogen Potenzials.
  7. Lösen Sie Zellen in 8 Kolben mit 7 ml 0,25% Trypsin-EDTA pro Kolben, wie oben beschrieben, und inkubieren bei 37 °C für 10 min.
  8. Fügen Sie 8 ml von 15% FBS-DMEM/F12 pro Kolben hinzu und setzen Sie die abgetrennten Zellen mit einer Pipette wieder auf. Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension gleichmäßig in drei 50 ml konische Röhren und Zentrifuge bei 270 x g für 10 min.
  9. Setzen Sie die resultierenden Zellpellets in 5 ml von 15% FBS-DMEM/F12 in einem 15 ml konischen Rohr aus und zählen Zellen mit Zellzähler und Trypan blau.
  10. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 270 x g für 10 min. Setzen Sie dann das Zellpellet in Deriipozyten-Gefrierlösung auf eine endgültige Zellkonzentration von 1 x 106/ml und aliquot 1 ml Zellsuspension pro 1,5 ml Kryovialrohr aus.
  11. Zellen in Kryovials 1 Tage bei -80 °C lagern. Dann übertragen Kryovials zu flüssigem Stickstoff für die langfristige Lagerung für 3-6 Monate.
  12. Bei Gebrauchsfertiges Kryoval in einem 37 °C-Wasserbad für 3-5 min auftauen. Die Zellen in 20 ml von 15% FBS-DMEM/F12 und Zentrifuge bei 270 x g für 10 min aufsetzen.
  13. Das Zellpellet in 20 ml von 15% FBS-DMEM/F12, Pipette in einen einzigen T-150-Kolben aussetzen und dann über 2-3 Tage bei 37 °C und 5%CO2auf 80% Zusammenfluss anwachsen.
  14. Lösen Sie Zellen mit 7 ml 0,25% Trypsin-EDTA pro Kolben, wie oben in Schritt 5.6 beschrieben. Bei 3 Millionen Zellen pro ml (d. h. 6 x 104 Zellen pro 20 L) in 15% FBS-DMEM/F12 wieder aufsetzen und wie unten beschrieben verwenden (Abschnitt 7, Schritt 7.4).

6. Fettgewebe ECM-Präparation

  1. Tag 1: Frosttau und enzymatische Verdauung #1
    1. Frosttauen sieden zuvor gefroren (Schritt 4.2) MwSt.-Proben, die in Gefrierpufferlösung in 50 ml konischen Rohren von -80 °C bis 37 °C in einem vorgeheizten Wasserbad gelagert werden, wobei 20 min mit sanfter periodischer manueller Rührung bebrütet werden. Nach dem Auftauen auf -80 °C zurückgeben und 20 min inkubieren. Einfrieren-Tauen 3x wiederholen, endend durch Auftauen von Proben in einem 37 °C-Wasserbad.
    2. Mit sterilen Zangen die MwSt.-Proben in frische 50 ml konische Rohre mit 15-25 ml Enzymatische Lösung #1 übertragen, um sicherzustellen, dass die MwSt.-Proben vollständig eingetaucht sind. Dann über Nacht auf einem Orbital-Shaker (130 Rpm, 37 °C) inkubieren.
  2. Tag 2: Enzymatische #2
    1. Proben 3x mit 15-25 ml Spülpufferlösung auf einem Orbital-Shaker (130 Rpm, 37 °C, 20 min pro Waschgang) waschen. Spülpufferlösung nach jeder Wäsche abgießen.
    2. Proben in frische 50 ml konische Röhren mit 15-25 ml Enzymatorische Lösung #2 übertragen und auf einem Orbitalshaker (130 U/min, 37 °C, über Nacht) inkubieren.
  3. Tag 3: Delipidation
    1. Proben 3x mit 15-25 ml Spülpufferlösung auf einem Orbital-Shaker (130 Rpm, 37 °C, 20 min pro Waschgang) waschen. Spülpufferlösung nach jeder Wäsche abgießen.
    2. Übertragen Sie Proben in frische 50 ml konische Rohre mit 15-25 ml PolarSolvent Extraction Solution und inkubieren auf einem Orbitalshaker (130 U/min, 25 °C, über Nacht). Nach diesem Schritt sollte ein Großteil des Lipids entfernt werden, und die Proben sollten weiß oder lichtdurchlässig in der Farbe sein.
      VORSICHT: Die polare Lösungsmittelextraktionslösung ist entzündlich und sollte bei 25 °C gelagert und verwendet werden.
  4. Tag 4: Waschen und Lagern
    1. Übertragen Sie Proben in frische 50 ml konische Rohre mit 15-25 ml Spülpufferlösung. Waschen Sie Proben 3x auf einem Orbital-Shaker (130 Rpm, 37 °C, 20 min pro Wäsche).
    2. Waschen Sie Proben 3x mit 15-25 ml 70% Ethanol auf einem Orbitalshaker (130 Rpm, 37 °C, 20 min jede Wäsche), die die 70% Ethanollösung nach jeder Wäsche abgießen.
    3. Proben einmal mit Lagerlösung auf einem Orbital-Shaker waschen (130 Rpm, 37 °C, 20 min pro Wäsche).
    4. Mit sterilen Zangen Proben in frische 50 ml konische Rohre mit 15-25 ml Speicherlösung übertragen. Stellen Sie sicher, dass genügend Speicherlösung verwendet wird, um Proben vollständig einzutauchen. Bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.

