In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zum Nachweis der Produktion extrazellulärer Makrophagen (MET) in der Lebendzellkultur mittels Mikroskopie und Fluoreszenzfärbung vorgestellt. Dieses Protokoll kann weiter erweitert werden, um spezifische MET-Proteinmarker durch Immunfluoreszenzfärbung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Freisetzung von extrazellulären Fallen (ETs) durch Neutrophile wurde als ein Faktor zur Entwicklung von Krankheiten im Zusammenhang mit chronischen Entzündungen identifiziert. Neutrophile ETs (NETs) bestehen aus einem Netz aus DNA, Histonproteinen und verschiedenen Granulatproteinen (z. B. Myeloperoxidase, Elastase und Kathepsin G). Andere Immunzellen, einschließlich Makrophagen, können auch ETs produzieren; Inwieweit dies jedoch in vivo geschieht und ob extrazelluläre Makrophagenfallen (METs) in pathologischen Mechanismen eine Rolle spielen, wurde jedoch nicht im Detail untersucht. Um die Rolle von METs bei entzündlichen Pathologien besser zu verstehen, wurde ein Protokoll zur Visualisierung der MET-Freisetzung aus primären menschlichen Makrophagen in vitro entwickelt, das auch in Immunfluoreszenzexperimenten genutzt werden kann. Dies ermöglicht eine weitere Charakterisierung dieser Strukturen und deren Vergleich mit ETs, die von Neutrophilen freigesetzt werden. Humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen (HMDM) produzieren METs bei Exposition gegenüber verschiedenen entzündlichen Reizen nach Differenzierung zum m1-pro-inflammatorischen Phänotyp. Die Freisetzung von METs kann durch Mikroskopie mit einem grünen fluoreszierenden Nukleinsäurefleck visualisiert werden, der für lebende Zellen impermeant ist (z.B. SYTOX grün). Die Verwendung von frisch isolierten primären Makrophagen, wie HMDM, ist vorteilhaft bei der Modellierung von in vivo entzündlichen Ereignissen, die für potenzielle klinische Anwendungen relevant sind. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die MET-Freisetzung von menschlichen Monozytenzelllinien (z. B. THP-1) nach Differenzierung in Makrophagen mit phorbolmyristateacetat oder anderen Makrophagenzelllinien (z. B. die murinen Makrophagen-ähnlichen J774A.1-Zellen) zu untersuchen.

Einleitung

Die Freisetzung von ETs aus Neutrophilen wurde zuerst als angeborene Immunantwort identifiziert, die durch eine bakterielle Infektion ausgelöst wurde¹. Sie bestehen aus einem DNA-Rückgrat, an das verschiedene Granulatproteine mit antibakteriellen Eigenschaften gebunden sind, einschließlich neutrophiler Elastase und Myeloperoxidase². Die primäre Rolle von neutrophilen ETs (NETs) besteht darin, Krankheitserreger zu erfassen und deren Eliminierung zu erleichtern³. Neben der schützenden Rolle von ETs in der Immunabwehr haben jedoch immer mehr Studien eine Rolle bei der Pathogenese von Krankheiten entdeckt, insbesondere bei der Entwicklung von entzündungsgetriebenen Erkrankungen (z. B. rheumatoide Arthritis und Arteriosklerose⁴). Die Freisetzung von ETs kann durch verschiedene pro-inflammatorische Zytokine ausgelöst werden, einschließlich Interleukin 8 (IL-8) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF)^5,6, und die lokalisierte Anhäufung von ETs kann Gewebeschäden erhöhen und pro-entzündliche Reaktion⁷. Zum Beispiel, ETs wurden als eine kausale Rolle in der Entwicklung von Arteriosklerose⁸beteiligt , Förderung der Thrombose⁹, und Vorhersage kardiovaskulären Risiko¹⁰.

