Quantifizierung von proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden

Zusammenfassung

Das vorgestellte Protokoll verwendet Diedurchflusszytometrie, um die Anzahl der sich ausbreitenden und abgestorbenen Zellen in kultivierten Mausenteroiden zu quantifizieren. Diese Methode ist hilfreich, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Organoidproliferation und das Überleben zu bewerten.

Zusammenfassung

Das Darmepithel wirkt als Barriere, die verhindert, dass Luminalgehalte wie pathogene Mikrobiota und Toxine in den Rest des Körpers gelangen. Die Epithelbarrierefunktion erfordert die Integrität von Darmepithelzellen. Während die Epithelzellproliferation eine kontinuierliche Schicht von Zellen aufrechterhält, die eine Barriere bildet, führt Epithelschädigung zu Barrierestörungen. Dadurch können luminale Inhalte über einen unbeschränkten Weg über die Darmbarriere hinweg. Dysfunktion der Darmbarriere wurde mit vielen Darmerkrankungen verbunden, wie entzündliche Darmerkrankungen. Isolierte Maus-Darmkrypen können als krypto-villus-ähnliche Strukturen kultiviert und gepflegt werden, die als Darmorganoide oder "Enteroide" bezeichnet werden. Enteroide sind ideal, um die Proliferation und den Zelltod von Darmepithelzellen in vitro zu untersuchen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode, um die Anzahl der proliferativen und abgestorbenen Zellen in kultivierten Enteroiden zu quantifizieren. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin (EdU) und Propidiumiodid werden verwendet, um wulässige und abgestorbene Zellen in Enteroiden zu kennzeichnen, und der Anteil der vermehrenden und abgestorbenen Zellen wird dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Dies ist ein nützliches Werkzeug, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Proliferation von Darmepithelzellen und das Überleben von Zellen zu testen.

Einleitung

Eine grundlegende Funktion der Darmepithelzellen ist es, den Eintrag von leuchtdichtem Inhalt wie pathogenen Bakterien und Toxinen^1,2zu schützen. Um eine solche Funktion auszuführen, vermehren sich Darmstammzellen kontinuierlich und differenzieren sich in eine Vielzahl von Epithelzellen, einschließlich Enterozyten und Sekretoretenzellen, die eine Barriere bilden, indem sie enge Verbindungen bilden³. Die schnelle Erneuerung der Darmepithelzellen erfordert eine strikte Koordination der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und zelltodige^{Zellabnutzung 4,5}. Reduzierte Zellproliferation oder übermäßiger Zelltod führt zu Epithelschäden und kompromittierter Barrierefunktion^1,6. Dysfunktion der Darmbarriere wurde mit entzündlichen Darmerkrankungen in Verbindung gebracht^7,8.

Eine Methode zur Kultur von Darmkrypen wurde bereits entwickelt. Mit dieser Technik wachsen isolierte Mauskrypten zu Darmorganoiden (Enteroiden), die krypto-villus-ähnliche Strukturen haben und alle Darmepithelzelllinien^9,10enthalten. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin (EdU) ist ein Thymidin-Analog, das in der Lage ist, Thymin (T) in der DNA zu ersetzen, die während der Zellproliferation vermehrt wird. Die proliferativen Zellen können durch EdU-Färbung schnell und genau beschriftet werden. Propidiumiodid (PI) ist ein Analogon von Ethidiumbromid, das rote Fluoreszenz bei der Einfügung in doppelsträngige DNA freisetzt. PI erkennt gezielt abgestorbene Zellen, da sie nur durch die beschädigte Zellmembran verläuft.

In diesem Protokoll beschreiben wir zunächst, wie man Krypten aus dem murinen Dünndarm isoliert und sie dann als Enteroide in vitro kultiviert. Wir beschreiben dann, wie man die proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden durch EdU und PI-Integration und Durchflusszytometrie analysiert.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee des Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) an der Soochow University genehmigt.

