In Vitro Modell der koronaren Angiogenese

Zusammenfassung

In-vitro-Modelle der koronaren Angiogenese können für die Entdeckung der zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese verwendet werden. In-vitro-Explantationskulturen von Sinusvenosus und Endokardgewebezeigen weisen als Reaktion auf VEGF-A ein robustes Wachstum auf und weisen ein ähnliches Muster der COUP-TFII-Expression auf wie in vivo.

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen In-vitro-Kulturtest zur Untersuchung der koronaren Angiogenese. Herzkranzgefäße ernähren den Herzmuskel und sind von klinischer Bedeutung. Defekte in diesen Gefäßen stellen schwere Gesundheitsrisiken dar, wie z. B. bei Arteriosklerose, die bei Patienten zu Herzinfarkten und Herzinsinnen führen kann. Folglich ist die koronare Herzkrankheit eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Trotz seiner klinischen Bedeutung wurden relativ wenig Fortschritte bei der Regenerierung beschädigter Herzkranzgefäße erzielt. Dennoch wurden in jüngster Zeit Fortschritte beim Verständnis des zellulären Ursprungs und der Differenzierungswege der Entwicklung von Koronaren erzielt. Das Aufkommen von Werkzeugen und Technologien, die es Forschern ermöglichen, Vorläuferzellen fluoreszierend zu kennzeichnen, ihrem Schicksal zu folgen und Progenies in vivo zu visualisieren, hat entscheidend dazu beigetragen, die Entwicklung des koronaren Gefäßes zu verstehen. In-vivo-Studien sind wertvoll, haben aber Einschränkungen in Bezug auf Geschwindigkeit, Zugänglichkeit und Flexibilität im experimentellen Design. Alternativ können genaue In-vitro-Modelle der koronaren Angiogenese diese Einschränkungen umgehen und es Forschern ermöglichen, wichtige biologische Fragen mit Schnelligkeit und Flexibilität zu hinterfragen. Das Fehlen geeigneter In-vitro-Modellsysteme könnte den Fortschritt beim Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen des koronaren Gefäßwachstums behindert haben. Hier beschreiben wir ein In-vitro-Kultursystem zum Anbau von Herzkranzgefäßen aus dem Sinus venosus (SV) und dem Endokard (Endo), den beiden Vorläufergeweben, aus denen viele der Herzkranzgefäße entstehen. Wir bestätigten auch, dass die Kulturen einige der bekannten In-vivo-Mechanismen genau rekapitulieren. Zum Beispiel zeigen wir, dass die angiogenen Sprossen in der Kultur von SV DEN COUP-TFII-Ausdruck ähnlich dem, was in vivo beobachtet wird, herunterregulieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass VEGF-A, ein bekannter angiogener Faktor in vivo, die Angiogenese sowohl aus der SV- als auch aus der Endo-Kultur robust stimuliert. Gemeinsam haben wir ein genaues In-vitro-Kulturmodell entwickelt, um die koronare Angiogenese zu untersuchen.

Einleitung

Blutgefäße des Herzens werden gemeinhin als Herzkranzgefäße bezeichnet. Diese Gefäße bestehen aus Arterien, Venen und Kapillaren. Während der Entwicklung werden zunächst stark verzweigte Kapillaren etabliert, die sich dann in Herzkranzgefäße und Venen^1,2,3,4,5umbauen. Diese anfänglichen Kapillaren werden aus endothelialen Vorläuferzellen im Proepikardien, Sinusvenosus (SV) und Endokardgewebe (Endo)^1,6,7,8. SV ist das Zuflussorgan des embryonalen Herzens und Endo ist die innere Auskleidung des Herzlumens. Endotheliale Vorläuferzellen, die in der SV und Endo gefunden werden, bilden die Mehrheit der koronaren Vaskulatur, während das Proepikardie zu einem relativ kleinen Teil^davon2 beiträgt. Der Prozess, durch den das Kapillarnetz der Herzkranzgefäße im Herzen aus seinen bereits existierenden Vorläuferzellen wächst, wird als koronare Angiogenese bezeichnet. Koronare Herzkrankheit ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit und dennoch fehlt eine wirksame Behandlung für diese Krankheit. Das Verständnis der detaillierten zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese kann bei der Entwicklung neuartiger und effektiver Therapien zur Reparatur und Regenerierung beschädigter Herzkranzgefäße nützlich sein.

