Biopartikel-Mikroarrays für chemotaktische und molekulare Analysen des menschlichen Neutrophilen-Schwärmens in vitro

Zusammenfassung

Dieses Protokoll erzeugt Biopartikel-Mikroarrays, die räumlich gesteuerte Neutrophilenschwärme nerieren. Es bietet einfachen Zugriff auf die Mediatoren, die Neutrophile während der Migration freisetzen, und ermöglicht quantitative Bildgebungsanalysen.

Zusammenfassung

NeutrophileSchwärme ist ein kooperatives Verfahren, durch das Neutrophile eine Infektionsstelle abdichten und die Gewebereorganisation fördern. Swarming wurde klassischerweise in vivo in Tiermodellen untersucht, die charakteristische Muster der Zellmigration zeigen. In-vivo-Modelle weisen jedoch mehrere Einschränkungen auf, darunter interzelluläre Mediatoren, die schwer zugänglich sind und analysiert werden können, sowie die Unfähigkeit, menschliche Neutrophile direkt zu analysieren. Aufgrund dieser Einschränkungen ist eine In-vitro-Plattform erforderlich, die das Schwärmen mit menschlichen Neutrophilen untersucht und einen einfachen Zugang zu den molekularen Signalen bietet, die während des Schwärmens erzeugt werden. Hier wird ein mehrstufiger Mikrostamping-Prozess verwendet, um ein Biopartikel-Mikroarray zu erzeugen, das das Schwärmen stimuliert, indem es eine In-vivo-Infektion imitiert. Das Biopartikel-Mikroarray induziert Neutrophile, um kontrolliert und stabil zu schwärmen. Auf dem Mikroarray erhöhen Neutrophile die Geschwindigkeit und bilden stabile Schwärme um Biopartikelhaufen. Zusätzlich wurde überstand, überstanden von den Neutrophilen analysiert und 16 Proteine wurden entdeckt, dass sie im Laufe des Schwärmens differenziell exprimiert wurden. Diese In-vitro-Schwärmeplattform ermöglicht die direkte Analyse der Neutrophilenmigration und Proteinfreisetzung auf reproduzierbare, räumlich kontrollierte Weise.

Einleitung

Neutrophile, die am häufigsten vorkommende weiße Blutkörperchen im Blut¹, gewinnen Aufmerksamkeit als potenzielle diagnostische und therapeutische Ziele^2,3, weil sie in einer Vielzahl von Erkrankungen beteiligt sein können, einschließlich Gicht⁴, Sepsis³, Trauma^5,6, Krebs 1^,7,8, und verschiedene Autoimmunerkrankungen^5,9. Neutrophiles Schwärmen ist ein mehrstufiger, streng regulierter Prozess mit einer Komplexität, die ihn zu einem besonders interessanten Schwerpunkt der Studie^5,10,11macht. Während des Schwärmens isolieren Neutrophilen eine Entzündungsstelle aus dem umgebenden gesunden Gewebe^5,10,11. Richtige Regulierung der neutrophilen Schwärmeist ist wichtig, um die Wundheilung und letztlich Entzündungsauflösung^5,12zu fördern. Neutrophile Schwärmen wurde in erster Linie in vivo bei Nagetier^12,13,14,15 und Zebrafisch^10,11,12,15 Modelle untersucht. Die Art dieser in vivo Tiermodelle führt jedoch zu Einschränkungen⁵. Zum Beispiel sind die Von Neutrophilen während des Schwärmens freigesetzten Mediatoren für die Analyse⁵nicht leicht zugänglich. Darüber hinaus gibt es viele potenzielle Quellen für einen bestimmten Mediator in vivo, so dass ein In-vivo-Experiment einen genetischen Mangel einführen muss, um die zelluläre Produktion und/oder Interaktion zu hemmen, um die Rolle dieses Mediators in einem bestimmten Prozess zu untersuchen¹³. Ein In-vitro-Experiment umgeht diese Komplikation, indem es eine neutrophile Beobachtung ohne den Kontext zusätzlicher Zellen ermöglicht. Zusätzlich ist die Forschung zur Beschreibung der koordinierten Migration durch menschliche neutrophile begrenzt¹⁶. Auf einer In-vitro-Schwärmeplattform können menschliche Neutrophile direkt analysiert werden. Eine In-vitro-Schwärmeplattform könnte das Wissen aus In-vivo-Studien erweitern, indem sie Möglichkeiten bietet, die Lücken zu schließen, die die Grenzen von In-vivo-Studien hinterlassen haben.