1. DarmorganoidIsolation und Kultur

1. Isolierung von Darmkrypten und enteroiden Kulturen
   1. Euthanisieren Sie eine 8 Wochen alte Wild-Typ-Maus mit CO2-Inhalation. Verwenden Sie TissueZangen und feine Irisschere, um ca. 8 cm Ileum zu sezieren.
   2. Mit einer Spritze mit gavage Fütterungsnadel mit ca. 40 ml eiskaltem Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) ausspülen, dann längs mit einer Schere schneiden und das Ileum öffnen.
   3. Das Ileum in kleine (0,5 x 1,0 cm) Stücke schneiden. Die Stücke in 5 ml steriler eiskalter DPBS in ein 15 ml kegelförmiges Rohr geben, dann 5 min auf Eis schaukeln.
   4. Verwenden Sie einen Pipettenregler, um die DPBS zu aspirieren und durch 10 ml Kaltpuffer 1 (2 mM EDTA in DPBS) zu ersetzen. Rock für 30 min auf Eis.
   5. Verwenden Sie den Pipettenregler, um Puffer 1 zu aspirieren und ersetzen Sie ihn durch 10 ml Kaltpuffer 2 (54,9 mM D-Sorbitol, 43,4 mM Saccharose in DPBS). Schütteln Sie für 2 x 3 min von Hand (ca. 80 Shakes/min).
   6. Nehmen Sie nach dem Schütteln ein 20-L-Tröpfchen Puffer 2 Inhalt und inspizieren Sie es unter dem Mikroskop.
   7. Filterpuffer 2 Inhalt mit einem 70'm sterilen Zellsieb, dann sammeln Sie den gefilterten Puffer mit einem 50 ml konischen Rohr.
   8. Pipette 20 L Filtrat auf die Folie, um die Krypten zu zählen. Übertragen Sie eine ausreichende Menge an Puffer 2 aus Schritt 1.1.7, um sicherzustellen, dass es 500 Crypts/Well gibt.
   9. Drehen Sie bei 150 x g für 10 min bei 4 °C. Sobald das Spinnen abgeschlossen ist, saugen Sie den Überstand vorsichtig an.
   10. Suspend Krypten in 50 l Kellermembranmatrix (z.B. Matrigel) pro 500 Krypten, Pipette auf und ab (vorsichtig, blasen zu vermeiden), dann legen Sie eine 50 L Tröpfchen Kellermembran Matrix / Krypta Mischung in der Mitte eines Brunnens in einer 24 Brunnenplatte. 30 min bei 37 °C inkubieren, um die Kellermembranmatrix zu polymerisieren.
   11. Nach 30 min Polymerisation vorsichtig 600 l Minigut-Medien hinzufügen (fortgeschrittenes Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium [DMEM]/F12, 2 mM L-Alanin-L-Glutamin, Stift/Strep [100 Einheiten/ml], 10 mM Hepes, N2-Ergänzung [1:100], B27-Beilage [1:50] mit epidermalem Wachstumsfaktor [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-Spondin [500 ng/mL], und Y27632 [10 'M]) zu jedem Brunnen, dann die Platte auf die 37 °Cto-Inkubation zurückgeben. Beobachten Sie jeden Tag unter dem Mikroskop, und wechseln Sie die Medien alle 2 bis 3 Tage.
2. Enteroid-Passaging
   HINWEIS: Bei langen Kulturen sollten Enteroide ungefähr jede Woche geteilt werden.
   1. Um die Enteroide zu durchdringen, legen Sie die Gewebekulturplatte auf Eis. Aspirieren Sie die Medien und fügen Sie 1 ml kalte DPBS zu jedem Brunnen hinzu. Verwenden Sie eine P1000-Spitze, um Pipetten nach oben und unten zu pipette, bis keine festen Kellermembran-Matrix-Stücke übrig bleiben.
   2. Einmal durch eine 1 ml Insulinspritze (27 G) und in ein 15 ml konisches Rohr hin und her geben. 5 min bei 150 x g bei 4 °C nach unten drehen.
   3. Verwenden Sie Pipetten, um DPBS zu entfernen. Resuspend in 50 l Kellermembranmatrix/Well.
   4. Legen Sie die Platte 30 min in einen 37 °C-Inkubator, damit die Kellermembranmatrix polymerisiert werden kann. Überlagern Sie jeden Brunnen mit 600 l ENR-Medien (Minigut-Medien, 50 ng/ml EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/ml R-Spondin), und geben Sie die Platte dann an den Inkubator zurück.

