Antibiotika-Dereplikation mit der Antibiotikaresistenzplattform

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Plattform, die eine Bibliothek von isogenen antibiotikaresistenten Escherichia coli für die Dereplikation von Antibiotika nutzt. Die Identität eines von Bakterien oder Pilzen produzierten Antibiotikums kann durch das Wachstum von E. coli abgeleitet werden, das sein jeweiliges Resistenzgen ausdrückt. Diese Plattform ist wirtschaftlich effektiv und zeiteffizient.

Zusammenfassung

Eine der größten Herausforderungen bei der Suche nach neuen Antibiotika aus Naturproduktextrakten ist die Wiederentdeckung gängiger Verbindungen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird die Dereplikation, d. h. der Prozess der Identifizierung bekannter Verbindungen, an Voninteresse steilenProben durchgeführt. Methoden zur Dereplikation wie die analytische Trennung gefolgt von der Massenspektrometrie sind zeitaufwändig und ressourcenintensiv. Um den Dereplikationsprozess zu verbessern, haben wir die Antibiotikaresistenzplattform (ARP) entwickelt. Die ARP ist eine Bibliothek von etwa 100 Antibiotikaresistenzgenen, die einzeln in Escherichia coli geklont wurden. Diese Stammsammlung hat viele Anwendungen, einschließlich einer kostengünstigen und einfachen Methode für die Dereplikation von Antibiotika. Der Prozess beinhaltet die Fermentation von antibiotikaproduzierenden Mikroben auf der Oberfläche von rechteckigen Petrischalen, die festes Medium enthalten, wodurch die Sekretion und Diffusion von sekundären Metaboliten durch das Medium ermöglicht wird. Nach einer 6-tägigen Fermentationsphase wird die mikrobielle Biomasse entfernt und der Petrischale wird ein dünnes Agar-Overlay hinzugefügt, um eine glatte Oberfläche zu schaffen und das Wachstum der E. coli-Indikatorstämme zu ermöglichen. Unsere Sammlung von ARP-Stämmen wird dann auf die Oberfläche der antibiotikahaltigen Petrischale gepinnt. Die Platte wird als nächstes über Nacht inkubiert, um E. coli-Wachstum auf der Oberfläche der Überlagerung zu ermöglichen. Nur Stämme, die Resistenzen gegen ein bestimmtes Antibiotikum (oder eine bestimmte Klasse) enthalten, wachsen auf dieser Oberfläche, was eine schnelle Identifizierung der produzierten Verbindung ermöglicht. Diese Methode wurde erfolgreich zur Identifizierung von Herstellern bekannter Antibiotika und als Mittel zur Identifizierung der Hersteller neuartiger Verbindungen eingesetzt.

Einleitung

Seit der Entdeckung von Penicillin im Jahr 1928 haben sich natürliche Produkte aus Umweltmikroorganismen als reiche Quelle antimikrobieller Verbindungen erwiesen¹. Ungefähr 80% der Natürlichen Produkte Antibiotika werden von Bakterien der Gattung Streptomyces und anderen Actinomycetes abgeleitet, während die restlichen 20% von Pilzarten produziert werden¹. Einige der häufigsten Antibiotika-Gerüste, die in der Klinik verwendet werden, wie die Lactams, Tetracycline, Rifamycine und Aminoglykoside, wurden ursprünglich aus Mikroben isoliert². Aufgrund des Anstiegs von multiresistenten (MDR) Bakterien ist unser aktuelles Antibiotika-Panel in der Behandlung^3,4weniger wirksam geworden. Dazu gehören die "ESKAPE"-Erreger (d.h. vancomycinresistente Enterokokken und Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, und Enterobacter sp.), die eine Teilmenge von Bakterien sind, die von einer Reihe wichtiger Gesundheitsbehörden wie der Weltgesundheitsorganisation^3,4,5als mit dem höchsten Risiko assoziiert angesehen werden. Das Aufkommen und die weltweite Ausbreitung dieser MDR-Erreger führen zu einem konstanten Bedarf an neuartigen Antibiotika^3,4,5. Bedauerlicherweise haben die letzten zwei Jahrzehnte gezeigt, dass die Entdeckung neuartiger Antibiotika aus mikrobiellen Quellen immer schwieriger wird⁶. Aktuelle Ansätze zur Arzneimittelentdeckung umfassen das Hochdurchsatz-Screening von bioaktiven Verbindungen, einschließlich Natürlicherextraktbibliotheken, so dass Tausende von Extrakten zu einem bestimmten Zeitpunkt getestet werden können². Sobald jedoch antimikrobielle Aktivität erkannt wird, besteht der nächste Schritt darin, den Inhalt des Rohextrakts zu analysieren, um die aktive Komponente zu identifizieren und diejenigen zu beseitigen, die bekannte oder redundante Verbindungen enthalten^7,8. Dieser Prozess, der als Dereplikation bezeichnet wird, ist von entscheidender Bedeutung, um die Zeit, die für die Wiederentdeckung bekannter Antibiotika aufgewendet wird, zu verhindern und/oder erheblich zu reduzieren^7,9. Obwohl ein notwendiger Schritt in der Entdeckung von Naturprodukten, Ist die Dereplikation notorisch mühsam und ressourcenintensiv¹⁰.