In jüngster Zeit wurde durch die Entwicklung neuer Werkzeuge und Technologien ein Anstieg unseres Verständnisses für die Entwicklung von Herzkranzgefäßen erreicht. Insbesondere die In-vivo-Linienkennzeichnung und fortschrittliche Bildgebungstechnologien waren sehr nützlich bei der Aufdeckung des zellulären Ursprungs und der Differenzierungswege von Herzkranzgefäßen^9,10,11,12. Trotz der Vorteile dieser In-vivo-Tools gibt es Einschränkungen in Bezug auf Geschwindigkeit, Flexibilität und Zugänglichkeit. Daher können robuste In-vitro-Modellsysteme In-vivo-Systeme ergänzen, um die zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese in einer Art und Weise mit hohem Durchsatz aufzuklären.

Hier beschreiben wir ein In-vitro-Modell der koronaren Angiogenese. Wir haben ein In-vitro-Explantenkultursystem entwickelt, um Herzkranzgefäße aus zwei Vorläufergeweben, SV und Endo, anzubauen. Mit diesem Modell zeigen wir, dass die In-vitro-Gewebeexplantationskulturen koronare Gefäßsprossen wachsen, wenn sie durch Wachstumsmedium stimuliert werden. Zusätzlich wachsen die Explant-Kulturen schnell im Vergleich zur Kontrolle, wenn sie durch den vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGF-A), ein hochwirksames angiogenes Protein, stimuliert werden. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die angiogenen Sprossen aus der SV-Kultur venös dedifferenziert werden (Verlust der COUP-TFII-Expression), ein Mechanismus ähnlich der SV-Angiogenese in vivo¹. Diese Daten deuten darauf hin, dass das In-vitro-Explantenkultursystem angiogene Ereignisse, die in vivo auftreten, originalgetreu wieder einführt. Zusammen genommen sind In-vitro-Modelle der Angiogenese, die hier beschrieben werden, ideal für die Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen der koronaren Angiogenese in einer hohen Durchsatz- und zugänglichen Weise.

Protokoll

Die Verwendung aller Tiere in diesem Protokoll folgte den Richtlinien des Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Etablierung von Mauszüchtern und Erkennen von Vaginalsteckern für zeitgedauerte Schwangerschaften

1. Richten Sie einen Mäusezuchtkäfig mit wilden männlichen und weiblichen Mäusen ein. Stellen Sie sicher, dass das Alter der Zuchtmäuse zwischen 6-8 Wochen liegt. Richten Sie entweder ein Paar (1 Männchen und 1 Hündin) oder als Trio (1 Männchen und 2 Hündin) für die Zucht ein.
2. Überprüfen Sie am nächsten Morgen einen Vaginalstecker. Verwenden Sie eine abgewinkelte Metallsonde, um einen tiefen Stecker zu erkennen, indem Sie ihn in die vaginale Öffnung einsetzen. Bezeichnen Sie den Morgen eines positiven Vaginalsteckers als embryonalen Tag 0.5 (e0.5).
   HINWEIS: Ein Vaginalstecker kann entweder oberflächlich (leicht sichtbar, siehe Abbildung 1)oder tief (was nicht leicht sichtbar ist) sein. Das Vorhandensein eines tiefen Steckers blockiert das vollständige Einsetzen der Sonde, während das Fehlen eines Steckers ein vollständiges Einsetzen ohne Widerstand ermöglicht.
3. Halten Sie die zeitliche Schwangerschaft aufrecht, bis die Embryonen e11.5 erreichen, an dem sie geerntet werden. Um die Schwangerschaft vor der Ernte von Embryonen zu bestätigen, erfassen Sie das Gewicht weiblicher Mäuse zwischen e7.5 und e11.5.
   HINWEIS: Die tägliche Erhöhung des Gewichts der Mutter deutet auf eine erfolgreiche Schwangerschaft hin, während keine Gewichtsänderung auf eine fehlgeschlagene Schwangerschaft hindeutet.

2. Ernte von Embryonen von schwangeren Mäusen

HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass sie über die folgenden Geräte und Reagenzien verfügen: eine CO2-Euthanasiekammer, 70 % Ethanol, Papiertücher, regelmäßige Zangen, feine Zangen, Scheren, 1x sterile Phosphat-gepufferte Kochstoffe (PBS), 10 cm sterile Petrischalen, Behälter mit Eis, perforierter Löffel, Dissektionsstereomikroskop.