Um der Notwendigkeit einer In-vitro-Plattform gerecht zu werden, die in vivo neutrophilen Schwärmen imitiert, haben wir eine Mikrostamping-Plattform entwickelt, die es uns ermöglicht, Biopartikel-Mikroarrays zu mustern, die das Neutrophilschwärmen in einer räumlich kontrollierten Weise stimulieren. Wir erzeugen Biopartikel-Mikroarrays auf Glasrutschen in einem zweistufigen Prozess. Zunächst verwenden wir Mikrostamping, um ein Mikroarray von kationischen Polyelektrolyten (CP)-Spots zu erzeugen. Zweitens fügen wir eine Lösung von Biopartikeln hinzu, die über eine elektrostatische Interaktion an den CP-Spots haften. Durch das erste Mustern der CP-Schicht können wir negativ geladene Biopartikel selektiv mustern, um das gewünschte neutrophile Schwarmmuster zu erzeugen. Die positiv geladene Schicht hält die negativ geladenen Biopartikel durch den kräftigen Waschschritt, der die Biopartikel aus den Bereichen auf dem Glasschlitten entfernt, die nicht über den CP verfügen. Zusätzlich ist der hier verwendete CP, ein Copolymer aus Acrylamid und quaternisiertem kationischen Monomer, biokompatibel, so dass es keine Reaktion der Neutrophilen induziert. Es hat eine sehr hohe Oberflächenladung, die die mikrongroßen Biopartikel zum Glasschlitten immobilisiert und so Neutrophilen daran hindert, die Partikel aus der gemusterten Position auf dem Glasschlitten zu entfernen. Dies führt zu Biopartikel-Clustern, die in einem Mikroarray angeordnet sind. Als wir dem Mikroarray Neutrophilen hinzufügten, bildeten sie stabile Schwärme um die Biopartikelhaufen. Durch die Verfolgung der Neutrophilenmigration fanden wir heraus, dass schwärmende Neutrophilen aktiv in richtungsumhergehende Biopartikel-Cluster. Darüber hinaus nutzten wir diese Plattform, um bestimmte Mediatoren zu analysieren, die Neutrophile während des Schwärmens freisetzen. Wir fanden 16 Mediatoren, die während des Schwärmens unterschiedlich ausgedrückt werden. Ihre Konzentrationen folgen drei allgemeinen Trends im Laufe der Zeit: Anstieg, Abnahme oder Spitze. Unsere in vitro neutrophile Schwärmeungsplattform erleichtert die Analyse des räumlich gesteuerten menschlichen Neutrophilenschwärmens sowie die Sammlung und Analyse von Mediatoren, die durch neutrophilesches Schwärmen freigesetzt werden. In einer früheren Publikation haben wir gezeigt, dass Patienten mit bestimmten Erkrankungen (Trauma, Autoimmunerkrankung und Sepsis) Neutrophile hatten, die anders funktionierten als Patienten von gesunden Spendern⁵. In zukünftigen Forschungsstudien könnte unsere Plattform verwendet werden, um die Neutrophilenfunktion bei einer Vielzahl von Patientenpopulationen zu analysieren. Diese Plattform kann die komplexe Koordination des Neutrophilenschwärmens quantitativ analysieren. Zusätzliche Studien können durchgeführt werden, um Einblicke in die Neutrophilenfunktion einer bestimmten Patientenpopulation oder neutrophilen Reaktionen auf einen Krankheitserreger von Interesse zu geben.

Protokoll

Die Autoren würdigen die gesunden Freiwilligen, die freundlicherweise ihr Blut gespendet haben. Blutproben wurden nach informierter freiwilliger Zustimmung gemäß dem Protokoll des Institutional Review Board (IRB) #2018H0268 vom Biomedical Sciences Committee der Ohio State University überprüft.