7. ECM-Adipozyten-Vorbereitung

  1. Übertragen Sie gespeicherte ECM-Fragmente mit sterilen Zangen auf einzelne Brunnen mit 24-Well-Platte. Fügen Sie so viele ECM-Fragmente in so viele Brunnen ein, wie für den geplanten Downstream-Test erforderlich sind (z. B. Glukoseaufnahme oder Lipolyse, siehe unten), einschließlich Duplikaten oder Triplicaten. Waschen Sie mit 500 l 70% Ethanol 3x auf einem Orbital-Shaker (130 Rpm, 37 °C, 20 min pro Wäsche).
  2. ECM rehydrieren, indem man 3x in sterilem 1x PBS auf einem Orbitalshaker (130 Rpm, 37 °C, 20 min pro Waschgang) wäscht.
  3. Mit steriler Schere, schneiden und wiegen ECM in 100 mg Fragmente. Mit sterilen Zangen, legen Sie ein 100 mg Fragment in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte. Bei 25 °C für 15 min inkubieren, damit überschüssige PBS aus Fragmenten extrudieren kann. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige PBS mit einer Pipette.
  4. Samen je 100 mg ECM-Fragment mit 20 l Preadipozytenzellsuspension (3 Millionen Zellen pro ml, 6 x 104 Zellen pro 20 l, in 15% FBS-DMEM/F12, ab Schritt 5.10). Pipette die Zellen direkt in das ECM, indem Sie die Spitze der Pipette in das ECM und sanft die Zellsuspension in die Mitte der Matrix, wobei darauf achten, dass die Zellsuspension nicht überläuft und am Ende auf der Unterseite des Brunnens.
    1. Wenn die Zellsuspension aus dem ECM überläuft, wo die Pipettenspitze platziert wurde, entfernen Sie die Spitze von dieser Position und legen Sie sie an einer anderen Stelle in das ECM ein. ECM für 40 min bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Für die RNA-Extraktion für qrtPCR samen je 500 mg ECM-Fragmente mit 3 x 105 Zellen in 100 l (3 Millionen Zellen pro ml, d. h. 3 x 105 Zellen pro 100 l, in 15% FBS-DMEM/F12).
  5. Füllen Sie jeden Brunnen der 24-Well-Platte mit 500 L Wachstumsmedien, um die gesäten ECM-Fragmente abzudecken. Kultur bei 37 °C und 5%CO2 für 72 h.
  6. Nach 72 h, saugen Sie sorgfältig 15% FBS-DMEM/F12, kippen Sie die Platte leicht, damit Medien unter Fragment zu bündeln, und platzieren Sie die Pipettenspitze direkt neben dem ECM-Fragment, ohne es zu stören. Nach dem Ansaat fügen Sie 500 L Differenzierungsmedien hinzu, die alle 2-3 Tage mit einer ähnlichen Technik für einen Gesamtkulturzeitraum von 14 Tagen wechseln.
    1. Prüfen Sie auf Differenzierung mit Der Lichtmikroskopie: Zellen akkumulieren Lipide, färben sich braun-gelb und sind kugelförmiger.
      HINWEIS: Saatmatrizen können für Metabolische Tests (z. B. Glukoseaufnahme-Assay, Lipolyse-Assay, ORO), Histologie oder Immunhistochemie (IHC) oder Standard-Gewebebildgebung verwendet werden. Für fixed tissue ORO Färbung und Bildgebung, einfrieren ECM-Adipozyten-Proben in flüssigem Stickstoff.

