Sequenzierung kleiner nicht-kodierender RNA aus formalinfixierten Geweben und Serum-abgeleiteten Exosomen von kastrationsresistenten Prostatakrebspatienten

Zusammenfassung

Therapieresistenz entwickelt sich oft bei Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs, und in einigen Fällen entwickelt sich Krebs zu einem tödlichen Subtyp namens neuroendokrine minale Prostatakrebs. Die Bewertung der kleinen nicht-kodierenden RNA-vermittelten molekularen Veränderungen, die diesen Übergang erleichtern, würde eine bessere Krankheitsschichtung und Identifizierung von kausalen Mechanismen ermöglichen, die zur Entwicklung von neuroendokrinem Prostatakrebs führen.

Zusammenfassung

Ablation von Androgen-Rezeptor (AR) Signalisierung durch Androgen-Entzug ist das Ziel der ersten Linie der Therapie für Prostatakrebs, die zunächst in Krebs Regression führt. In einer signifikanten Anzahl von Fällen entwickelt sich die Krankheit jedoch zu fortgeschrittenem, kastrationsresistentem Prostatakrebs (CRPC), der nur begrenzte therapeutische Möglichkeiten hat und oft aggressiv ist. Entfernte Metastasen werden meist in diesem Stadium der aggressiven Krankheit beobachtet. CRPC wird von einer zweiten Generation von AR-Signalweg-Inhibitoren behandelt, die das Überleben zunächst verbessern, gefolgt von der Entstehung von Therapieresistenz. Neuroendokrine Prostatakrebs (NEPC) ist eine seltene Variante von Prostatakrebs (PCa), die sich oft als Folge der Therapieresistenz über einen Transdifferenzierungsprozess entwickelt, der als neuroendokrine Differenzierung (NED) bekannt ist, wobei PCa-Zellen einem Abstammungsschalter unterzogen werden. von Adenokarzinomen und zeigen eine erhöhte Expression von neuroendokrinen (NE) Linienmarkern. Neben den genomischen Veränderungen, die das Fortschreiten und die Transdifferenzierung zu NEPC vorantreiben, werden epigenetische Faktoren und mikroökologische Hinweise als wesentliche Akteure bei der Förderung der Krankheitsprogression angesehen. Dieses Manuskript enthält ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung der epigenetischen Treiber (d. h. kleine nicht-kodierende RNAs), die mit fortgeschrittenen PCa in Verbindung stehen. Mit gereinigten microRNAs aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) metastasierenden Geweben und entsprechenden serumabgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) beschreibt das Protokoll, wie Bibliotheken mit entsprechender Qualitätskontrolle für die Sequenzierung vorbereitet werden. microRNAs aus diesen Probenquellen. Die Isolierung von RNA sowohl aus FFPE als auch von EVs ist oft eine Herausforderung, da der größte Teil davon entweder abgebaut oder quantitativ begrenzt ist. Dieses Protokoll wird verschiedene Methoden zur Optimierung der RNA-Eingänge und cDNA-Bibliotheken erarbeiten, um bei der Sequenzierung die meisten spezifischen Lesevorgänge und qualitativ hochwertigen Daten zu liefern.

Einleitung

Prostatakrebs wird durch Androgene angetrieben, die über AR-Signale wirken. Daher ist die Ausrichtung auf den AR-Signalweg die Hauptstütze der Krankheit¹. Jedoch, Resistenz enresultiert oft als Folge von gezielten Therapien und die Krankheit fortschreitet zu einem fortgeschrittenen metastasierenden CRPC². CRPC wird von der zweiten Generation der AR-Therapie behandelt, die Enzalutamid und Abirateron²umfasst,^3, die das Überleben zunächst verbessert. Allerdings treten tödliche Varianten wie NEPC häufig in 25 bis 30 % der behandelten CRPC-Fälle auf, die nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten haben, was zu einer erhöhten Sterblichkeit^{führt 3}. NEPC entsteht über einen reversiblen Transdifferenzierungsprozess namens NED, bei dem PCa-Zellen einen Abstammungswechsel von Adenokarzinomen durchlaufen und eine verminderte Expression von AR und eine erhöhte Expression von NE-Linienmarkern wie Enolase 2 (ENO2), Chromogranin A (CHGA) und Synaptophysin (SYP)⁴zeigen. Angesichts der Tatsache, dass diese Resistenzvarianten als Ergebnis therapeutischer Interventionen entstehen, ist es wichtig, Wege zu entschlüsseln, die zur Erzeugung dieser tödlichen, schwer zu behandelnden Form von PCa führen.