1. Mikrofertigung von Biopartikel-Mikroarray

1. Erzeugen Sie mit Standard-Photolithographie-Verfahren den Master-Siliziumwafer.
   1. Generieren Sie einen Nachweis des gewünschten Designs mit einer CAD-Software (Computer-Aided Design), und senden Sie ihn dann an einen Fotomaskenhersteller, um eine Chrom-Fotomaske herzustellen. Hier wird 4 mm x 4 mm rechteckige Arrays mit einem Durchmesser von 30 mm in Kreisen mit einem Abstand von 150 m in der Mitte verwendet. Dieses Design kann für verschiedene Anwendungen nach Belieben geändert werden.
   2. Verfeinern Sie eine 40 m dicke Schicht eines negativen Photoresists auf einen Siliziumwafer. Wafer bei 65 °C für 5 min und 95 °C für 10 min backen.
   3. Stellen Sie den Wafer durch eine Chrom-Fotomaske mit 150–160 mJ/cm² (Abbildung 1A) UV-Licht aus .
   4. Waffeln bei 65 °C für 5 min und 95 °C für 10 min backen. Wafer im Photoresist-Entwickler für 10 min untertauchen und mit Isopropylalkohol abspülen. In diesem Stadium sollte das Muster auf dem Wafer sichtbar sein (Abbildung 1B).
2. Ein 10:1-Verhältnis von Polydimethylsiloxan-Prepolymer und dessen Härtungsmittel (d.h. 20 g Prepolymer und 2 g Aushärtungsmittel) gründlich mischen und das ungehärtete Polydimethylsiloxan -Gemisch (PDMS) über den Masterwafer in eine Petrischale gießen (Abbildung 1C).
3. Vakuum behandeln Sie das ungehärtete PDMS-Gemisch, bis keine Luftblasen über dem Master-Wafer vorhanden sind. Bei 65 °C über Nacht aushärten.
4. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Äußere des gemusterten Teils des Wafers zu schneiden, und entfernen Sie langsam die ausgehärtete PDMS-Platte. Legen Sie die PDMS-Platte auf ein sauberes Schneidebrett mit der gemusterten Seite nach oben (Abbildung 1D).
5. Stempel aus der PDMS-Platte mit einem 8 mm Biopsie-Stempel ausstechen (Abbildung 1E). Für eine Glasrutsche werden acht Stempel benötigt.
6. Legen Sie jeden Stempel mit dem Gesicht nach unten auf das Klebeband, um Schmutz zu entfernen.
7. Bereiten Sie im Voraus eine 1,6 mg/ml-Lösung von CP in Wasser vor.
   1. Fügen Sie die richtige Menge des CP-Pulvers zu Wasser hinzu (z. B. 0,8 g bis 500 ml).
   2. Mischen Sie auf einer Rührplatte bei Raumtemperatur über Nacht, oder bis der gesamte Feststoff in das Wasser gelöst ist. Die CP-Lösung kann 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
   3. Auf Wunsch die CP-Lösung fluoreszierend machen, indem Sie Poly-L-Lysin hinzufügen, das mit Fluoresceinisothiocyanat (PLL-FITC) gekennzeichnet ist.
      1. Aliquot ca. 10 ml der CP-Lösung. Fügen Sie dem Aliquoted-Volumen eine kleine Menge PLL-FITC (0,05 mg) hinzu. Die Menge kann geändert werden, um die Helligkeit der Fluoreszenz wie gewünscht anzupassen.
      2. Vortex die CP-Lösung mit FITC für 20 s beschriftet, oder bis die Lösung eine einheitliche, blassgelbe Farbe ist. Vor Licht schützen und bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern.