Seit Beutler et al. den Begriff "Dereplikation" erstmals geprägt haben, wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um innovative Strategien zur schnellen Identifizierung bekannter Antibiotika zu entwickeln^11,12. Heute sind die häufigsten Werkzeuge für die Dereplikation analytische chromatographische Systeme wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Kernspinresonanz-basierte Detektionsmethoden^11,13. Leider erfordert jede dieser Methoden den Einsatz teurer Analysegeräte und ausgeklügelter Dateninterpretation.

In dem Versuch, eine Dereplikationsmethode zu entwickeln, die schnell ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden kann, haben wir die Antibiotikaresistenzplattform (ARP)¹⁰eingerichtet. Die ARP kann für die Entdeckung von Antibiotika-Adjuvantien, die Profilierung neuer Antibiotika-Verbindungen gegen bekannte Resistenzmechanismen und die Dereplikation bekannter Antibiotika in Extrakten aus Aktinobakterien und anderen Mikroben verwendet werden. Hier konzentrieren wir uns auf seine Anwendung bei der Dereplikation von Antibiotika. Die ARP nutzt eine Bibliothek von isogenen Escherichia coli-Stämmen, die individuelle Resistenzgene exdrücken, die gegen die am häufigsten wiederentdeckten Antibiotika^14,15wirksam sind. Wenn die E. coli-Bibliothek in Gegenwart eines sekundären Metaboliten produzierenden Organismus angebaut wird, kann die Identität der Verbindung durch das Wachstum von E. coli-Stämmen abgeleitet werden, die das zugehörige Resistenzgen¹⁰ausdrücken. Als die ARP zum ersten Mal gemeldet wurde, bestand die Bibliothek aus >40 Genen, die eine Resistenz für 16 Antibiotikaklassen verliehen. Die ursprüngliche Dereplikationsvorlage wurde entwickelt, um eine Teilmenge von Resistenzgenen pro Antibiotikaklasse zu umfassen, um Informationen über die Unterklasse von Antibiotika während des Dereplikationsprozesses bereitzustellen. Heute besteht die ARP aus >90 Genen, die 18 Antibiotikaklassen Resistenzen verleihen. Mit unserer umfangreichen Sammlung von Resistenzgenen wurde eine sekundäre Dereplikationsvorlage entwickelt, die als minimale Antibiotikaresistenzplattform (MARP) bekannt ist. Diese Vorlage wurde erstellt, um Genredundanz zu beseitigen und einfach Informationen über die allgemeine Antibiotikaklasse bereitzustellen, mit der ein dereplizierter Metabolit verwandt ist. Darüber hinaus besitzt die MARP-Vorlage sowohl Wildtyp als auch einen hyperpermeablen/efflux-defizienten Stamm von E. coli BW25113 (E. coli BW25113 nutzt die hyperpermeable Sorte. Dieser einzigartige Aspekt erzeugt zusätzliche Phänotypen während der Dereplikation, was auf eine Verbindungen Fähigkeit, die äußere Membran von Gram-negativen Bakterien zu überqueren. Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll, das bei der Dereplikation mit dem ARP und/oder MARP zu befolgen ist, heben die wichtigsten Schritte hervor, die befolgt werden müssen, und besprechen die verschiedenen möglichen Ergebnisse.

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Protokoll

1. Herstellung von E. coli Bibliothek Glycerin Bestände (von Agar Slants)

1. Streichen Sie die ARP/MARP E. coli-Stämme aus Lysogeny-Brühe (LB) Agar schräg auf Petrischalen, die LB-Agar und den entsprechenden wählbaren Marker enthalten (Tabelle 1).
2. Bereiten Sie Kulturen für jede der E. coli-Stämme vor, indem Sie 3 ml LB impfen, die den entsprechenden wählbaren Marker mit einer einzigen Kolonie enthalten. Über Nacht bei 37 °C mit Belüftung (250 Rpm) wachsen.
3. Kombinieren Sie 800 l Kultur und 200 l steriles 80% Glycerin in einem 1,8 ml Kryovial. Mischen Sie die Rohre 3 bis 4 Mal, und lagern Sie bei -80 °C.