Die Genomik von NEPC wurde kürzlich in einer umfassenden Studie von Beltran et al. entschlüsselt, in der Kopiernummernänderungen, Mutationen, einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) und DNA-Methylierung aus patientenabgeleiteten metastasierenden Geweben analysiert wurden⁵. Trotz signifikanter Fortschritte im Verständnis der Genomik dieser aggressiven Form von PCa ist wenig über die epigenetischen Faktoren bekannt, einschließlich der kleinen nicht-kodierenden RNAs (microRNAs), die am Übergang von CRPC-Adenokarzinom zu NEPC beteiligt sind. MicroRNAs (miRNAs) sind 22 bp lange, doppelsträngige RNAs, die in erster Linie durch die Unterdrückung der Genexpression posttranskriptionär durch sequenzspezifische Wechselwirkungen mit den 3'-unübersetzten Regionen (UTRs) von cognate mRNA-Targets⁶wirken. Mehrere OncomiRs und Tumorsuppressoren wurden jetzt identifiziert, und ihre Rolle bei der Regulierung von Krankheitsbeginn und Metastasen wurde bei verschiedenen Krebsarten gut untersucht^6,7. Diese kleinen nicht-kodierenden RNAs dienen oft als sehr wichtige Ziele bei der Kontrolle der Krankheitssterblichkeit^6,8,9. Neuere Forschungen konzentrierten sich auf das Verständnis der parakrinen Wirkungen von miRNAs in Krebsmetastas über ihren Transport in EVs, wie Exosomen, die in den Blutkreislauf fließen und es Tumorzellen ermöglichen, diese sekundären Botenstoffe an metastasierende Stellen in einer nukleasefreien Umgebung zu senden^10,11,12. EVs tragen miRNAs aus den Tumorzellen, um die transformierenden Effekte von den Wirtszellen¹²zu übertragen. Die Identifizierung von Elektrofahrzeugen als sekundäre Botenstoffe von Tumorzellen kann daher bei der nichtinvasiven Erkennung des Schweregrads von Krankheiten nützlich sein.

Der miR-1246 ist stark hochreguliert in EVs von aggressiven PCa, und es zeigt die Krankheit Schwere¹³. Diese EV-assoziierten miRNAs dienen nicht nur als nichtinvasive Biomarker der Krankheit, sondern spielen auch eine funktionell wichtige Rolle bei der Förderung der Tumorgenese. Daher ist es wichtig, die Bedeutung des miRNA-Repertoires zu verstehen, das mit resistenten Formen von PCa verbunden ist, um eine bessere Identifizierung nichtinvasiver Biomarker sowie deren funktionelle Bedeutung zu ermöglichen.

Das Aufkommen der Sequenzierung der nächsten Generation bietet die umfassendste Plattform, um die Details der Tumorlandschaft mit Veränderungen im Genom wie Mutationen, chromosomale Verlagerungen, Chromothripse und Methylierung zu untersuchen, die alle wesentlich zur Form und Natur von Krebs beitragen^14,15,16. Ebenso ist es auch ein wesentliches Werkzeug, um die enormen epigenomischen Veränderungen zu verstehen, die in einer Tumorzelle auftreten und die oft wichtige Akteure in der Krankheitsschwere¹⁷sind. Mit dem Ziel, das miRNA-Repertoire zu verstehen, das mit der Generierung von NEPC verbunden ist, wurde eine kleine RNA-Sequenzierung an FFPE-metastasierenden CRPC-Geweben und den entsprechenden Serum-abgeleiteten EVs durchgeführt. RNA, die aus einer dieser beiden Probenquellen gewonnen wird, ist (1) ertragsarm und (2) von schlechter Qualität aufgrund des Abbaus, der häufig durch Formalinfixierung und EV-Isolation auftritt. Darüber hinaus ist das Generieren von cDNA-Bibliotheken ein kritischer, aber umständlicher Schritt eines Sequenzierungslaufs. Daher erfordern Methoden zur Isolierung dieser RNAs und deren Verwendung zum Generieren von Bibliotheken für die kleine RNA-Sequenzierung eine Optimierung, um genaue und zuverlässige Daten zu generieren.