8. Mit den Stempeln nach oben, Grund jeder Stempel mit 100 l von 1,6 mg/ml Lösung von CP, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen zwischen der CP-Lösung und dem Stempel bilden (Abbildung 1F).
9. Invertdiee der Stempel auf eine Schicht der CP-Lösung (Abbildung 1G).
10. Entfernen Sie die Stempel aus der CP-Lösung nach 1 h.
11. Dab jeder nasse Stempel nach unten auf eine saubere Glasrutsche 6–8x, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
12. Vakuum behandeln Sie die Briefmarken für 1-2 min.
13. Befestigen Sie einen acht Bohrer mit einem Durchmesser von 9 mm auf der Oberseite eines sauberen Glasschlittens als Leitfaden für die Stempelplatzierung. Mit diesem Abstandser kann jeder Glasschlitten acht Mikroarrays haben.
14. Platzieren Sie einen Stempel mit dem Gesicht nach unten auf der Glasrutsche in der Mitte jeder Bohrung des Bildraums (d. h. verwenden Sie insgesamt acht Stempel).
15. Legen Sie ein ausgewogenes Gewicht von 5,6 x 0,1 g auf jeden Stempel und lassen Sie 10 min zum Stanzen zu (Abbildung 1H). Ein ausgewogenes Gewicht ist erforderlich, um sicherzustellen, dass der Stempel gleichmäßig auf die Glasrutsche gedrückt wird und eine gleichmäßige Übertragung des CP auf die Glasrutsche gefördert wird.
16. Entfernen Sie die Gewichte und Stempel von der Glasrutsche (Abbildung 1I). Lassen Sie die CP-Schicht bei Raumtemperatur für 24 h trocknen, bevor Sie die Biopartikel hinzufügen, wie in Schritt 1.17 beschrieben. Wenn der CP mit FITC markiert ist, kann die Wirksamkeit der Stanzung an dieser Stelle mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 488 nm überprüft werden, bevor sie mit Schritt 1.17 fortfährt (Abbildung 1M).
17. Schneiden Sie eine leere PDMS-Platte auf die Größe des bildgebenden Abstandsraums und verwenden Sie den 8 mm Biopsie-Punch, um Brunnen im PDMS zu erstellen, die sich an den Bohrungen eines bildgebenden Abstandsraums ausrichten. Mit dem Bildabstand(Abbildung 1J) kleben Sie die PDMS-Platte am Glasschlitten an .
18. Eine Lösung aus Biopartikeln (z.B. E. coli oder Zymosan) auftauen und in Wasser zur Injektion (WFI) auf 500 g/ml verdünnen.
    HINWEIS: Die Biopartikel müssen nicht opsonisiert werden. Neutrophile Oberflächenrezeptoren erkennen Moleküle auf diesen Biopartikeln direkt^19,20,21.
19. Fügen Sie jedem PDMS-Brunnen auf dem Glasschlitten 100 l Biopartikellösung hinzu (Abbildung 1K).
20. Schaukeln Sie die Glasrutsche für 30 min.
21. Spülen Sie die Brunnen gründlich mit Wasser. Das Biopartikel-Mikroarray kann bis zu 3 Monate in einer staubfreien Umgebung bei 4 °C gelagert werden. An dieser Stelle sollte das Muster mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 594 nm überprüft werden, bevor mit Schritt 2.1 (Abbildung 1N) fortfährt.