Es ist nun anerkannt, dass neben Neutrophilen auch andere Immunzellen (d. h. Mastzellen, Eosinophile und Makrophagen) ETs bei Exposition gegenüber der mikrobiellen oder pro-inflammatorischen Stimulation freisetzen können^11,12. Dies kann besonders bei Makrophagen von Bedeutung sein, wenn man ihre Schlüsselrolle bei der Entwicklung, Regulierung und Lösung chronischer entzündlicher Erkrankungen berücksichtigt. Daher ist es wichtig, ein besseres Verständnis der potenziellen Beziehung zwischen DER FREISETZUNG von ET aus Makrophagen und der entwicklung von entzündungsbedingten Krankheiten zu gewinnen. Jüngste Studien haben das Vorhandensein von METs und NETs in intakten menschlichen atherosklerotischen Plaques und organisierten Thromben¹³gezeigt. In ähnlicher Weise wurden METs in die Fahrt nierenverletzung durch die Regulierung von Entzündungsreaktionen¹⁴verwickelt. Im Gegensatz zu Neutrophilen gibt es jedoch begrenzte Daten über die Mechanismen der MET-Bildung aus Makrophagen. Jüngste Studien mit menschlichen In-vitro-Modellen der MET-Bildung zeigen einige Unterschiede in den Pfaden, die an jedem Zelltyp beteiligt sind (d. h. in Bezug auf das Fehlen einer Histon-Zitrullination mit Makrophagen)⁶. Einige haben jedoch gezeigt, dass NET-Freisetzung auch ohne Histon-Citrullination¹⁵auftreten kann.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine einfache und direkte Methode zur Bewertung der MET-Freisetzung in einem klinisch relevanten Makrophagenmodell bereitzustellen. Es gibt eine Reihe von verschiedenen In-vitro-Makrophagenzellmodellen, die verwendet wurden, um METs zu untersuchen (d. h. die THP-1 menschliche Monozytenzelllinie und verschiedene murine Makrophagenzelllinien)¹⁶. Diesen Modellen sind einige Einschränkungen zugeordnet. Beispielsweise erfordert die Differenzierung von THP-1-Monozyten zu Makrophagen in der Regel einen Grundierungsschritt, wie z. B. die Zugabe von Phorbolmyristateacetat (PMA), das selbst Proteinkinase C (PKC)-abhängige Pfade aktiviert. Dieser Prozess ist dafür bekannt, ET-Freisetzung⁴ auszulösen und führt zu einer niedrigen basalen MET-Freisetzung aus THP-1-Zellen. Andere Studien haben einige Unterschiede in der Bioaktivität und Entzündungsreaktionen durch Makrophagen in vivo im Vergleich zu PMA-behandelten THP-1-Zellen¹⁷hervorgehoben.

In ähnlicher Weise stellen das Verhalten und die entzündlichen Reaktionen verschiedener muriner Makrophagen-ähnlicher Zelllinien das Reaktionsspektrum der primären menschlichen Makrophagen¹⁸nicht vollständig dar. Daher wird für die Untersuchung der Makrophagen-ET-Bildung im klinischen Umfeld angenommen, dass primäre humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen (HMDMs) eher ein relevanteres Modell als monozytäre oder murine makrophagenähnliche Zelllinien sind.

Die ET-Freisetzung von M1 polarisierten HMDMs wurde nach der Exposition dieser Zellen gegenüber einer Reihe verschiedener entzündlicher Reize, einschließlich der myeloperoxidase-abgeleiteten oxidanten Hypochlorsäure (HOCl), PMA, TNF und IL-8^6,nachgewiesen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, um HMDMs zum M1-Phänotyp zu polarisieren und die nachfolgende MET-Freisetzung bei Exposition gegenüber diesen entzündlichen Reizen zu visualisieren. PMA wird als Stimulus der MET-Freisetzung verwendet, um Vergleiche mit früheren Studien zu erleichtern, die Neutrophile verwendet haben. Wichtig ist, dass HOCl, IL-8 und TNF auch verwendet werden, um die MET-Freisetzung zu stimulieren, die als bessere Modelle der entzündlichen Umgebung in vivo geglaubt werden. Die mikroskopische Methode zur Visualisierung der ET-Freisetzung beinhaltet die Färbung der extrazellulären DNA in lebenden Zellkulturen mit SYTOX-Grün, einem undurchlässigen fluoreszierenden grünen Nukleinsäurefleck, der in früheren Neutrophilenstudien erfolgreich angewendet wurde. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und qualitative Bewertung der ET-Freisetzung, ist jedoch nicht als eigenständige Methode für die Quantifizierung der ET-Freisetzungsausdehnung geeignet. Es sollte eine alternative Methodik angewandt werden, wenn eine Quantifizierung erforderlich ist, um den Umfang der ET-Freisetzung zu vergleichen, die sich aus unterschiedlichen Behandlungsbedingungen oder Interventionen ergibt.

Protokoll

Die HMDM wurden von menschlichen, buffy Mantelpräparaten isoliert, die von der Blutbank mit ethischer Genehmigung des Sydney Local Health District geliefert wurden.