Es gibt mehrere Methoden, um die miRNA-Expression in verschiedenen Proben zu profilieren, einschließlich RT-PCR, Mikroarrays und In-situ-Hybridisierung (ISH). Ein Protokoll, das FFPE-Gewebe-abgeleitete RNA zur Bewertung der miRNA-Expression durch RT-PCR und ISH verwendet, wurde kürzlich veröffentlicht¹⁸. Neuere Technologien bieten umfassendere und umfassendere Plattformen für die Profilierung der miRNA-Expression in einer Stichprobe. NanoString nCounter bietet eine empfindliche miRNA-Erkennungsplattform¹⁹, aber die Erkennung wird oft durch die Anzahl der miRNAs begrenzt, die im Array verfügbar sind (2.000). In einem solchen Szenario bietet eine sensiblere und erschöpfendere Plattform wie die Sequenzierung der nächsten Generation eine viel breitere Tiefe der miRNA-Identifikation und gleichzeitigen Profilerstellung in verschiedenen Proben²⁰. Die Methode wurde verwendet, um die miRNA-Signaturen im Urin oder Plasma von PCa-Patienten^21,22,23zu bestimmen. Im aktuellen Artikel wird ein Protokoll vorgestellt, um eine Sequenzierungsplattform der nächsten Generation zu verwenden, um miRNA-Profile im Zusammenhang mit aggressivem CRPC mit FFPE-Geweben und serumabgeleiteten EV RNAs zu untersuchen.

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien der US Common Rule durchgeführt und vom Institutional Committee on Human Research genehmigt.

1. Mikrodissektion

HINWEIS: FFPE-metastasiertes CRPC-Gewebe mit Adenokarzinom-Merkmalen (CRPC-Adeno) oder NE-Differenzierung (CRPC-NE) wurden aus dem Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN) gewonnen. ZehnMikron PCa Abschnitte auf Glasrutschen wurden für die manuelle Mikrodissektion vorbereitet, wie zuvor¹⁸diskutiert. Um kurz zusammenzufassen:

1. Entparaffinisieren Sie die Gewebeabschnitte, indem Sie die Dias in Xylol einweichen (2x, je 10 min). Dann rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Dias für jeweils 5 min in abgestuftem Ethanol (100%, 95%, 90%, 80% und 70%) rehydrieren, gefolgt von einer destillierten Wasserwäsche und Färbung mit Hämatoxylin (30 s einweichen).
2. Nach der Hämatoxylinfärbung die Gewebeabschnitte mit Wasser waschen. Dehydrieren Sie dann die Gewebeabschnitte, indem Sie sie in abgestuftes Ethanol (70%, 80% 90%, 95%, 100%) (je 5 min) gefolgt von Xylol (5 min).
3. Analysieren Sie die entsprechenden Hämatoxylin- und Eosin-Dias (H&E), um die Tumorbereiche (d. h. Adenokarzinome oder NED) zu identifizieren und diese Tumorbereiche und normalen angrenzenden Bereiche mit Hilfe eines Board-zertifizierten Pathologen zu markieren. Markieren Sie anhand dieser H&E-Folien als Roadmaps die hämatoxylinbefleckten Gewebe, die im obigen Schritt erhalten wurden, um zwischen tumor- und normalen Bereichen zu unterscheiden.
4. Sezieren Sie das markierte Gewebe dia vorsichtig unter dem Mikroskop mit einem Skalpellklinge.
5. Sammeln Sie das sezierte Gewebe aus normalen und krebsartigen Bereichen in separaten Röhrchen mit elektrostatisch geladenen Gel-Ladepipettenspitzen. Die geladene Spitze zieht das sezierte Gewebe an und ermöglicht eine maximale Gewebeerholung nach der Zerlegung. Sobald das Gewebe an der geladenen Spitze klebt, schneiden Sie die Spitze in ein leeres 2 ml Sammelrohr.