2. Probenvorbereitung

1. Sammeln Sie mindestens 2 ml frisches Blut in K2-EDTA-Röhrchen vom gewünschten Spender. Die erwartete Ausbeute von Neutrophilen beträgt 1–2 x 10⁶ Zellen/1 ml Vollblut. Der bildgebende Assay benötigt etwa 1,5 x 10⁵ Neutrophile, und die Analyse des Überstandes erfordert 1 x 10⁶ Neutrophile. Verwenden Sie das Blut innerhalb von 4 h.
2. Trennen Sie rote Blutkörperchen (RBCs) durch Zugabe eines Erythrozyten-Aggregationsmittels im Verhältnis 1:5 zum Vollblut. Warten Sie 45 min auf eine transluzente Schicht (Buffy Coat), um sich von der Schicht der RBCs zu trennen.
3. Entfernen Sie das buffy Mantel und waschen Sie mit Phosphat gepufferte Saline (PBS) mit 1 ml Buffy-Mantel: 9 ml PBS.
4. Zentrifuge für 5 min bei 190 x g und 20 °C.
5. Den Überstand ansaugen und das Pellet bei 5 x 10⁷ Zellen/ml wieder aufhängen.
6. Verwenden Sie ein negatives immunmagnetisches Selektionskit, um Neutrophile zu isolieren.
   1. Fügen Sie 50 l Antikörpercocktail/1 ml Zellsuspension hinzu. Warten Sie 10 min.
   2. Fügen Sie 100 l magnetische Perlen/1 ml Zellsuspension hinzu. Warten Sie 10 min.
   3. Fügen Sie eine Zellsuspension zu einem rund-untere Rohr hinzu und legen Sie sie in einen zylindrischen Magneten. Warten Sie 10 min.
7. Überstand in ein Zentrifugenrohr gießen. Addieren Sie bis zu 10 ml PBS. Zentrifuge für 5 min bei 190 x g und 20 °C.
8. Aspirat Überstand. Resuspend weißes Pellet in IMDM mit 0,4% humanem Serumalbumin.
9. Fleckenkerne mit 20 g/ml Hoechst 33342 für 10 min bei 37 °C.
10. Fügen Sie 5 ml IMDM mit 0,4% humanem Serumalbumin hinzu, um zu spülen. Zentrifuge für 5 min bei 190 x g und 20 °C.
11. Resuspend Zellen bei 7,5 x 10⁵ Zellen/ml in IMDM mit 0,4% menschlichem Serumalbumin.
12. Fügen Sie 100 l der Zellsuspension in einen PDMS-Brunnen ein, das ein Biopartikel-Mikroarray enthält. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension über dem PDMS-Brunnen konvex ist und keine Blasen enthält.
13. Dichtung mit einem Abdeckschlupf von 12 mm Durchmesser. Bedecken Sie die Öffnung des PDMS-Brunnens mit einem Abdeckschlupf von 12 mm Durchmesser. Drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette auf den Deckelschlupf, damit die überschüssige Zellsuspension an den Rand des Brunnens entweicht. Verwenden Sie ein Gewebe, um die überschüssige Zellsuspension zu entfernen.

3. Ausführen der Assay- und Bildanalyse

1. Laden Sie das Mikropartikelarray mit Zellen auf der Live-Zell-Bildgebungsstation mit einem Mikroskop, das mit einem Käfig-Inkubator ausgestattet ist, der auf 37 °C, 5 %_CO2und 90 % relative Luftfeuchtigkeit eingestellt ist.
2. Verwenden Sie Zeitraffer-Fluoreszenz- und Hellfeldmikroskopie, um Bilder mit 10-facher Vergrößerung alle 10 s bei 405 nm, 594 nm und hellfeldaufstellen zu lassen. In einem typischen Experiment werden Bilder bis zu 2 h gesammelt.
3. Verwenden Sie eine automatisierte Zellverfolgungssoftware, um die Migration einzelner Neutrophilen in den Biopartikelcluster zu verfolgen.
   1. Verwenden Sie den Autoregressionsmodus einer Spot-Erkennungs-Zellverfolgungssoftware. Stellen Sie den Spotradius auf 5 m (die ungefähre Größe eines neutrophilen Kerns) ein. Legen Sie die minimale Spurlänge auf 120 s und eine maximale Spaltgröße von einem Frame fest.
   2. Extrahieren Sie aus den von der Zellverfolgungssoftware generierten Daten die Dateien, die die Position und Geschwindigkeit der Neutrophilen enthalten. Diese Dateien können mit einer Graphik-Software verwendet werden, um Neutrophilen-Migrationsspuren zu generieren (Abbildung 2C) und eine Heatmap von Geschwindigkeit vs. Zeit (Abbildung 2D), bzw. .
4. Verwenden Sie die 405 nm fluoreszierenden Bilder, um die Schwarmgröße im Laufe der Zeit auf einer Bildanalysesoftware Ihrer Wahl zu verfolgen.
   1. Definieren Sie Regionen von Interesse (ROIs) um jeden Biopartikelhaufen, in dem Neutrophile schwärmen. Halten Sie den ROI in der gleichen Größe, um jeden Biopartikelcluster zu analysieren.
   2. Analysieren Sie die mittlere fluoreszierende Intensität der 405 nm-Bilder innerhalb jedes ROI im Laufe der Zeit.
   3. Generieren Sie eine Kalibrierkurve von mittlerer Fluoreszenzintensität bis zur Schwarmgröße, indem Sie manuelle Messungen in verschiedenen Schwarmgrößen von 0 bis² bis zur maximalen Schwarmgröße durchführen. Verwenden Sie diese Kalibrierung, um die Schwarmgröße im Zeitverlauf zu berechnen.