2. ARP/MARP Frozen Stock Library Plattenvorbereitung

1. Streichen Sie die ARP/MARP-Stämme aus den in Abschnitt 1 zubereiteten Glycerinbeständen auf einen neuen Satz Petrischalen, die LB-Agar und den entsprechenden wählbaren Marker enthalten. Über Nacht bei 37 °C wachsen.
2. Mit aseptischer Technik passte die Pipette 500 l kationens auf die Müller Hinton Brühe (MHB) aus einem sterilen Reservoir in jeden Brunnen einer sterilen 96-Tiefenbrunnenplatte.
3. Mit den in Schritt 2.1 vorbereiteten Platten verwenden Sie einen Applikatorstab, um die 96-Tiefe-Brunnenplatte gemäß der ARP/MARP-Karte zu impfen (Ergänzende Abbildung 1 und Ergänzende Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass jedem Brunnen der entsprechende wählbare Marker hinzugefügt wird. Legen Sie eine atmungsaktive Dichtmembran über die Oberfläche der Tiefbrunnenplatte und bebrüten Sie sie über Nacht bei 37 °C (250 Umdrehungen pro Minute).
4. Stellen Sie sicher, dass keine kontaminierten Brunnen vorhanden sind, indem Sie auf die ARP/MARP-Karte verweisen. Wiederholen Sie dies, wenn sie kontaminiert sind. Übertragen Sie mit einem Mehrkanal-Pipettor 100 l von jedem Brunnen der Tiefenbrunnenplatte auf eine sterile 96-Well-Rundbodenplatte. Wiederholen Sie diesen Schritt, um mehrere eingefrorene Lagerbibliotheksplatten zu erstellen.
   HINWEIS: Es ist am besten, mindestens 5 Bibliotheksplatten gleichzeitig vorzubereiten, um die Wiederholung der Schritte 2.1-2.4 im Falle einer Kontamination der Tiefkühl-Bibliotheksplatte zu verhindern.
5. Beenden Sie die Herstellung der ARP/MARP gefrorenen LagerbibliothekPlatten durch Pipettieren 100 l steriles 50% Glycerin in jeden Brunnen und mischen durch sanftepipetting nach oben und unten.
6. Bedecken Sie die Platten mit sterilen Aluminiumdichtungen und sorgen Sie dafür, dass jeder Brunnen einzeln versiegelt ist.
7. Nummerieren Sie die Platten und widmen Sie nur ein gefrorenes Stockbibliotheksschild, um neue Vorlagen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu impfen. Bewahren Sie den Rest als Back-ups bei Kontamination der Tiefkühlplattenplatte auf.
8. Den Plattendeckel auf die Aluminiumdichtung legen und bei -80 °C lagern.