2. Isolierung von Serum-abgeleiteten Elektrofahrzeugen

HINWEIS: Gefrorene Patientenserumproben, die von Patienten mit metastasierendem CRPC mit Adenokarzinom-Eigenschaften (CRPC-adeno) oder NE-Differenzierung (CRPC-NE) entnommen wurden, wurden von PCBN mit einem zugelassenen IRB-Protokoll beschafft und vor ihrer Verwendung bei -80 °C gespeichert. Serumproben wurden von der gleichen Gruppe von Patienten wie für mikrosezierte Gewebe entnommen, um einen Vergleich zwischen den entsprechenden Geweben und den serumabgeleiteten Elektrofahrzeugen zu ermöglichen. Zur Erfassung der Elektrofahrzeuge wurde ein handelsübliches Serum-EV-Isolationsreagenz verwendet.

1. Gefrorene Patientenserumproben bei 4 °C auftauen.
2. Verwenden Sie 110 l aufgetaute Serumprobe und drehen Sie bei 2.000 x g für 30 min.
3. Sammeln Sie den Überstand für die nachfolgende EV/Exosome-Isolierung und entsorgen Sie das Schmutzpellet. 30 min des Serumexosomen-Isolationsreagenz hinzufügen und bei 4 °C inkubieren.
4. Drehen Sie bei 10.000 x g für 10 min. Sammeln Sie das EV-erschöpfte Serum sorgfältig, ohne das Pellet in einem separaten 1,5 ml Rohr zu stören und lagern Sie bei -80 °C für zukünftige Analysen, falls erforderlich.
5. Setzen Sie das EV-Pellet in 70 l Phosphatgepufferter Salzsäure (PBS) in nukleasefreiem Wasser aus. Halten Sie ein Aliquot für das Partikelverfolgungsanalysesystem, um die Qualität und Anzahl der Partikel zu bewerten. Bewahren Sie den Rest der Probe bei -80 °C bis zur weiteren Analyse auf.

3. RNA-Isolierung aus mikrosezierten Prostatageweben und Elektrofahrzeugen

HINWEIS: Total RNA wurde aus mikrosezierten Geweben und gereinigten Elektrofahrzeugen mit einem handelsüblichen Kit (Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers mit einigen Modifikationen isoliert. In den folgenden Abschnitten werden diese Verfahren kurz beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf den wichtigen Schritten liegt:

1. Isolieren Sie die RNA aus dem mikrosezierten Gewebe.
   1. Setzen Sie das mikrosezierte FFPE-Gewebe in 150 l Proteinase-K-Puffer aus. Mischen Sie durch Wirbeln und Pipette aus dem Restgewebe aus der Spitze. Drehen Sie bei 11.000 x g für 1 min.
   2. Fügen Sie dem Pellet 10 l Proteinase K hinzu. Warten Sie 2 min, bis das Pellet weiß wird. Pipette ein paar Mal rauf und runter.
   3. Bei 56 °C für 16 min. Vortex alle 3 min inkubieren.
   4. Proben entfernen und den Wärmeblock 80 °C erreichen lassen. Inkubieren Sie die Proben auf dem Block für 16 min. Vortex alle 3 min.
   5. 3 min auf Eis bebrüten.
   6. Drehen Sie bei 20.000 x g für 15 min. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 2 ml Rohr.
   7. Fügen Sie 16 l DNase-Boosterpuffer hinzu, gefolgt von 10 l DNase I. Mischen Sie das Rohr sanft und inkubieren Bei Raumtemperatur (RT) für 15 min.
   8. Fügen Sie 320 L rote Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer hinzu. Mischen Sie, indem Sie das Rohr invertieren und dann 1.120 l 100% Ethanol hinzufügen. Sofort auf Bei 4 °C gelagerte Spinsäulen übertragen. Drehen Sie bei 8.000 x g für 30 s.
   9. Waschen Sie die Säulen 2x mit Waschpuffer und drehen Sie die Säulen bei 20.000 x g für 5 min, um den Restwaschpuffer zu entfernen.
   10. Lassen Sie die Spin-Säule für 2 x 3 min trocknen, dann mit 19 l RNase-freiem Wasser elute. Quantitieren Sie die gereinigte RNA auf einem Spektralphotometer und normalisieren Sie die Probe auf 40 ng/L.
2. RNA-Isolierung von Serum-abgeleiteten Elektrofahrzeugen.
   1. Isolieren Sie die exosomale RNA mit einem Kit. Fügen Sie 75 l Lysepuffer A und 9,3 l Lysepuffer B bis 50 l der gereinigten EV-Suspension hinzu.
      HINWEIS: Mischen Sie die Probe weiter, indem Sie das Rohr ca. 10 min inumkehren, um eine vollständige Lyse der Elektrofahrzeuge zu ermöglichen.
   2. Fügen Sie 130 l 100% Ethanol hinzu und mischen Sie sofort, indem Sie die Probe invertieren. Übertragen Sie auf eine Spin-Säule und drehen Sie dann bei 3.300 x g für 1 min.
   3. Waschen Sie die Säule 2x mit dem Waschpuffer. Drehen Sie die Säule bei 1.300 x g für 3 min, um den Waschpuffer vollständig zu entfernen.
   4. Lassen Sie die Säule für 2 min lufttrocknen. Fügen Sie der Säule 18 l Elutionspuffer hinzu und lassen Sie sie 2 min. Drehen Sie bei 400 x g für 1 min, gefolgt von einer zweiten Drehung bei 5.800 x g für 3 min.
   5. Wiederholen Sie Schritt 3.2.4 mit dem im Kit enthaltenen eluierten Puffer, um die Ausbeute der RNA aus der Probe zu erhöhen.
   6. Quantifizieren Sie die Probe auf einem Spektralphotometer und normalisieren Sie sie auf 40 ng/L.