1. Legen Sie eine e11.5 schwangere Maus in eine saubere CO₂ Euthanasiekammer, um sie zu opfern. Schließen Sie den Deckel der Kammer, um zu verhindern, dass die Maus entweicht.
2. Nachdem die Maus in der Euthanasiekammer gesichert ist, schalten Sie CO₂ein. Achten Sie darauf, den_{Co2-Durchfluss} pro IACUC-Empfehlungen zu regulieren (d. h. 10-30% Verdrängung pro Minute). Nachdem die Maus vollständig eingeschläfert wurde, führen Sie zervikale Dislokation durch, um den Tod zu gewährleisten.
3. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut mit Zangen über den Bauch, machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer Schere und verlängern Sie den Schnitt seitlich. Vergrößern Den Schnitt vor dem Zwerchfell und entlarven das Gebärmutterhorn, das die Embryonen enthält (Abbildung 2).
4. Ziehen Sie die Saite der Embryonen (Gebärmutterhorn + Embryonen) heraus, indem Sie die Gebärmutter greifen und frei schneiden. Legen Sie die Embryoneninin in eiskalte sterile 1x PBS.
5. Sezieren Sie die einzelnen Embryonen aus dem Gebärmutterhorn, indem Sie den Gebärmuttermuskel, den Dottersack und das Amnion eins nach dem anderen abschälen (Abbildung 3A-F) unter einem Stereomikroskop. Übertragen Sie die gereinigten Embryonen mit einem perforierten Löffel in eine Petrischale, die sterile 1x PBS auf Eis enthält. Achten Sie darauf, die Embryonen kalt zu halten.

3. Isolierherzen von e11.5 Embryonen

HINWEIS: Vor Beginn stellen Sie sicher, dass Sie die folgenden Geräte und Reagenzien haben: regelmäßige Zange, feine Zange, 1x sterile PBS, 10 cm sterile Petrischale, 6 cm sterile Petrischale, Behälter mit Eis, perforierter Löffel, DissektionStereomikroskop.

1. Richten Sie eine neue Petrischale mit eiskalten sterilen 1x PBS unter einem Stereomikroskop ein. Übertragen Sie einen Embryo aus Schritt 2.5 in die Petrischale, um das Herz zu sezieren.
2. Entfernen Sie den Kopf des Embryos mit Zangen. Drücken Sie zunächst den Kopf mit einer Hand zwischen die Zange und entfernen Sie dann den Kopf, indem Sie ihn mit der anderen Hand mit geschlossenen Zangen wegkratzen (Abbildung 4A-C).
3. Nach dem Entfernen des Kopfes, orientieren Sie den Embryo mit seiner ventralen Seite nach oben, indem Sie den Embryo mit Zange am Bauch mit einer Hand halten (Abbildung 4D).
4. Mit der anderen Hand, öffnen Sie die Brustwand des Embryos, indem Sie zuerst einen kleinen Schnitt in der Brust leicht über dem Zwerchfell mit feinen Zangen. Dann vergrößern Sie den Schnitt sehr sorgfältig, indem Sie geschlossene Zangen einsetzen und die Brustwand durch Öffnen der Zange reißen. Achten Sie darauf, nicht zu tief zu stoßen, was das Herz schädigen kann. Mit Hilfe der Zange, halten Sie die Brustwand weit offen, um das Herz und die Lunge in der Brusthöhle auszusetzen (Abbildung 4E).
5. Mit feinen Zangen bewegen Sie das Herz vorsichtig anterior (90°) und setzen Sie die dorsale Aorta/Vene aus. Ziehen Sie das Herz/die Lunge vordergründ heraus, indem Sie die dorsale Aorta/Vene an der Basis des Herzens erfassen (Abbildung 4F-H).
   HINWEIS: Seien Sie sanft beim Herausziehen des Herzens/der Lunge, um ein Reißen des SV zu vermeiden, der sich an der Rückenseite des Herzens befindet.
6. Spülen Sie das Herz/die Lunge mit kalten 1x PBS, um Blutzellen zu entfernen.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6, um das Herz/die Lunge von den verbleibenden Embryonen zu entfernen. Achten Sie darauf, das isolierte Herz/die Lunge auf Eis zu halten.