3. Saatgutkultur und Dereplikationsplattenvorbereitung

1. Mit einem Applikatorstab 3 ml Streptomyces-Antibiotikum-Medium (SAM) (oder ein anderes geeignetes Medium für den untersuchten Organismus) in einem Reagenzglas impfen, das eine sterile Glasperle (zum Aufbrechen des Myzels) mit dem produzierenden Stamm enthält, der derepiert werden. Für Streptomyces, vorsichtig kratzen Sporen von der Oberfläche einer Kolonie.
2. Mit dem gleichen hölzernen Applikator-Stick, streifen Sie eine Sterilitätskontrolle auf einer Petrischale mit Bennetts Agar.
3. Inkubieren Sie die Samenkultur bei 30 °C mit Belüftung für 6 Tage (250 Rpm) und inkubieren Sie die Sterilitätskontrollplatte bei 30 °C für 6 Tage.
   HINWEIS: Siehe Tabelle 2 für SAM und Bennetts Medienrezepte. Die obigen Anweisungen sind für die meisten Actinomycetes geeignet. Ändern Sie Wachstumsmedien, wie sie für andere Bakterien und Pilze notwendig sind.
4. Bereiten Sie Dereplikationsplatten vor, indem Sie 23 ml warmen Bennett-Agar in eine serologische Pipette einschließen und 20 ml gleichmäßig über die Oberfläche einer rechteckigen Petrischale(Materialtisch)verteilen, so dass der Rest des Mediums in der Pipette bleibt, um dies zu verhindern Luftblasenbildung.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche, die zum Gießen von Platten verwendet wird, eben ist, und führen Sie diesen Schritt aus, bevor der Agar zu stark abgekühlt ist; eine flache Oberfläche ist für das Anheften der Bibliothek in den nächsten Phasen unerlässlich.
5. Drehen Sie die Platte vorsichtig, bis das Medium alle Bereiche der Platte abdeckt und sie nicht stört, bis der Agar vollständig eingestellt ist.
6. Bereiten Sie Nitrozellulose-Membranplatten(Materialtabelle) vor, indem Sie einen rechteckigen Petrischalendeckel als Rückverfolgungsschablone verwenden, damit die Platten an die Oberfläche der Dereplikationsplatte passen. Schneiden Sie die Blätter und autoklavieren Sie sie in einem sterilen Beutel.
   HINWEIS: Diese Membran ermöglicht es Organismen, auf ihrer Oberfläche zu sporulaten, während sekundäre Metaboliten in das Medium unten ausgeschieden werden können. Nach dem Anbau wird die Membran entfernt, um eine saubere Oberfläche für die Dereplikation zu schaffen. Je enger das Membranpapier auf der Oberfläche des Bennett-Agars passt, desto sauberer entsteht die Dereplikation.
7. Überprüfen Sie die Sterilitätskontrollplatte, um sicherzustellen, dass nach 6 Tagen Inkubation keine Verunreinigungen vorhanden sind. Wenn kontaminationsfrei, entfernen Sie den Deckel der rechteckigen Petrischale und Pipette 200 L der Samenkultur auf die Oberfläche des Bennett-Agars.
8. Gleichmäßig die Kultur über die Oberfläche der gesamten Platte mit einem sterilen Wattestäbchen verteilen.
9. Legen Sie die in Schritt 3.6 vorbereitete Nitrocellulosemembran über der Kultur auf die Oberfläche der Petrischale. Beginnen Sie, indem Sie den unteren Rand der Membran am unteren Rand der Petrischale ausrichten, und wenden Sie die Membran langsam vom unteren Rand bis zum oberen Rand der Platte an.
10. Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um Luftblasen zu glätten, die sich zwischen der Membran-Agar-Schnittstelle gebildet haben könnten, um sicherzustellen, dass die Membran bündig zum Agar ist.
11. Legen Sie den Deckel wieder auf die rechteckige Petrischale und legen Sie ihn kopfüber in eine versiegelte Plastiktüte. 6 Tage bei 30 °C inkubieren.

4. Dereplikationsplatte MHB-Overlay und ARP/MARP-Bibliotheksplattenvorbereitung

1. Entfernen Sie nach 6 Tagen die Dereplikationsplatte aus dem 30 °C-Inkubator. Entfernen Sie mit steriler Pinzette (autoklaviert oder gründlich mit 70% Ethanol gesprüht) die Nitrocellulosemembran vorsichtig von der Oberfläche des Bennett-Agars.
   HINWEIS: Dieser Schritt wird die hydrophoben Sporen und Mycelia auf der Oberfläche der Membran gewachsen entfernen, um eine saubere Oberfläche für die Dereplikation zu bieten, was Schritt 4.2 erleichtert.
2. Wie in Schritt 3.4 beschrieben, stellen Sie sicher, dass die Arbeitsfläche eben ist, und verwenden Sie eine serologische Pipette, um 23 ml warmkationsangepassten MHB-Agar zu aspirieren. Erstellen Sie eine Überlagerung, indem Sie 20 ml gleichmäßig über die Oberfläche der Dereplikationsplatte verteilen, sodass der Rest des Mediums in der Pipette bleibt, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.
3. Drehen Sie die Platte vorsichtig, bis das Medium alle Bereiche abdeckt und stört sie nicht, bis der Agar vollständig eingestellt ist. Nach dem Abkühlen und Erstarren die Dereplikationsplatte in den versiegelten Plastikbeutel zurückgeben und über Nacht bei 4 °C aufbewahren.
   HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Diffusion von sekundären Metaboliten aus dem fermentierten Bennett-Medium in die MHB-Agar-Overlay. Wenn die Nitrocellulosemembran nicht richtig vorbereitet wurde, wird es sporendes Wachstum an den Rändern der Platte geben, die hydrophobe Eigenschaften haben, die den MHB-Agar abstoßen. Gießen Sie die Überlagerung nicht auf diese Sporen, da sie zu einer Kontamination der Überlagerung führen kann.
4. Am selben Tag, an dem die Überlagerung gegossen wird, impfen Sie eine frische ARP/MARP-Schablone, indem Sie 100 l Kation enden, die MHB in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte einstellt.
   HINWEIS: Um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination während der Dereplikation zu verringern, verwenden Sie eine einzige ARP/MARP-Bibliotheksplatte, um nur 2-3 Dereplikationsplatten zu derepieren. Impfen Sie daher genügend 96-Well-ARP/MARP-Platten basierend auf der Anzahl der Stämme, die derepiert werden.
5. Nehmen Sie die gefrorene Lagerplatte ARP/MARP aus dem -80 °C Gefrierschrank. Entfernen Sie die Aluminiumdichtung, bevor sich auf der Unterseite Kondensation bildet, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wird, benachbarte Brunnen in der Bibliotheksplatte zu kontaminieren.
6. Mit sterilen 96-Well-Pinning-Werkzeugen (oder anderen Formen von Impfgeräten) werden Sie sorgfältig aus dem gefrorenen ARP/MARP-Bibliotheksteller anheften und die frischen MHB-haltigen 96-Well-Platten impfen. Um die Kontamination während der Dereplikation zu minimieren, bereiten Sie so viele ARP- oder MARP-Bibliotheksplatten vor, die nur für die Dereplikation von 2-3 Dereplikationsplatten pro Bibliotheksplatte erforderlich sind. Sterilisieren Sie Pinning-Werkzeuge zwischen der Impfung jeder Platte.
7. Legen Sie eine neue sterile Aluminiumdichtung auf die gefrorene Schablone, sobald sie fertig ist, und geben Sie sie in den -80 °C-Gefrierschrank zurück. Die geimpften 96-Well-Platten in eine versiegelte Plastiktüte geben und bei 37 °C mit Belüftung (250 U/min) für 18 h bebrüten.
   HINWEIS: Aus diesem Schritt können neue gefrorene Lagerbibliotheksplatten hergestellt werden, ohne sicherzustellen, dass keine Kontamination vorliegt. Glycerin auf die Platte geben, bevor Sie bei -80 °C lagern, wie in Schritt 2.5 beschrieben.