4. Bibliotheksvorbereitung für die kleine RNA-Sequenzierung

HINWEIS: Ein kleines RNA-Bibliotheks-Vorbereitungskit (Table of Materials) wurde verwendet, um cDNA-Bibliotheken aus den isolierten RNA-Proben zu generieren. Die Schritte zum Generieren von Bibliotheken, Zum Reinigen und Zur Qualitätsprüfung vor der Ausführung auf einem Sequenzer sind für jedes Sequenzierungsprotokoll von entscheidender Bedeutung, da sie schließlich die Qualität der Ausgabedaten aus einer Ausführung bestimmen. Gehen Sie daher mit jedem Schritt vorsichtig vor. Die Richtlinien des Herstellers schlagen vor, mindestens 50 ng RNA zu verwenden. Angesichts der schlechten Qualität und der geringen Mengen an Gesamt-RNA, die normalerweise aus diesen beiden Probenquellen gewonnen werden, ist dieses Protokoll für RNA-Konzentrationen von nur 100 ng optimiert. Das folgende Protokoll ist für ein Beispiel einer Bibliothek.

1. Generieren Sie adapterligted cDNA.
   1. Verwenden Sie 5 l einer normalisierten RNA-Probe (40 ng/l). Fügen Sie 1 L von 3' Adapter hinzu. Vorderhitzen Sie den Thermischen Cycler auf 70 °C, bevor sie die Proben inkubieren. 2 min inkubieren. Übertragen Sie die Proben sofort auf Eis, bevor Sie auf den nächsten Schritt übergehen.
   2. Mischen Sie in einem separaten Röhrchen 2 l Ligationspuffer, 1 L RNase-Inhibitor und 1 L T4-RNA-Ligase 2, eine Deletionsmutante. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten und fügen Sie 4 l dieser Mischung in die Röhre mit dem RNA/3' Adapter.
   3. Auf den auf 28 °C vorgewärmten Thermocycler übertragen und 1 h inkubieren.
   4. Fügen Sie 1 L Stop-Lösung hinzu, während Sie die Proben auf dem thermischen Block halten. Bei 28 °C für weitere 15 min inkubieren.
   5. Entfernen Sie die Rohre und halten Sie sofort nach diesem Schritt auf Eis.
   6. In einem separaten Rohr 1 l 5' Adapter hinzufügen.
   7. Auf einen auf 70 °C vorgewärmten Thermocycler übertragen und 2 min inkubieren.
   8. Legen Sie die Röhre sofort auf Eis, um ein erneutes Glühen der Adapter zu verhindern.
   9. Fügen Sie dem Rohr des denaturierten 5'-Adapters 1 l von 10 mM ATP hinzu. Durch Pipettieren mischen und 1 L T4-RNA-Ligase in die Mischung geben. Mischen Sie durch Pipettieren und fügen Sie 3 l dieser Mischung in die Röhre, die die 3' Adapter-gebundene RNA enthält. Transfer auf den auf 28 °C vorgewärmten Thermocycler und 1 h inkubieren.
   10. Sofort auf Eis übertragen und entweder mit den Proben weitergehen oder bei -20 °C für die zukünftige Verwendung lagern.
   11. Um RT-PCR durchzuführen, verwenden Sie 6 l jeder adaptor-ligierten RNA und fügen Sie 1 L RNA RT Primer hinzu. Transfer zum auf 70 °C vorgewärmten Thermocycler. Inkubieren Sie für 2 min.