2. Durchflusszytometrie-Analyse von EdU-positiven Zellen in Enteroiden

ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt den Workflow für die Durchflusszytometrieanalyse von EdU-positiven Zellen in Enteroiden.

1. Inkubation von Enteroiden mit EdU
   1. Wachsen Sie Enteroide von Schritt 1.2.4 für 5–7 Tage. Passage Enteroide in eine neue 24 WellPlatte in einem Spaltverhältnis von 1:2. Fügen Sie jedem Bohrwert 600 l ENR-Medium hinzu. Inkubieren Sie Enteroide für 4 bis 5 Tage in einem 37 °C Inkubator.
   2. Stellen Sie die Kontrollgruppe (unbehandelte Enteroide) und die versuchsweise Gruppe (enteroide behandelt mit 5 ng/ml Interleukin 22 [IL-22]). Bereiten Sie mindestens drei Replikationen für jede Gruppe vor.
   3. Fügen Sie dem ENR-Medium EdU hinzu, um edU-Medium mit einer Konzentration von 50 m vorzubereiten. Fügen Sie jedem Brunnen 600 L EdU-Medium hinzu und inkubieren Sie 2 h in einem 37 °C-Inkubator. Stellen Sie einen Brunnen von Enteroiden ohne EdU-Behandlung als negative Kontrolle für die Hintergrundsubtraktion ein.
2. Ernte von Enteroiden aus der Kellermembranmatrix
   1. Verwenden Sie einen Pipettenregler, um EdU-Medium zu aspirieren und 1x mit DPBS zu waschen. Fügen Sie 1 ml DPBS hinzu.
   2. Verwenden Sie P1000 Pipettenspitze und Pipette nach oben und unten, bis keine festen Kellermembran-Matrix-Stücke übrig bleiben. In ein 15 ml Rohr geben und bei 300 x g für 5 min nach unten drehen.
   3. Fügen Sie 500 l Zelldissoziationsenzyme (Materialtabelle) hinzu und brüten Sie 15 min bei 37 °C. Verwenden Sie P200 Pipettenspitze und Pipette nach oben und unten, um Enteroide in einzelne Zellen zu brechen.
   4. Fügen Sie 3 ml DMEM-Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und wiederholt Ertimette mit einer P1000 Pipettenspitze hinzu.
   5. Drehen Sie bei 300 x g für 5 min und aspirieren Sie das überstande Medium. Setzen Sie die Zellen mit 1 ml DPBS wieder aus.
3. Fixierung und Permeabilisierung von Zellen
   1. Die Zellsuspension in ein 1,5 ml-Rohr geben, bei 300 x g 5 min nach unten drehen und den Überstand entsorgen.
   2. Zellen mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) resuspendieren, 15 min bei Raumtemperatur (RT) fixieren und bei 300 x g für 5 min drehen. Den Überstand mit einer Pipettenspitze ansaugen, 1x mit DPBS waschen und nach unten drehen, um den Überstand zu entfernen.
   3. Zellen mit 1 ml 0,5% nichtionisches Tensid resuspendieren. 10 min bei RT inkubieren.
   4. Drehen Sie bei 300 x g für 5 min und aspirieren Sie den Überstand. Waschen Sie 1x mit DPBS und drehen Sie nach unten, um den Überstand zu entfernen.
4. Detektion von EdU