4. Isolieren von SVs und Ventrikeln von e11.5 Embryonale Mausherzen

1. Platzieren Sie die Petrischale mit Herz/Lunge aus Schritt 3.7 unter einem Stereomikroskop, um die SVs und ganzen Ventrikel zu isolieren. Die angehängten Lungenlappen eins nach dem anderen mit feinen Zangen von der Wurzel abziehen.
2. Richten Sie das Herz auf seiner Rückenseite aus und entfernen Sie Die vordergründigen Vorhöfe und das angrenzende Gewebe, das den SV vordergründ umgibt, ohne den SV zu zerreißen. Entfernen Sie die linke und rechte Vorstation aus dem Herzen, indem Sie an ihrer Basis halten und sie mit feinen Zangen abkratzen (Abbildung 5B). Entfernen Sie das benachbarte Gewebe, das den SV umgibt, mit einer ähnlichen Technik(Abbildung 5C).
   HINWEIS: Denken Sie daran, dass das richtige Atrium an den SV angeschlossen ist, also achten Sie darauf, nur das Atrium zu entfernen.
3. Um den SV zu isolieren, orientieren Sie zuerst das Herz mit seiner Dorsalseite nach oben (weil der SV auf der Dorsalseite ist) und halten Sie das Herz noch in dieser Position, indem Sie das Herz sanft an seinen Ventrikeln mit Zangen halten.
   HINWEIS: Der SV ist ein Zuflussorgan eines embryonalen Herzens, das zwischen den Vorhöfen auf der Rückenseite des Herzens liegt.
4. Entfernen Sie den SV, indem Sie ihn vorsichtig vom Herzen abschälen, wo er befestigt ist, oder indem Sie den SV mit feiner Zange an der Basis seiner Befestigung halten und ihn mit geschlossenen Zangen abkratzen (Abbildung 5D,E).
5. Den isolierten SV mit einer sterilen Transferpipette in eine neue 6 cm Petrischale mit eiskalter steriler 1x PBS auf Eis geben und die Petrischale als SV kennzeichnen.
6. Um die gesamten Ventrikel zu isolieren, entfernen Sie den Abflusstrakt (Aorta und Lungenstamm) aus dem Herzen, nachdem der SV entfernt wurde (Abbildung 5F,G).
7. Die ganzen Ventrikel mit einer sterilen Transferpipette in eine neue 6 cm Petrischale mit sterilen 1x PBS auf Eis geben und die Petrischale als Ventrikel kennzeichnen. Halten Sie den isolierten SV und ventrikel auf Eis.
8. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.7, um SVs und Ventrikel von den verbleibenden Herzen zu isolieren.

5. Einrichten von Tissue Culture Platten mit Einsätzen und extrazellulärer Matrixbeschichtung

HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass Sie folgende Geräte und Reagenzien haben: kommerzielle extrazelluläre Matrixlösung (ECM; z. B. Matrigel), 8,0 M Polyethylenterephthalat (PET) Kultureinsätze, 24 Wellplatten, 37 °C, 5% CO2-Inkubator.

1. Lassen Sie die ECM-Lösung auf Eis auftauen. Halten Sie die ECM-Lösung auf Eis, um eine Erstarrung zu vermeiden.
2. Legen Sie die PET-Membrankultureinsätze (Porengröße = 8,0 m, Filtrationsfläche = 0,3 cm², Filterdurchmesser = 6,5 mm) in die Brunnen der behandelten Nicht-Gewebekultur 24 Brunnenplatten. Beschriften Sie die Platten als SV oder Ventrikel für den SV bzw. die endokardialen Angiogenese-Assays.
   HINWEIS: Richten Sie die Einsätze in separaten Platten für den SV und die Ventrikel ein, wenn beide Kulturen gleichzeitig ausgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Bohrungen für alle experimentellen Proben und Kontrollen einrichten.
3. Nachdem die ECM-Lösung aufgetaut ist, sofort ECM 1:2 in vorgekühltem Basalmedium (d.h. EBM-2-Basalmedium, siehe Materialtabelle)auf ein ausreichendes Volumen (100 l/Einsatz x Anzahl der Einsätze) verdünnen.
   HINWEIS: Wenn es z. B. sechs Einsätze gibt, beträgt das Gesamtvolumen 100 l x 6 = 600 l. Fügen Sie 200 l ECM in 400 l Basalmedium hinzu.
4. Beschichten Sie die Einsätze mit 100 l frisch verdünntem ECM, indem Sie sie direkt auf die Membran legen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für mindestens 30 min, damit das ECM erstarren kann.
   HINWEIS: Dies muss unter einer laminaren Strömungsgewebekulturhaube durchgeführt werden, um eine Kontamination zu vermeiden.