5. Dereplikierung mit dem ARP/MARP

1. Entfernen Sie die ARP/MARP-Vorlage aus dem Inkubator, und stellen Sie sicher, dass keine Verunreinigungen vorhanden sind. Immer mit einer Vorlage derepieren, die frisch zubereitet wird und nicht direkt aus dem gefrorenen Lager.
2. Entfernen Sie die Dereplikationsplatten von 4 °C und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausrichten. Wenn es Kondensation gibt, öffnen Sie die Deckel und lassen Sie in einer sterilen Umgebung trocknen.
3. Mit sterilen Pinning-Werkzeugen (oder anderen Impfgeräten) von der ARP/MARP-Bibliotheksplatte auf die Oberfläche der MHB-Agar-Überlagerung der Dereplikationsplatten. Achten Sie darauf, den Agar nicht zu durchstechen. Sterilisieren Sie Pinning-Werkzeuge zwischen der Impfung jeder Dereplikationsplatte.
4. Nach dem Anheften der Schablone auf die Oberfläche der Dereplikationsplatten, lassen Sie die Schablone inoculum für 3-5 min trocknen. Legen Sie die geimpften Dereplikationsplatten kopfüber in einen versiegelten Plastikbeutel und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C.
5. Analysieren Sie die Ergebnisse der Dereplikation am nächsten Tag, indem Sie das Wachstum auf der Dereplikationsplatte mit Bohrungen vergleichen, die der ARP/MARP-Karte entsprechen (Tabelle 3 und Tabelle 4).

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Ergebnisse

Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt, als eine Sammlung von antibiotikaproduzierenden Stämmen von Interesse mit dem ARP und/oder MARP derepliziert wurde.

Ein Diagramm des ARP/MARP-Dereplikationsworkflows ist in Abbildung 1dargestellt, und Bibliotheksplattenkarten sind in Ergänzenden Abbildung1 und Ergänzenden Abbildung 2dargestellt. Abbildung 2 zeigt ein positives Dereplikationsergebnis, bei dem...

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Diskussion

Das oben beschriebene Protokoll kann sowohl auf die Entdeckung neuartiger antimikrobieller Verbindungen als auch auf Hilfsstoffe angewendet werden, die in Verbindung mit bestehenden Antibiotika zur Rettung ihrer Aktivität verwendet werden können. Die Plattform nutzt die hohe Substratspezifität von Resistenzmechanismen und deren Kognatenantibiotika, um Verbindungen in rohen Naturproduktextrakten zu dereplizieren. Obwohl die Fürdieherzustellenszeit benötigte Zeit lang ist (ca. 2 Wochen), ist der Dereplikationsprozess ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92 mm x 16 mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	-	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2