   1. Bereiten Sie Lagerlösungen für jede Komponente im Voraus vor: 1) Arbeitslösung der Alexa Fluor Azid, 2) Arbeitslösung von 1x EdU-Reaktionspuffer und 3) 10x Stammlösung edU Pufferadditiv.
   2. Bereiten Sie 1x EdU Pufferadditiv vor, indem Sie die 10x Lösung 1:10 in entionisiertem Wasser verdünnen. Bereiten Sie diese Lösung frisch vor.
   3. Bereiten Sie Reaktionscocktail nach Tabelle 1vor.
      HINWEIS: Fügen Sie die Zutaten in der in der Tabelle aufgeführten Reihenfolge hinzu. Verwenden Sie den Reaktionscocktail innerhalb von 15 min der Zubereitung.
   4. Fügen Sie 100 l Reaktionscocktails zu jedem 1,5 ml Schlauch hinzu. Die Zellen wieder aussetzen, vor Licht schützen, 30 min bei RT inkubieren.
   5. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min und saugen Sie die Reaktionslösung mit Pipettenspitze schonend an.
   6. Fügen Sie 0,5% nichtionisches Tensid penetranten zu jedem Rohr, um 1x bei RT zu waschen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min, aspirieren Sie den Überstand mit Pipettenspitze sanft, und setzen Sie die Zellen in 1 ml DPBS.
5. Analyse von Zellen durch Durchflusszytometrie
   1. Filtern Sie die resuspendierten Zellen mit einem 40-m-Sieb und sammeln Sie die gefilterten Zellen mit einem 15 ml konischen Rohr. Führen Sie die FACS-Erkennung am Computer so schnell wie möglich durch.
      HINWEIS: Wenn die Bedingungen begrenzt sind, sollten die zellgefärbten Proben bei 4 °C im Dunkeln gelagert und innerhalb von 3 Tagen durchflussgeprüft werden.
   2. Wählen Sie den entsprechenden Kanal (entsprechend der Art von Alexa Fluor Azid im EdU-Kit; hier roter Kanal) und Spannung (hier, 150–350 V) für die Strömungszytometrie-Analyse.
   3. Gating-Strategie
      1. Zeichnen Sie ein Pseudofarbdiagramm FSC-A (x-Achse) vs. SSC-A (y-Achse) und verteilen Sie die meisten Zellen auf den sichtbaren Bereich der Punktkarte, indem Sie die Spannung anpassen. Wählen Sie die Zellpopulation (R1) aus, und schließen Sie den Zellabfall in der linken unteren Ecke aus.
      2. Erstellen Sie aus der R1-Zellpopulation eine FSC-A (x-Achse) vs. FSC-H (y-Achse) Pseudocolor-Plot, und legen Sie das Tor so fest, dass einzelne Zellen (R2) ausgewählt werden, um Zellklumpen auszuschließen.
      3. Aus der R2-Zellpopulation wird die Fluoreszenzintensität (x-Achse) vs. Zellenzahl (y-Achse) plot, und verwenden Sie das negative Steuerelement, um das Tor festzulegen. Der Bereich des Fluoreszenzsignals ist ein positiver Zellbereich (R3). Vergleichen Sie das Verhältnis von EdU-positiven Zellen (R3) zwischen den Versuchs- und Kontrollgruppen.

3. Durchflusszytometrie Analyse von PI-positiven Zellen in Enteroiden

ANMERKUNG: Abbildung 2 zeigt den Workflow für die Durchflusszytometrieanalyse von PI-positiven Zellen in Enteroiden.