6. SVs und ganze Ventrikelkulturen

HINWEIS: Vor Beginn, stellen Sie sicher, die folgenden Geräte und Reagenzien zu haben: 70% Ethanol, Transferpipette, Stereomikroskop, Zange, laminare Flussgewebe Kultur Haube, mikrovaskuläre endotheliale Zelle Ergänzung Kit (Tabelle der Materialien), Basalmedium, 1x sterile PBS). Abbildung 6 zeigt den Arbeitsablauf der SV- und Ventrikelkultur.

1. Den Inhalt des Ergänzungskits auf Eis auftauen. Bereiten Sie das komplette Medium vor, indem Sie den gesamten Inhalt des Ergänzungskits in 500 ml Basalmedium unter einer zertifizierten laminaren Strömungsgewebekulturhaube hinzufügen. Mischen Sie das Medium gut und verteilen Sie in 50 ml Aliquots.
2. Sterilisieren Sie die Basis des Stereomikroskops und den umgebenden Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.
3. Erhalten Sie die Gewebekulturplatten aus Schritt 5.4. Mit Hilfe einer Transferpipette die Expflanzen aus Schritt 4.7 vorsichtig auf die Insert-Membran übertragen. Unter einem Stereomikroskop und mit Hilfe von sauberen Zangen, positionieren Sie die Explants in der Mitte der Einsätze, um sicherzustellen, dass sie nicht in der Ecke der Einsätze stecken oder an den Seitenwänden befestigt sind.
4. Nachdem die Explants platziert und auf die Einsätze zentriert sind, entfernen Sie vorsichtig alle zusätzlichen PBS aus den Einsätzen und schließen Sie die Deckel der Platten.
5. Fügen Sie unter einer laminaren Strömungsgewebekulturhaube 100 l des vorgewärmten kompletten Mediums auf die Einsätze und 200 l in die Brunnen ein, um die Explanten an der Luft-Flüssig-Schnittstelle so zu kultivieren, dass die Basaloberfläche des Einsatzes mit dem Medium in Kontakt steht. , aber die obere Oberfläche ist der Luft ausgesetzt.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Lautstärke anpassen, um eine Luft-Flüssig-Schnittstelle zu erhalten, wenn Sie ein einsetzende Einsätze/Wellplatten unterschiedlicher Größe verwenden.
6. Fügen Sie 300 l PBS in die ungenutzten Brunnen der 24 Brunnenplatten und decken Sie mit dem Deckel ab. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator, und wachsen die Kulturen für 5 Tage.
7. In den folgenden Tagen beobachten Sie routinemäßig die Kulturen unter einem invertierten Lichtmikroskop, um den Status der Explantkulturen zu beurteilen. Stellen Sie sicher, dass die Explanten kontraktil schlagen und dass alle Explants an der Unterseite der mit ECM eingebetteten Membran befestigt sind. Beachten Sie alle schwimmenden Explants.
   HINWEIS: Die periodische Kontraktion der Explanten zeigt an, dass sie am Leben sind. Schwimmende Explanten sollten in der Analyse weggelassen werden.
8. Nach der Bewertung des Kulturstatus, legen Sie die Kulturplatte wieder in den Inkubator und weiter die Kultur für bis zu 5 Tage wachsen.

7. Behandlung von Kulturen mit VEGF-A (Positive Control)

HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass die folgenden Geräte und Reagenzien: laminare StrömungSgewebe-Kulturhaube, 1x PBS, Basalmedium + 1% fetales Rinderserum (FBS), Basalmedium + VEGF-A, Pipetten und Pipettenspitzen haben.