8. Metabolische Phänotypisierung

  1. Rasterelektronenmikroskopie
    1. Fixproben in 2,5% Glutaraldehyd im Sorensen-Phosphatpuffer bei 25 °C für 12 h. Postfix in 1% Osmiumtetroxid im Phosphatpuffer von Sorensen bei 4 °C für 1 h.
    2. Seriell dehydrieren Proben in Ethanol. In Hexamethyldisalizan waschen und lufttrocken. Dann montieren Sie auf einem Rasterelektronenmikroskope-Stub mit kolloidalem Graphit. Trocken und Sputtermantel mit Gold.
    3. Erfassen Sie Bilder mit einem Rasterelektronenmikroskop.
  2. Öl Rot-O Färbung
    1. Lebendes Gewebe: Öl Red-O Lösung
      1. Sorgfältig eskaugen Medien aus Brunnen mit einer Pipette. Dann proben einmal mit 500 l von 1x PBS pro Brunnen waschen.
      2. Proben mit 200 l 4% Formalin in sterilen deionisiertenH2O bei 25 °C für 15 min fixieren. Aspirat formalin mit einer Pipette, Proben zweimal mit 1x PBS (500 l pro Waschgang) waschen.
      3. Fügen Sie 200 l 60% Isopropanolproben bei 25 °C für 5 min. Aspirieren 60% Isopropanol mit einer Pipette.
      4. Proben mit Öl-Rot-O-Arbeitslösung bei 25 °C für 5 min. Aspiratöl Red-O mit einer Pipette und dann waschen Proben 3x mit 1x PBS (500 l pro Waschgang). Dann Bild mit einem optischen Mikroskop.
    2. Festes Gewebe: Öl Red-O Stain Kit
      1. Flash-Freeze ECM-Adipocyt-Proben in optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung und Abschnitt (5 m) auf einem Kryostat.
      2. Legen Sie das Dia in 85% Propylenglykol in DI/H2O für 2 min. Legen Sie das Dia in ORO-Färbung bei 60 °C für 6 min. Setzen Sie steh lide in 85% Propylenglykol in DI/H2O für 1 min. Spülen Sie den Schlitten zweimal mit DI/H2O.
      3. Legen Sie die Rutsche in Modified Mayer es Hematoxylin aus Oil Red-O Färbeset für 1 min. Spülen Sie die Rutsche zweimal mit Leitungswasser. Zweimal mit DI/H2O spülen.
      4. Montieren Sie den Coverslip mit wässrigem Montagemedium und Bild am Mikroskop.
    3. RNA-Extraktion aus ECM für qrtPCR
      ANMERKUNG: Um die RNA-Ausbeute zu maximieren, verwenden Sie 500 mg ECM-Fragmente, die mit 3 x 105 Preadipozyten in 100 l gesät sind, und unterscheiden sie wie oben in 6-Well-Platten in 3 ml Differenzierungsmedien pro Brunnen.
      1. Nach der Differenzierung jede einzelne ECM-Adipozytenprobe mit sterilen Zangen in ein 50 ml kegelförmiges Rohr auf Eis übertragen.
      2. Waschen Sie gut gut mit 500 l Puffer RLT. Fügen Sie Buffer RLT zu 50 ml konischem Rohr mit passender ECM-Adipozytenprobe hinzu.
      3. Mit steriler Schere jede ECM-Adipozytenprobe innerhalb des 50 ml konischen Rohres fein zerkleinern, während Sie das Rohr auf Eis halten und die Schere in das konische Rohr einsetzen, um das Gewebe zu zerkleinern.
      4. Die konischen Rohre von -80 °C bis 37 °C 3x vollständig einfrieren und auftauen.
      5. Zentrifugenkonusrohre bei 500 x g und 4 °C für 10 min.