1. HMDM Kultur

1. Isolieren Sie die Monozyten aus buffy Mantelpräparaten aus dem peripheren Blut von gesunden menschlichen Spendern mit einem kommerziell erhältlichen Präparat zur Isolierung von Lymphozyten, gefolgt von gegenläufiger Zentrifugalelutriation^{19, 20}.
2. Bestätigen Sie das Vorhandensein von Monozyten durch Zytospinnen und Färben mit modifiziertem Giemsa-Färbung für Monozytencharakterisierung¹⁹.
3. Passen Sie unter sterilen Bedingungen die Dichte von Monozyten auf 1 x 10⁶ Zellen/ml mit RPMI-1640-Medien ohne Serum an. Fügen Sie 1 ml dieser Zellsuspension zu jedem Brunnen einer 12 Brunnengewebekulturplatte hinzu. Kultur in einem Zellinkubator bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 für 2 h, um die Einhaltung der Gewebekulturplatte zu fördern.
4. Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen die Zellmedien und ersetzen Sie sie durch vollständige RPMI-1640-Kulturmedien, die 10% (v/v) gepooltes menschliches Serum und 20 mM L-Glutamin enthalten.
5. Kultur die Zellen bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator für 8 Tage, wechseln die Medien alle 2 Tage.

2. Polarisation von HMDM

1. Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen die M1-Grundierungsmedien vor, indem Sie dem gesamten RPMI-1640-Kulturmedium Interferon (IFN; 20 ng/ml) und Lipopolysaccharid (LPS; 1 g/ml) zusetzen. Bereiten Sie die M2-Grundierungsmedien vor, indem Sie Interleukin 4 (IL-4; 20 ng/mL) zu den gesamten RPMI-1640-Kulturmedien hinzufügen.
2. Unter sterilen Bedingungen, Aspirat Medien aus der Gewebekultur Platte Brunnen, die die HMDM enthalten, die gesät und kultiviert wurden, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
3. Waschen Sie die Brunnen, die die Zellen enthalten, 3x mit sterilem PBS (vorgewärmt auf 37 °C) sorgfältig mit 1 ml Aliquots PBS.
4. Fügen Sie 1 ml des M1- oder M2-Grundiermediums zu jedem Brunnen hinzu, der das HMDM enthält (je nach Bedarf für das Experiment).
5. Inkubieren Sie die Zellen für 48 h bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator.

3. Stimulation von HMDM zur Induzieren von MET Release

1. Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen die Kulturmedien mit verschiedenen Stimulatoren der MET-Freisetzung (je nach Experiment) auf das gesamte RPMI-1640-Medium vor: PMA (25 nM), humanes rekombinantes TNF (25 ng/mL) oder humanes Rekombinantilen (50 ng/ml) ).
2. Für Experimente mit HOCl-Stimulation bereiten Sie HOCl (200 m) in HBSS (vorgewärmt auf 37 °C), unmittelbar vor der Zugabe zu den Zellen vor. Stellen Sie sicher, dass der HOCl nicht in vollständigen Zellmedien vorbereitet ist.
   HINWEIS: Die Konzentration der Stammlösung von HOCl wird quantifiziert, indem die UV-Absorption der Lösung bei 292 nm und pH = 11⁶ gemessen und ein Aussterbekoeffizient von 350 M^-1cm^-121verwendet wird.
3. Nach der in Abschnitt 2 beschriebenen Polarisationsbehandlung die Zellmedien aus jedem Brunnen aspirieren und die Zellen 3x mit 1 ml Aliquots von entweder: sterilen PBS (für PMA, TNF und IL-8) oder HBSS (für HOCl) sorgfältig waschen, die auf 37 °C vorgewärmt wurden.
4. Für Experimente mit PMA, TNF oder IL-8: 1 ml des gesamten Mediums hinzufügen, das PMA, TNF oder IL-8 enthält, nachdem das PBS im letzten Waschschritt entfernt wurde.
5. Für Experimente mit TNF a inkubieren Sie die Zellen für 6 h bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator. Für Experimente mit PMA und IL-8 die Zellen 24 h bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator inkubieren.
6. Für Experimente mit HOCl 1 ml HOCl in HBSS hinzufügen, nachdem sie die HBSS im letzten Waschschritt entfernt haben. Dann inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator.
   1. Saugen Sie den Zellüberstand vorsichtig an und waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml Aliquots von HBSS, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
   2. Nachdem Sie den HBSS aus dem letzten Waschschritt entfernt haben, fügen Sie 1 ml vollständige RPMI-1640-Kulturmedien hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator.