4. Supernatant-Sammlung und Proteinnachweis

1. Inkubieren Sie die Neutrophilen in den Brunnen, die das Biopartikel-Mikroarray bei 37 °C und 5%_CO2 für 3 h enthalten. Nehmen Sie Proben zu den gewünschten Zeitpunkten. In der Regel werden die Proben bei 0, 0,5, 1 und 3 h entnommen. Um die Nachweisgrenze des Protein-Array-Assays zu überwinden, wurde für jeden Zeitpunkt das gesamte Überstandvolumen eines einzelnen Brunnens (200 l) verwendet. Jeder Zeitpunkt wurde in dreifacher Ausfertigung analysiert.
2. Überprüfen Sie mit einem Hellfeldmikroskop, ob sich Schwärme auf dem Mikroarray bilden.
3. Den Überstand mit einer 200-L-Pipette ansaugen und in ein 0,45-mm-Zentrifugenfilterrohr eintragen.
4. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 190 x g und 20 °C für 5 min und sammeln Sie das filtrierte Volumen.
5. Proben bei -80 °C bis zur Bearbeitungszeit lagern.
6. Verwenden Sie ein Microarray-Kit, das eine Reihe menschlicher Proteine erkennt, um Proben zu verarbeiten.
   1. Fügen Sie 200 l jeder Probe in ein separates Dialyserohr, das mit dem Kit geliefert wird, hinzu.
   2. Die Dialyseröhrchen in ein Becherglas mit mindestens 500 ml PBS (pH = 8,0) legen. Auf einer Rührplatte mindestens 3 h bei 4 °C vorsichtig umrühren. Ändern Sie die PBS im Becher, und wiederholen Sie diesen Schritt.
   3. Jede Probe in ein sauberes Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 9.000 x g für 5 min geben, um eventuelle Ausscheidungen zu entfernen. Übertragen Sie jeden Überstand auf ein sauberes Rohr.
   4. Biotinylat ieren Sie jede Probe, indem Sie 36 l 1x Etikettierungsreagenz aus dem Kit pro 1 mg Gesamtprotein in der dialysierten Probe zu 180 l Dialyseprobe hinzufügen. Bei 20 °C für 30 min inkubieren. Alle 5 min sanft mischen.
   5. Fügen Sie jedem Probenrohr 3 L Stop-Lösung mit dem Kit hinzu. Jede Probe in ein frisches Dialyserohr geben und die Schritte 4.6.2–4.6.3 wiederholen. In diesem Stadium kann die Probe bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden, bis Sie bereit sind, fortzufahren.
   6. Die mit gelieferte Glasrutsche wird bei -20 °C gelagert. Lassen Sie es auf Raumtemperatur kommen. Legen Sie die montierte Glasrutsche für 1-2 h bei Raumtemperatur in eine laminare Durchflusshaube.
   7. Fügen Sie 400 L des mit dem Kit gelieferten Sperrpuffers in jeden Brunnen des montierten Glasschlittens ein. Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
   8. Zentrifugieren Sie die vorbereiteten Proben für 5 min bei 9.000 x g, um Ausscheidungen oder Partikel zu entfernen. 5x mit Sperrpuffer verdünnen.
   9. Entfernen Sie den Blockierungspuffer aus jedem Brunnen. Fügen Sie 400 l der verdünnten Proben in die entsprechenden Bohrungen ein. 2 h bei Raumtemperatur beim Schaukeln inkubieren.
   10. Dekantdien Sie die Proben von jedem Brunnen. Waschen Sie 3x mit 800 l des 1x Waschpuffers, den ich beim Schaukeln bei Raumtemperatur für jeweils 5 min mit dem Kit zur Verfügung gestellt habe.
   11. In einem sauberen Behälter die montierte Glasrutsche in 1x Waschpuffer I untertauchen. 2x bei Raumtemperatur für jeweils 5 min beim Schaukeln waschen.
   12. Fügen Sie jedem Unterarray 400 L 1x Cy3-konjugiertes Streptavidin hinzu. Abdeckung mit Kunststoff-Klebestreifen. Schützen Sie sich für den Rest des Protokolls vor Licht.
   13. 2 h bei Raumtemperatur beim Schaukeln inkubieren.
   14. Dekantieren Sie die Lösung und zerlegen Sie die Glasrutsche aus den Probenkammern.
   15. In dem 30 ml Zentrifugenrohr, das mit dem Kit geliefert wird, fügen Sie vorsichtig den Glasschlitten und genügend 1x Waschpuffer I hinzu, um die Glasrutsche abzudecken. Waschen Sie 3x für jeweils 10 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln.
   16. Im 30 ml Zentrifugenrohr 2x mit 1x Waschpuffer II für je 5 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln waschen.
   17. Waschen Sie die Glasrutsche mit 30 ml ddH₂O für 5 min. Entfernen Sie die Glasrutsche aus dem Zentrifugenrohr und lassen Sie 20 min in einer laminaren Durchflusshaube trocknen. Der vorbereitete Glasschlitten kann bei -20 °C gelagert werden, bis es zum Scannen bereit ist.
   18. Scannen Sie das Glasschlitten mit einem Mikroarray-Scanner bei einer Fluoreszenzemission von 555 nm.

