Nukleofection und In Vivo Propagation von Hühner Eimeria Parasiten

Zusammenfassung

Hier boten wir eine Methode zur Erreichung einer stabilen Transfektion von Eimeria-Parasiten durch Nukleofektive Sporozoite oder Merozoitder der zweiten Generation. Genetisch veränderte eimerische Parasiten, die heterologe antigene Gene exdrücken, könnten als Impfstoff-Liefervehikel verwendet werden.

Zusammenfassung

Transfektion ist ein technischer Prozess, durch den genetisches Material, wie DNA und doppelsträngige RNA, in Zellen abgegeben werden, um das Gen von Interesse zu modifizieren. Derzeit wird die transgene Technologie zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Untersuchung von Eimeria, den Erregern der Kokzidiose bei Geflügel und Vieh. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der stabilen Transfektion bei eimerischen Parasiten: Reinigung und Nukleofektion von Sporozoiten oder Merozoiten der zweiten Generation und in vivo Vermehrung transfizierter Parasiten. Mit diesem Protokoll erreichten wir die Transfektion bei mehreren Eimeria-Arten. Zusammengenommen ist die Nukleofektion ein nützliches Werkzeug, um genetische Manipulationen bei eimerischen Parasiten zu erleichtern.

Einleitung

Eimeria spp. verursacht Kokziidiose, was zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in der Vieh- und Geflügelindustrie führt. Obwohl Antikokiside und in gewissem Maße abgeschwächte Antikokzien-Impfstoffe häufig zur Bekämpfung der Kokzidizien-Impfung eingesetzt wurden, gibt es immer noch Mängel in Bezug auf ihre Arzneimittelresistenz, Arzneimittelrückstände und die mögliche Diffusion von Impfstoffstämmen, die virulenz zurückgewinnen¹. Mit der Entwicklung der Molekularbiologie ist die Transfektion zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um Genfunktionen zu untersuchen, neuartige Impfstoffe zu entwickeln und neue Wirkstoffziele für Eimeriazu screening.

In den letzten Jahrzehnten wurde die Transfektion erfolgreich für apicomplexan Parasiten wie Plasmodium und Toxoplasma gondii^2,3,4,5,6angewendet. Eine Studie, in der die Transfektion in E. tenella als Reporter für die Transfektion verwendet wurde, führte in Eimeria⁷auf solche Arbeiten. Die Transfektion von E. tenella^8,9, E. mitis¹⁰und E. acervulina (Zhang et al., unveröffentlichte Daten) war bei Hühnern erfolgreich. Kürzlich erreichten wir die Transfektion mit Merozoiten von E. necatrix durch Nukleofection¹¹.

Studien zeigten, dass Eimeria, die ein heterologes Antigen exizipieren, das Potenzial hat, als rekombinanter Impfstoff entwickelt zu werden, wie z. B. solche, die Campylobacter Jejuni-Antigen A (CjaA) oder Huhn interleukin 2 (chIL-2)^12,13. Daher beschreibt dieses Protokoll eine Nukleofektionsstudie von Eimeria spp. bei Hühnern. Das Verfahren beschreibt die Reinigung von Sporozoiten oder Merozoiten, Die Nukleofektion mit Plasmid-DNA, die cloakale Inokulation/intravenöse Injektion und die In-vivo-Vermehrung, um Forschern zu helfen, Studien über transgene Eimeria-Parasiten zu beginnen.

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Protokoll

Hühner für alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des China Agricultural University Institutional Animal Care and Use Committee untergebracht und gepflegt und folgten den internationalen Leitprinzipien für biomedizinische Forschung mit Tieren. Die Experimente wurden vom Beijing Administration Committee of Laboratory Animals genehmigt.