1. Inkubation von enteroiden Zellen mit PI
   1. Wachsen Sie Enteroide von Schritt 1.2.4 für 5–7 Tage. Passage Enteroide in eine neue 24 WellPlatte in einem Spaltverhältnis von 1:2. Fügen Sie jedem Bohrwert 600 l ENR-Medium hinzu. Inkubieren Sie Enteroide für 4 bis 5 Tage in einem 37 °C Inkubator.
   2. Legen Sie die Kontrollgruppe (unbehandelt) und die experimentelle Gruppe (IL-22 behandelt) fest, wobei mindestens drei Replikationen für jede Gruppe verwendet werden.
   3. Fügen Sie PI zum ENR-Medium hinzu, um PI-Medium mit einer Konzentration von 3 M vorzubereiten.
   4. Fügen Sie jedem Brunnen 600 l PI-Medium hinzu und brüten Sie 30 min in einem 37 °C-Inkubator. Stellen Sie einen Brunnen von Enteroiden ohne PI-Behandlung als negative Kontrolle für Die Hintergrundsubtraktion.
2. Ernte enteroide aus der Kellermembranmatrix nach den Schritten 2.2.1-2.2.5.
3. Analyse von Zellen durch Durchflusszytometrie
   1. Filtern Sie die resuspendierten Zellen mit einem 40-m-Sieb und sammeln Sie die gefilterten Zellen mit einem 15 ml konischen Rohr.
   2. Führen Sie die FACS-Erkennung am Computer so schnell wie möglich durch.
      HINWEIS: Wenn die Bedingungen begrenzt sind, sollten die zellgefärbten Proben bei 4 °C im Dunkeln gelagert und innerhalb von 3 Tagen durchflussgeprüft werden.
   3. Wählen Sie den entsprechenden Kanal (hier roter Kanal) und Spannung (hier, 150–350 V) für die Strömungszytometrieanalyse aus.
   4. Verwenden Sie dieselbe Gating-Strategie wie in Abschnitt 2.5.3 beschrieben.

Ergebnisse

Kleine Darmkrypten wurden isoliert und als Enteroide in der Kellermembranmatrix kultiviert. Enteroide begannen 2 Tage nach der Isolation Knospen zu bilden. Am 6. Tag hatten Enteroide viele Knospen mit vielen Schutt (tote Zellen) im Lumen. Enteroide waren in diesem Stadium für den Durchgang bereit (Abbildung 3).

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass entzündliche Zytokine für die Aufrechterhaltung der Darmepithelhomöostase unerlässlich sind. Abnormale Expressi...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die für die Kultur der Enteroide in vitro und die Quantifizierung von EdU- und PI-positiven Zellen in den Enteroiden durch Durchflusszytometrie erforderlich sind. Diese Strategie hat mehrere Vorteile. Erstens wird die EdU-Kennzeichnung verwendet, um vermehrende Zellen in Enteroiden zu erkennen. Im Vergleich zum herkömmlichen BrdU-Test ist die EdU-Kennzeichnungsmethode schneller, empfindlicher und genauer. EdU ist sehr ähnlich zu Thymin (T), das Thymin in der DNA-Synthese währ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Corning	430791
22 G gavage needle	VWR	20068-608
24-well plate	Nunc	142475
40 mm sterile cell strainer	BD	352340
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
70 mm sterile cell strainer	BD	352350
Advanced DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	Invitrogen	A24863
B-27 Supplement	GIBCO	17504044
Buffer 1			2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2			54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life technologies	C10639
CO2 incubator	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO	14190144
D-sorbitol	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR media			Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
Fine Iris Scissors	Tansoole	2037454
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061
Goat Serum	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
Matrigel	Corning	356231
Minigut media			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement	R&D	AR009
Nonionic surfactant (Triton X)	BBI	TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm)	Tansoole	2025785
Paraformaldehyde (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Phase contrast microscope	Nikon	TS1000
Propidium iodide	Sigma	P4170-25MG
Recombinant EGF	PeproTech	315-09
Recombinant Mouse Noggin	PeproTech	250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1	R&D	3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22	PeproTech	210-22-10
Sucrose	BBI	SB0498
Tissue Forceps	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049