   12. Mischen Sie in einem separaten Rohr 2 l 5x Strangpuffer, 0,5 l mit 12,5 mM dNTPs, 1 l 100 mM DTT, 1 l RNase-Inhibitor und 1 l Reverse-Transkriptase. Fügen Sie der adaptor-gebundenen RNA 5,5 l dieser Mischung hinzu und übertragen Sie sie auf den thermischen Cycler, der auf 50 °C vorgewärmt wurde. Inkubieren für 1 h.
   13. Übertragen Sie die adaptor-ligted cDNA sofort auf Eis.
   14. Mischen Sie in einer separaten Röhre 25 l PCR-Mix, 2 l RNA-PCR-Primer, 2 l RNA-PCR-Primerindex und 8,5 l RNase-freies Wasser. Fügen Sie 37,5 l dieser Mischung zu 12,5 l Adapter-ligted cDNA hinzu. Transfer zum auf 98 °C vorgewärmten Thermocycler. Programmieren Sie den thermischen Cycler, wie im Herstellerprotokoll vorgeschlagen, mit der Zyklusnummer, die auf 15 anstelle von 11 geändert wird.
       HINWEIS: Sequenzen aller verwendeten Primer sind unter Tabelle der Materialienaufgeführt.
   15. Bewahren Sie die Proben nach Abschluss bei 4 °C auf. Fahren Sie mit ihnen fort oder lagern Sie bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.
2. Reinigen und durchführen Sie die Qualitätskontrolle für die ligated cDNA.
   HINWEIS: Amplified cDNA wurde gel-gereinigt, indem das Herstellerprotokoll befolgt wurde, mit Ausnahme einiger Änderungen zur Verbesserung der Qualität und Ausbeute von gereinigten cDNA-Proben, wie unten erläutert.
   1. Verwenden Sie 6% TBE Polyacrylamid-Gele, um die verstärkte cDNA zu reinigen. Verdünnen Sie die hochauflösende Leiter (HRL) und die kundenspezifische RNA-Leiter (CRL) mit gleichen Mengen an DNA-Ladefarbstoffen.
   2. Fügen Sie jeder cDNA-Probe 10 l DNA-Ladefarbstoff hinzu. Führen Sie 30 l jeder Probe in zwei getrennten, nebeneinander angrenzenden Bahnen mit CRL und HRL im Zwischenraum zwischen den beiden verschiedenen Proben aus.
   3. Führen Sie das Gel im 1x TBE Puffer bei 145 V für ca. 30 bis 40 min.
      HINWEIS: Behalten Sie den Überblick über die untere blaue Vorderseite des Ladefarbstoffs. Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn sie sich dem Boden des Gels nähert.
   4. Übertragen Sie das Gel in 1x TBE Puffer mit Ethidium Bromid (EtBr) bei 0,5 g EtBr/1 mL 1x TBE.
      ACHTUNG: EtBr ist ein bekanntes Karzinogen und jeder Schritt von hier bis zur Exzision aus dem Gel sollte mit äußerster Vorsicht durchgeführt werden.
   5. Visualisieren Sie das Gel in einem Transilluminator und schneiden Sie das Gel genau zwischen dem 145 bp und 160 bp Marker.
      HINWEIS: Die Adapterdimere laufen sehr nahe an der 145 bp-Markierung. Schneiden Sie daher das Gel leicht über den 145 bp Marker, um eine Kontamination mit Adapter-Dimer zu vermeiden.
   6. Übertragen Sie das Gel auf DNA-Bruchrohre, die in 2 ml Sammelröhrchen aufbewahrt werden. Drehen Sie bei 20.000 x g für 2 min. Fügen Sie 300 l RNase-freies Wasser hinzu und lassen Sie es sanft auf einer Wippe über Nacht bei RT drehen.