      6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und verwenden Sie für die RNA-Extraktion mit einem Fibrous Tissue RNA Extraction Kit (Table of Materials).
  3. Glukoseaufnahme-Assay
    1. Differenzieren Sie 6 x 104 Preadipozyten in 100 mg ECM-Fragmenten in 0,5 ml Differenzierungsmedium in 24-Well-Platten, wie oben beschrieben (Abschnitt 5).
    2. Nach 14 Tagen Differenzierung das Medium entfernen und ECM-Adipozyten einmal mit 1x PBS waschen. Fügen Sie 0,5 ml/Well Serum Starvation Medium und Kultur bei 37 °C und 5%CO2 für 12 h hinzu.
    3. Entfernen Sie Medium und Waschzellen zweimal mit 1x PBS. Fügen Sie 0,5 ml/well 2% BSA in PBS und Kultur bei 37 °C und 5%CO2 für 2 h hinzu.
    4. Einmal Zellen mit 1x PBS waschen, 0,5 ml/well 1x PBS mit oder ohne 200 nM Insulin hinzufügen und 40 min bei 37 °C brüten.
    5. Aspirat 1x PBS, 0,5 ml/well 1X PBS mit 0,1 mM 2-Deoxy-D-Glucose, 2 Ci/mL Deoxy-D-Glucose, 2- [1,2-3H(N)] mit oder ohne 200 nM Insulin hinzufügen und bei 37 °C und 5% CO2 für 40 min inkubieren. radioaktive Reagenzien und Abfälle, wie sie in den lokalen institutionellen Rechtsvorschriften vorgeschrieben sind.
    6. Entfernen Sie Medium mit einer Pipette und Waschzellen 3x mit 1x PBS. Fügen Sie 420 L 1% SDS-Lösung in DI/H2O und Lysezellen mit kräftiger Pipettierung hinzu. 25 °C für 10 min inkubieren.
    7. Sammeln Sie 5 L von jedem Brunnen für Bradford Protein-Assay. Übertragen Sie 400 l des verbleibenden Zelllysats in 2 ml Szintillationsflüssigkeit in einer Szintillationsdurchstechsonder. Zählen Sie 3H-2DG-Aktivität auf Szintillationszähler. Analysieren Sie die Daten als Anzahl pro Minute normalisiert zu Protein, mg/mL.
  4. Lipolyse-Assay
    1. Differenzieren Sie 6 x 104 Preadipozyten in 100 mg ECM-Fragmenten in 0,5 ml menschlichem Differenzierungsmedium in 24-Well-Platten, wie oben beschrieben (Abschnitt 5).
    2. Nach 14 Tagen Differenzierung, entfernen Sie Medium und waschen Zellen zweimal mit warmen 1x PBS. Fügen Sie 0,5 ml Serumhungermedium (ohne Insulin) mit oder ohne 3 M Isoproterenol hinzu und kulture Adipozyten bei 37 °C und 5%CO2 für 72 h.
    3. Sammeln Sie Kulturüberstand, die bei -80 °C gelagert werden können, bis sie zum Test bereit sind. Sammeln Sie das ECM in Mikrozentrifugenröhren für die DNA-Quantifizierung zur Datennormalisierung.
    4. Pipetten Sie 2 l jedes Überstands in eine 96-Well-Mikroplatte. Reservebrunnen für Rohlinge (destilliert H2O) und Glycerin-Standardlösung im Triglycerid-Bestimmungskit.
    5. Fügen Sie 270 L freies Glycerin-Reagenz aus Triglycerid-Bestimmungskit zu jedem Brunnen hinzu, Pipette zum Mischen. Inkubationsplatte bei 37 °C für 5 min.
    6. Messen Sie die Absorption bei 540 nm auf einem Mikroplattenspektrophotometer.
    7. Berechnen Sie die Konzentration von Glycerin und normalisieren Sie mit DNA aus ECM:

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Ergebnisse

Die Herstellung von Fettgewebe ECM, Aussaat mit Präsipozyten und In-vitro-Differenzierung in reife Adipozyten führen zu klaren sequenziellen morphologischen Veränderungen im Gewebe, die eine visuelle Beurteilung des Fortschritts im gesamten Protokoll ermöglichen (Abbildung 1) . Preadipozyten, die zum Aussaat des ECM verwendet werden, werden mit Kollagennase-Verdauung aus separaten MwSt.-Proben isoliert (Abbildung 2). Die Rast...

Diskussion

Das ECM-Adipozyten-Kulturmodell bietet ein wertvolles Werkzeug, um die individuellen Rollen von ECM und Zellen bei der Diktat des ultimativen Gewebephänotyps zu sezieren. Das ECM-Isolationsprotokoll ist sehr reproduzierbar, aber die Variabilität im Dezellularisierungsprozess kann beobachtet werden. Der Tag-3-Delipidierungsschritt ist ein kritischer Punkt im Protokoll. Nach Abschluss der nächtlichen Extraktion sollte die Delipidisierung der Matrix durch das Gelbdrehen der PolarSolventlösung nachgewiesen werden, währe...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine gegensätzenden Interessen.

Danksagungen

Wir danken Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa und Retha Geiss für die Unterstützung bei der Studienkoordination. SEM wurde von der University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility durchgeführt. Dieses Projekt wurde unterstützt durch NIH-Stipendien R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant vom Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veterans Administration VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Rasterelektronenmikroskopie der University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Abbildung 4 dieses Manuskripts wurde ursprünglich in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017 veröffentlicht; 1.10.102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, und wurde mit Genehmigung der Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329] reproduziert. Für die Erlaubnis, dieses Material wiederzuverwenden, besuchen Sie bitte http://global.oup.com/academic/rights.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#25200056
1.5 mL cryovial tubeFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#02-682-557
10% Neutral Buffered FormalinVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#89370-094
100 µm nylon mesh filterCorning Inc., Corning, NY, USACat#352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T6397
24-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I5879
96-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#15240062
BiotinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#A8806
Buffer RLTQiagen, Hilden, GermanyCat#79216
CiglitizoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USACat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4513
DexamethasoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4902
Dimethyl SulfoxideFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP231Flammable, caustic
Disodium EDTAFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium saltSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#11320033
EthanolDecon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USACat#DSP-MD.43Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTekVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#10437028
GlutaraldehydeSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#G5882Caustic
HexamethyldisalizaneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#440191Flammable, caustic
Human insulin solutionSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I9278
IsopropanolFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A415Flammable
IsoproterenolSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#I5627Flammable
KClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S25484
KH2PO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#L0382
MgSO4*7H2OSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#230391
Na2HPO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S5136
NaClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S3014
NaHCO3Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#S233
NH4ClFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compoundAgar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UKCat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#O1391
Oil Red-O Stain KitAmerican Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USACat#KTORO-G
Osmium tetroxideSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#201030Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#93482Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-ASigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKitQiagen, Hilden, GermanyCat#74704
Scintillation FluidFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate bufferThomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJCAS #: 10049-21-5
T-150 culture flaskVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube HomogenizerBenchmark ScientificCat#D1030
TransferrinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T3309
Triglyceride Determination KitSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%VWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Type II collagenaseGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mmSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#WHA5201150

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