1. Extraktion und Reinigung von Sporozoiten von Eimeria spp. (z.B. E. tenella)

1. Freisetzung von Sporozysten
   1. Zentrifuge 1 x 10⁷sporulierte Oozysten in Kaliumdichromatlösung (2,5%, m/v) bei 2.300 x g für 5 min. Waschen Sie sie dreimal mit PBS (Phosphatpufferlösung).
   2. Die Pellets mit 1 ml PBS aussetzen und in ein 15 ml Rohr übertragen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Glasperlen (1 mm x 1 mm Durchmesserbereich) hinzu und oszillieren Sie die Oozystensuspension mit einem Wirbelmischer, um die Sporozysten freizusetzen.
   3. Überwachen Sie die Freisetzung von Sporozysten per Mikroskopie im Minutentakt. Stoppen Sie wirbeln, wenn mehr als 90% der Oozysten gebrochen sind.
      HINWEIS: Die meisten Oozysten (wie E. tenella, E. necatrixund E. acervulina) wurden nach 1 min mit dem Wirbelmischer gebrochen.
   4. Die Sporozystensuspension in neue 1,5 ml-Rohre und Zentrifuge bei 1.600 x g für 5 min übertragen.
   5. Den Niederschlag mit 1 ml 50% Dichtegradientenlösung aussetzen, in einem 1,5 ml Rohr kombinieren und zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.
      ANMERKUNG: Für die Dichtegradientenzusammensetzung siehe Tabelle 1. Der Dichtegradient ist ein kolloidales Mittel auf Kieselsäurebasis, bestehend aus kolloidalen Kieselsäurepartikeln mit 15-30 nm Durchmesser (23% w/w in Wasser), die mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) beschichtet wurden.
2. Freisetzung von Sporozoiten
   1. Den Niederschlag mit dem Excystationspuffer (Tabelle 1) wieder aufbrechen und in einem 42 °C-Wasserbad für 40-60 min inkubieren, um die Sporozoiten freizusetzen. Stoppen Sie die Inkubation, wenn mehr als 90% der Sporozoiten freigesetzt werden. Dann Zentrifuge bei 600 x g für 10 min.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Rohre einmal alle 5 Minuten während der Excystation.
   2. Setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml 55% Dichtegradientenlösung und Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min aus.
   3. Setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml PBS wieder auf und zählen Sie die Sporozoiten mit einem Hämozytometer.

2. Sammlung und Reinigung von Merozoiten von E. necatrix

HINWEIS: Verwenden Sie Arbor Acre (AA) Masthähnchen im Alter von 7-14 d im Experiment. Kokzienfreie Hühner (n=3) wurden mit 2 x 10⁵ Oozysten von E. necatrixgeimpft. Bei 109 h nach der Infektion wurden die Vögel durch zervikale Dislokation geopfert. Der Darm wurde für die Sammlung der^2. Generation merozoites entfernt. Für verschiedene Eimeria-Arten gab es eine andere Zeit für die Sammlung der Merozoiten der^2. Generation: E. necatrix bei 109 h und E. tenella bei 112 h nach der Impfung. Für die Transfektion von E. necatrixsind Merozoite die optimale Wahl, da die zweiten Merozoiten leicht zu reinigen sind.

1. Sammlung der Merozoiten der zweiten Generation von E. necatrix
   1. Den Hühnerdarm längs schneiden, vom Dotterstiel (der Mitte des Dünndarms) bis zur ileocecal-Öffnung, und mit PBS oder HBSS (Hank es Balanced Salt Solution) in einer Petrischale dreimal sanft waschen.
   2. Den Darm in 0,5 cm x 0,5 cm Stücke schneiden und in einen konischen Kolben mit einem Verdauungspuffer legen (Tabelle 1). Legen Sie den Kolben auf einen Magnetmischer bei 37 °C mit einem Rührbalken für 30-60 min, um Merozoite freizusetzen. Nach 30 min Inkubation, überwachen Sie die Freisetzung von Merozoiten durch mikroskopische Untersuchung alle 5 min.
2. Reinigen Sie die Merozoite durch Filtration und Zentrifugation.
   1. Filtern Sie die Suspension mit verdauten Merozoiten mit vier Schichten Gaze¹⁴und Zentrifuge bei 600 x g für 10 min.
   2. Nach der Zentrifugation den Überstand, der Darmablagerungen enthält, entsorgen. Übertragen Sie den Niederschlag mit gereinigten Merozoiten auf 1,5 ml Rohre.
   3. Setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml PBS wieder auf und zählen Sie die Merozoiten mit einem Hämozytometer.