   7. Um die DNA-Fällung durchzuführen, übertragen Sie am folgenden Tag den Inhalt des Rohres auf 5 m Filterrohre. Drehen Bei 600 x g für 10 s.
      HINWEIS: Lassen Sie Die röhrchen länger als 10 s nicht drehen, wenn das Gel durch den Filter geht.
   8. Fügen Sie der eluierten DNA 2 l Glykogen, 30 l 3 M NaOAc, 2 l 0,1x Pelletfarbe und 975 l 100 % Ethanol hinzu. Drehen Sie bei 17.000 x g bei 4°C für 20 min.
   9. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 75% Ethanol hinzu, um das Pellet zu waschen. Drehen Sie bei 17.000 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und inkubieren Sie die Rohre bei 37 °C, um das Ethanol vollständig zu verdampfen.
   10. Setzen Sie das Pellet mit 12 l von 10 mM Tris-HCl pH 8.5 wieder auf.
   11. Führen Sie eine Bibliotheksqualitätsprüfung durch, indem Sie die gereinigte cDNA um 10x (1:10) verdünnen und 1 l verdünnte cDNA verwenden, um auf einem Bioanalysator zu laufen.
   12. Stellen Sie sicher, dass die cDNA-Produktgröße dem Bereich der kleinen RNA (136-160 bp) im Elektropherogramm entspricht. Berechnen Sie die Gesamtmolarität für jede Probe. Normalisieren Sie jede Probe auf 2 nM mit Tris-HCl pH 8.5.
3. Denaturieren und Sequenzen der gereinigten cDNA.
   1. Bündeln Sie die Bibliotheken, indem Sie die gleichen Volumina jeder 2 nM-Probe in einem einzigen 200-L-PCR-Rohr mischen. Fügen Sie 10 l frisch zubereitete 0,2 N NaOH bis 10 L gepoolte Bibliothek hinzu.
   2. Mischen Sie sofort durch Wirbel, und drehen Sie bei 280 x g für 1 min. Inkubieren bei RT für 5 min.
   3. Fügen Sie der denaturierten Bibliothek 10 l von 200 mM Tris-HCl pH-pH-Wert 7 bis 20 l hinzu. Durch Wirbelmischen und bei 280 x g für 1 min drehen.
   4. Fügen Sie der Bibliothek 970 L vorgefertigten Hybridisierungspuffer hinzu und mischen Sie sie gut durch Wirbeln. Die Bibliothek ist mit einer Konzentration von 20 pM. Auf Eis bleiben, bis es schließlich verdünnt wird.
      HINWEIS: Die endgültige Verdünnung erfolgt direkt vor dem Ausführen auf Demor.
   5. Fügen Sie 117 L der denaturierten Bibliothek zu 1.183 L des vorgechillten Hybridisierungspuffers hinzu. Mischen Sie durch Invertieren der Röhre und Pulszentrifuge. Die endgültige Konzentration der Bibliothek beträgt nun 1,8 pM.
   6. Fügen Sie der endgültigen Bibliothek 1,3 l Von PhiX hinzu. Um einen Run auf einen Sequenzer zu initiieren, befolgen Sie die Schritte auf dem Bildschirm auf der Softwareschnittstelle, überprüfen Sie die Ausführungsparameter, einschließlich Lesetyp (einzelner Lesemodus), Leselänge (Anzahl der Zyklen für jeden Lesepunkt), Bibliotheks-ID, und wählen Sie Startaus.