4. Visualisierung von MET in Live Cell Culture

1. Bereiten Sie SYTOX grünen Farbstoff in HBSS mit einer Konzentration von 40 m vor.
2. Am Ende der in Abschnitt 3 beschriebenen Behandlungen zur Induktion der MET-Freisetzung fügen Sie jedem, der HMDM enthält, direkt 25 l von 40 m des Farbstoffs zu.
3. Inkubieren Sie Zellen bei Raumtemperatur (RT) für 5 min im Dunkeln.
4. Stellen Sie das HMDM in Gewebekulturbrunnen auf die Mikroskopstufe eines invertierten Fluoreszenzmikroskops für die Bildgebung.
5. Mikroskopverfahren
   1. Schalten Sie eine Breitspektrum-Leuchtstofflichtquelle, eine Hellfeldlichtquelle und ein invertiertes Mikroskop ein, das mit einer hochauflösenden Farb-Digitalkamera installiert ist (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Drehen Sie das Filterrad auf die "Zahl 2" Position für grüne Fluoreszenz (Erregung = 504 nm, Emission = 523 nm) für die Abbildung der grün gebeiztproben in den Gewebekulturbrunnen enthalten.
   3. Mit dem 5x Objektiv, fokussieren Sie das Bild mit dem groben Fokus, dann die feinen Fokusknöpfe auf dem Mikroskop, bis das Bild scharf, klar und fokussiert erscheint, wenn es durch das Mikroskop Okular betrachtet wird.
   4. Schalten Sie das Mikroskop in den Kameramodus.
   5. Starten Sie die zugehörige Software.
   6. Wählen Sie die Registerkarte Erfassen in der Software aus.
   7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe, um eine Vorschau des Bildes anzuzeigen, und passen Sie den Feinfokusknopf am Mikroskop an, bis das Bild im Software-Vorschaufenster scharf, klar und fokussiert erscheint.
   8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen.
      HINWEIS: Das aufgenommene Bild wird automatisch in der begleitenden Software angezeigt.
   9. Klicken Sie innerhalb der Software auf Datei | Speichern als erforderlicher Bilddateityp.
   10. Drehen Sie das Filterrad auf dem Mikroskop in die Position "Nummer 5" für die Lichtfeldabbildung und wiederholen Sie die Schritte 4.5.2–4.5.9, um das entsprechende Hellfeldbild zu erhalten.
   11. Wiederholen Sie die Schritte 4.5.2–4.5.10, wenn dies für die nachfolgende Bildaufnahme erforderlich ist.

Ergebnisse

Hellfeldbilder, die die morphologischen Veränderungen von HMDM als Reaktion auf Reize zur Zelldifferenzierung zeigen, sind in Abbildung 1dargestellt. M1 polarisierte Makrophagen aus Experimenten mit HMDM, die IFN und LPS ausgesetzt waren, zeigten eine längliche und spindelartige Zellform, wie die schwarzen Pfeile in Abbildung 1 (mittleres Panel) zeigen. Zum Vergleich: Die Morphologie der polarisierten Makrophagen M2 nach Exposition von HMDM bei IL-4 für 48 h ...

Diskussion

Die Erzeugung und Visualisierung der MET-Bildung mit M1-differenzierten HMDMs stellt ein neues In-vitro-Modell dar, das für die Untersuchung der möglichen pathologischen Rolle dieser Makrophagenstrukturen, insbesondere bei chronisch entzündlichen Bedingungen. Es bietet ein robustes Protokoll für die Stimulation von primären menschlichen Makrophagen, um METs freizusetzen, die auch in verwandten Studien mit menschlichen Monozyten- oder murinen Makrophagenzelllinien verwendet werden können. Die erfolgreiche Umsetzung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
120Q broad spectrum fluorescent light source	EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada		x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)	Sigma-Aldrich	CLS3336	For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)	Polysciences Inc.	24606	Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14025050	For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl)	Sigma-Aldrich	320331	For MET stimulation
Interferon gamma	Thermo-Fisher	PMC4031	For M1 priming
Interleukin 4	Integrated Sciences	rhil-4	For M2 priming
Interleukin 8	Miltenyl Biotec	130-093-943	For MET stimulation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	59202C	Added to culture media
Lipopolysaccharide	Integrated Sciences	tlrl-eblps	For M1 priming
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS	1114544	For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139	For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D5652	For washing steps
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R8758	For cell culture
SYTOX green	Life Technologies	S7020	For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source	Olympus, Tokyo, Japan		x-cite series
Tumor necrosis factor alpha	Lonza	300-01A-50	For MET stimulation