Ergebnisse

Wenn Neutrophilen dem Biopartikel-Mikroarray zugesetzt werden, werden Neutrophile, die die Biopartikel-Cluster kontaktieren, aktiviert und initiieren die Schwarmreaktion. Das Biopartikel-Mikroarray wurde mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie validiert, um die Neutrophilenmigration zu den Biopartikelclustern zu verfolgen (Video S1). Die Migration einzelner neutrophiler Kerne wird verfolgt, während sie in Richtung des Biopartikelclusters wandern. Wenn Neutrophile den Biopartikelhaufen erreichen, über...

Diskussion

Wir entwickelten eine Mikrostamping-Plattform, um einheitliche Arrays von Biopartikeln zu erzeugen, um den in vitro neutrophilen Schwärmen zu stimulieren. Die In-vitro-Natur unserer Plattform ermöglicht es uns, die Komplikationen zu umgehen, die mit In-vivo-Schwärmeexperimenten entstehen, nämlich die schlechte Fähigkeit, Mediatoren zu analysieren, die von schwärmenden Neutrophilen freigesetzt werden⁵. Darüber hinaus werden In-vivo-Modelle in der Regel bei Nagetieren¹¹

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
"The Big Easy" EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18001	Magnet to use with neutrophil isolation kit
Cell Incubator	Okolab	777057437 / 77057343	Okolab cage incubator for temperature and CO2 control
EasySep Human Neutrophil Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17957	Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils
Eclipse Ti2	Nikon Instruments	MEA54010 / MEF55037	Inverted research microscope
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array
Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch	Sigma Aldrich	Z708925	To cut PDMS stamps
HetaSep	STEMCELL Technologies	7906	Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Nucleus fluorescent stain
Human L1000 Array	Raybiotech Inc.	AAH-BLG-1000-4	High density array to detect 1000 human proteins
Human Serum Albumin (HSA)	Sigma Aldrich	A5843	Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils
Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053	To resuspend isolated neutrophils
K2-EDTA tubes	Thermo Fisher Scientific	02-657-32	Tubes for blood collection
Low Reflective Chrome Photomask	Front Range Photomask	N/A	Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D)
Microarray Scanner	Perkin Elmer	ASCNGX00	Fluorescence reader of protein patterned microdomains
Microscopy Image Analsysis Software - Imaris	Bitplane	9.3.0	Software for automatic cell tracking analysis
NiS Elements Advanced Research Software Package	Nikon Instruments	MQS31100	Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation
Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)	Sigma Aldrich	P3069-10MG	30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution
SecureSeal 8-well Imaging Spacer	Grace Bio-Labs	654008	8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer
Silicon Wafer	University Wafer	590	Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test
Spin Coater	Laurell	WS-650MZ-23NPPB	Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer
SU-8 2025	MicroChem	2025	Negative photoresist to make silicon master wafer
SU-8 Developer	MicroChem	Y020100	Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer
Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)	Dow	1673921	2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells
UV Exposure Masking System	Kloé	UV-KUB 2	Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light
Water	Thermo Fisher Scientific	A1287303	High quality water to dilute bioparticles
Zetag 8185	BASF	8185	Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate	Invitrogen	Z2843	Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array