5. Datenanalyse

1. Rufen Sie am Ende der Sequenzerausführung die resultierenden Sequenzierungsdaten als fastQ-Dateien ab. Verwenden Sie die entsprechende Software, um die resultierenden Sequenzierungsdaten zu analysieren.
2. Öffnen Sie die fastQ-Toolkit-Anwendung und drücken Sie die Launch-Taste.
3. Wählen Sie die Dateien aus der Liste der Beispiele in der Software aus und wählen Sie aus, wo die Daten gespeichert werden sollen.
4. Fügen Sie einen Zeichenfolgennamen hinzu, der auf jede zugeschnittene Sequenz angewendet wird. Halten Sie die Stringenz auf 0,9. Geben Sie die Adaptersequenz als "TGGAATTCTCGGGCGCCAAGG" vom 3' Ende jeder sequenzierten Probe ein. Erweitern Sie die Registerkarte Lesefilterung, und wählen Sie eine mindeste Leselänge von "5". Wählen Sie das Feld Quittierung aus, und drücken Sie die Taste Weiter, um mit dem Trimmen zu beginnen. Die getrimmten Dateien werden am Ende der Analyse im Projektordner gespeichert.
5. Öffnen Sie die kleine ANWENDUNG RNA v.1.0 auf der Software und drücken Sie die Launch-Taste.
6. Wählen Sie das Projekt aus, in dem die Dateien gespeichert und nach der Analyse gesendet werden sollen.
7. Wählen Sie die Funktion Novel miRs und Differential miRs in der Anwendung aus. Trennen Sie die Gruppen als "Control" und "Test" für die Differentialanalyse und fügen Sie die zugeschnittenen Dateien hinzu, die in ihren jeweiligen Gruppen analysiert werden sollen.
8. Wählen Sie die Schaltfläche Starten aus, um die Analyse zu starten. Laden Sie im Anschluss an die Analysen die resultierenden Dateien herunter.

Ergebnisse

Die Bibliothek wurde nach der RNA-Isolierung vorbereitet und eine Qualitätsprüfung durchgeführt. Die Gelreinigung für die verstärkte cDNA-Bibliothek, die aus RNA hergestellt wird, die aus mikrosezierten Geweben und serumabgeleiteten Elektrofahrzeugen isoliert ist, ist in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt. Die Produktgröße für adaptor-ligted miRNAs entsprach etwa 136-160 bp für jede Probe. Abbildung 1A-B

Diskussion

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zum Isolieren von RNA aus FFPE-Geweben und serumabgeleiteten Elektrofahrzeugen mithilfe von Kits, die optimiert wurden, um die Ausbeute und Qualität isolierter RNAs zu erhöhen. Darüber hinaus wurden die gereinigten RNAs verwendet, um cDNA-Bibliotheken für die kleine RNA-Sequenzierung zu generieren. Beide aufgeführten Schritte sind für die Bestimmung der Qualität und Tiefe der Sequenzierungslesevorgänge, die das Endergebnis der Ausführung²⁴si...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M NaOAc pH 5.5	USB Corp.	75897 100 mL
5 µm filter tubes	IST Engineering Inc.	5388-50
6% TBE polyacrylamide gels	Novex	EC6265BOX
BaseSpace	Illumina		Analysis software
Bio-analyzer	Agilent
DNA loading dye	Novex	LC6678
Eppendorf Thermostat plus	Eppendorf 1.5 mL
EtBr	Pierce	17898
Ethyl alcohol 200 proof	Pharmco	111000200
Exosomal RNA isolation kit	Norgen	58000
Gel breaking tubes	IST Engineering Inc.	3388-100
Glycogen molecular biology grade	Thermo Scientifc	R0561
Hematoxylin Select	Stat lab	SL401
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676	accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kit	Qiagen	217504
Nanodrop	Thermo Scientifc	Nano Drop 1000
Nanosight NTA	Malvern	LM14
NextSeq 500 Sequencer	Illumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)	Illumina	FC-404-2001
Pellet paint	Millipore	70748-3
Superscript II Reverse Transcriptase	Invitogen	18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant	Lucigen	LR2D11310K
TBE Running buffer (5x)	Novex	LC6675
Thermal cycler	MJ Research	PTC100
Total exosome isolation reagent (from serum)	Invitrogen	4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012
Xylene	Fisher Scientific	X3P- 1GAL
RNA 3' Primer			GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' Primer			TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop Oligo			GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT Primer			GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR Primer			AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index Primer			CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
-	-	-	6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1			CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2			ACATCG
RNA PCR Index Primer 3			GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4			TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5			CACTGT
RNA PCR Index Primer 6			ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7			GATCTG
RNA PCR Index Primer 8			TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9			CTGATC
RNA PCR Index Primer 10			AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11			GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12			TACAAG