3. Nukleofektion von Merozoiten oder Sporozoiten

1. Zubereitung vor Nukleofektion von Parasiten
   1. Bereiten Sie etwa 10⁷ Merozoite oder Sporozoite in einer Röhre vor. Wenn Sie Merozoite transfizieren, bereiten Sie 3-4 Röhren vor.
   2. Bereiten Sie eine Menge an Plasmid-DNA oder gereinigtem PCR-Fragment vor, das größer oder gleich 10 g ist.
      HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Plasmid enthält 2 Gene: verbessertes gelbes fluoreszierendes Protein (EYFP) und Dihydrofolat-Reduktase Thymidylat-Synthase aus Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)¹⁵.
   3. Bereiten Sie 25 U restriktionsenzym vor. Wenn Plasmide linearisiert werden, kann das Restriktionsenzym die Transfektionseffizienz verbessern. Wenn die Plasmide kreisförmig sind, lassen Sie das Restriktionsenzym weg.
   4. Bereiten Sie 85 l Nukleofektionspuffer vor: Mischen Sie 20 L Nukleofektionspuffer I und 1 ml Nukleofektionspuffer II, und verwenden Sie einen Teil der Lösung. Das Volumen des Gesamtpuffers beträgt 100 L.
2. Nukleofection
   1. Zentrifugieren Sie die Sporozoit- oder Merozoitsuspension bei 600 x g für 10 min. Dann entsorgen Sie den Überstand.
   2. In der folgenden Reihenfolge fügen Sie 85 l Kerntransfektionspuffer, 10 g Plasmid (PCR-Fragment) und 25 U Restriktionsenzym (in der Regel 5 l) in das 1,5 ml-Rohr mit Sporozoiten oder Merozoiten ein.
   3. Übertragen Sie die Suspension auf einen nuklearen Transfektionsbecher. Den Becher in eine nukleare Transfernut legen.
   4. Schalten Sie die Nahrektionsvorrichtung mit dem Netzschalter ein und wählen Sie das Transfektionsverfahren U-033. Wenn das Nukleofection-Gerät im Modus "Freie Programmauswahl" gestartet wird, beenden Sie diesen Modus, indem Sie die X-Taste drücken.
   5. Wenn das Programm abgeschlossen ist, drücken Sie die X-Taste des Nukleofektionsgeräts, und der Bildschirm sollte OKanzeigen, was darauf hinweist, dass die Nukleofektion erfolgreich ist.
   6. Fügen Sie 0,5-1 ml Von Dulbeccoes Modified Eagle es Medium (DMEM)⁸ in den Nukleofection-Becher, um die Reaktion zu stoppen und die Suspension nach dem sanften Mischen auf 1,5 ml Rohr zu übertragen.

4. Cloakalinokulation oder intravenöse Injektion

1. Impfen Sie die Nukleofekten Parasiten zu 7 Tage alten Hühnern. Impfen Sie die Merozoiten von E. necatrix oder die Sporozoiten von E. tenella über den kloaken Weg, aber impfen Sie E. acervulina sporozoites durch intravenöse Injektion. Impfen Sie etwa 2 x 10⁷ Millionen Sporozoiten in jedes Huhn und inkoluieren Merozoiten 10⁷ für jeden Vogel.

5. Vermehrung und FACS-Sortierung

1. Sammeln Sie Oozysten aus Kot 5-9 Tage nach der Impfung mit transfizierten Sporozoiten. Sammeln Sie die Oozysten am dritten Tag nach der Impfung mit transfizierten Merozoiten.
2. Verwenden Sie fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und 150 mg/kg Pyrimethamin^8, um das transgene Populationsverhältnis sukzessive zu erhöhen.
   HINWEIS: Verwenden Sie Pyrimethamin, indem Sie es direkt in den Feed einfügen. Für eine bequemere Verwendung bereiten Sie wasserlösliches Pyrimethamin vor. 1 g Pyrimethamin in 0,2 ml pf_H2SO₄ und 9,8 ml N-Methylpyrrolidon (NMP) auflösen und dann 1,5 ml dieser Stammlösung in 1 L Trinkwasser für Vögel geben.

6. Optionale Säulenreinigung

HINWEIS: Wenn mehr reine Sporozoiten oder Merozoite benötigt werden, gibt es eine optionale Methode, die sie durch eine Diethylaminoethyl-52-Zellulosesäule (DE-52-Zellulose) reinigt.

1. Bereiten Sie die DE-52-Zellulosesäule mindestens einen Tag im Voraus vor.
   1. Vorbereiten des Glycin-Eluentenpuffers (Tabelle 1). Stellen Sie den pH-Wert des Glycin-Eluentenpuffers von 7,6 auf 8,0 und auf 41 °C vorgewärmt an.
   2. 2,5 g DE-52-Zellulose in die Säule geben. Wasser hinzufügen und über Nacht einweichen. Entsorgen Sie den Überstand.
   3. Wasser hinzufügen und 1 h einweichen. Den Überstand entsorgen.
   4. 0,1 M NaOH hinzufügen und mindestens 2 Stunden einweichen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
   5. Ersetzen Sie den Überstand durch Wasser. Nachdem sich die Zellulose vollständig auf den Boden (ca. eine halbe Stunde) gelegt hat, wiederholen Sie diesen Schritt.
   6. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 0,1 M HCl hinzu und tränken Sie ihn mindestens 2 Stunden lang. Wiederholen Sie diesen Schritt.
   7. Entsorgen Sie den Überstand und tränken Sie die Zellulose zweimal mit dem Glycin-Eluentenpuffer.
   8. Messen und einstellen Sie den pH-Wert von 7,6 auf 8,0, indem Sie 0,1 M HCl oder 0,1 M NaOH hinzufügen.
      HINWEIS: In diesem Teil hat die Flüssigkeit mindestens 5x mehr Volumen als die von DE-52 Cellulose.
2. Stellen Sie den Durchfluss zwischen 40-50 r/min ein.
3. Wenn die Sedimentation von Zellulose abgeschlossen ist, fügen Sie die Sporozoit- oder Merozoitsuspension in die chromatographische Säule ein. Stellen Sie den Durchfluss auf 30-40 r/min ein.
   HINWEIS: Setzen Sie die Sporozoit- oder Merozoitfällung mit Glycin-Eluentenpuffer aus, bevor Sie die chromatographische Säule hinzufügen.
4. Mit Glycin-Eluentenpuffer in 50 ml-Rohre sammeln. Stoppen Sie die Sammlung gemäß den Ergebnissen der mikroskopischen Untersuchung von Sporozoiten oder Merozoiten während des Elutionsprozesses.
5. Zentrifuge den bei 600 x g gesammelten Glycin-Eluentenpuffer für 10 min. Übertragen Sie den Sporozoit- oder Merozoitniederschlag in neue 1,5 ml-Rohre.
6. Zählen Sie die Sporozoiten oder Merozoiten mit einem Hämozytometer.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde verwendet, um eimerian Parasiten zu transfekten. In dieser Studie wurden die Meronten und Merozoiten der^2. Generation von E. necatrix in Abbildung 2A und Abbildung 2Bdargestellt, während Abbildung 2C und Abbildung 2D die Sporozysten und Sporozoiten von E. t...

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Diskussion

In den 1990er Jahren wurde ein Transfektionssystem für apicomplexan Parasiten entwickelt, und es wurde für Studien über eimerische Parasiten verwendet. Kürzlich wurde eine stabile Transfektion in E. tenella^8,9 und E. nieschulzi¹⁵durchgeführt. Wir erreichten die stabile Transfektion von E. necatrix durch transfizierende Merozoiten der zweiten Generation¹¹. Die Impfung der transfizierte...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP-disodium	Sigma	A26209
Cellulose DE-52	Solarbio	C8350
Constant Flow Pump	SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.	HL-2B
DMEM	MACGENE	CM15019
Glass beads	Sigma	Z250473-1PAK
Glucose	Sigma	No. V900116
Glycine	Biotopped	G6200
HBSS	MACGENE	CC016
KH2PO4	Sigma	No. V900041
Low Speed Centrifuge	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.	DT5-2
Magnetic Mixer	SCILOGEX	MS-H280-Pro
MgCl2	Sigma	449164
MoFlo cell sorter	BeckMan Coulter, US	201309995
NaHCO3	Sigma	144-55-8
Nucleofection device	LONZA/amaxa	90900012 (Nucleofector II)
PBS	Solarbio	P1010
Percoll (DG gradient stock solution)	GE Healthcare	17-0891-09
Sodium taurodeoxycholate hydrate	Sigma	T0875
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002430
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.
Trypsin	Solarbio	T8150
Vortex Mixer	Beijing North TZ-Biotech Develop.co.	HQ-60-II
Water Bath Thermostat	Grant Instruments (Cambridge), Ltd.	GD120,GM0815010