1. Bereiten Sie das Basalmedium + 1% FBS und das Basalmedium + VEGF-A vor.
   1. Um das Basalmedium + 1% FBS vorzubereiten, bestimmen Sie zunächst die Anzahl der benötigten Kontrollbrunnen. Wenn es z. B. drei Steuerbrunnen gibt, dann ist 300 l/well x 3 = 900 l das gesamt benötigte Volumen. Fügen Sie 9 l FBS in 891 l Basalmedium hinzu, um das Basalmedium + 1% FBS zu bilden.
   2. Um das Basalmedium + VEGF-A vorzubereiten, bestimmen Sie zunächst die Gesamtzahl der Brunnen, die VEGF-A-Medium benötigen. Wenn es drei Brunnen gibt, dann sind 300 l/well x 3 = 900 l das Gesamtvolumen und 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A. Fügen Sie 150 ng VEGF-A in 900 l Basalmedium hinzu, um das Basalmedium + VEGF-A herzustellen.
      HINWEIS: Montieren Sie diese Lösung mit einem größeren Volumen als berechnet, um eine ausreichende Anzahl kleinerer Aliquots für jedes Experiment zu versichern.
2. Entfernen Sie am 2. Tag die Medien aus beiden Kammern (die Einsätze und die Brunnen). Waschen Sie Kulturen mit 300 l 1x PBS, indem Sie den Einsätzen 100 l und die Bohrungen 100 l und die Bohrungen um 200 l ergänzen. Die Platten ein paar Mal fest wirbeln und die PBS entfernen.
3. Fügen Sie 300 l Basalmedium + 1% FBS (100 l in den Einsatz und 200 l in die Brunnen) hinzu, um die Kulturen für 24 h auszuhungern.
4. Am 3. Tag nach dem Hungertod 300 l Basalmedium + 1% FBS (100 l in den Einsatz und 200 l in die Brunnen) in die Steuerbrunnen bzw. Basalmedium + VEGF-A (50 ng/well) in die Behandlungsbrunnen geben.
5. Nach der Behandlung, weiter die Kulturen im Brutkasten wachsen.

8. Fixierung und Immunostainierung

HINWEIS: Stellen Sie vor Beginn die folgenden Geräte und Reagenzien sicher: 4% Paraformaldehyd (PFA), 1x PBS, primär- und sekundäre Antikörper, einen Shaker, 0,5% nichtionisches Tensid in PBS (PBT).

1. Am sechsten Tag der Kultivierung, entfernen Sie die Medium und Waschkulturen mit 1x PBS bei Raumtemperatur (RT).
   1. Fixieren Sie die Kulturen, indem Sie den Bohrstellen 200 L 4% PFA-Lösung und den Einsätzen 100 l hinzufügen. Feste Kulturen in 4 °C für 20 min beim Schaukeln.
   2. Nach 20 min Fixierung PFA in einer Dunstabzugshaube aus den Kulturen entfernen und die Kulturen mit 1x PBS waschen, indem Sie 200 l in die Brunnen und 100 l in die Einsätze geben.
   3. Wiederholungswähbe 3x, je 10 min, beim Schaukeln. Fahren Sie dann mit der Immunfärbung fort.
      HINWEIS: Alle Waschschritte werden auf einer Tischplatte bei RT durchgeführt.
2. Verdünnung primärer Antikörper (Anti-VE-Cadherin, Anti-ERG 1/2/3) in Blockierlösung (5% Eselserum, 0,5% PBT). Fügen Sie 300 l primärer Antikörperlösung (200 l in den unteren Brunnen und 100 l in die Einsätze) ein. Inkubieren Sie Kulturen in primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln.
   HINWEIS: Anti-VE-Cadherin wird verwendet, um die endotheliale Zellmembran zu beschriften und Anti-ERG 1/2/3 wird verwendet, um den Endothelzellkern zu beschriften, um die angiogenen Sprossen von Endothelzellen zu visualisieren.
3. Am nächsten Tag die Kulturplatten 10x in 0,5% PBT waschen und rocken, pbT alle 10 min wechseln.
4. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper (Esel Anti-Ratte Alexa Fluor 488 und Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555) in Blockierlösung. Fügen Sie 300 l des sekundären Antikörpers wie in Schritt 8.2 hinzu und bebrüten die Kulturen über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln. Am nächsten Tag die sekundären Antikörper 10x in PBT waschen und PBT alle 10 min wechseln.
   HINWEIS: Waschen Sie mindestens 10x, aber mehr Wäschen sind besser. Nachdem die Wässer abgeschlossen sind, können die Kulturen mit 1x PBS gelagert werden, bis sie auf Dias montiert werden.

9. Montage kulturen auf Dias, Imaging und Analyse

HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass die folgenden Geräte und Reagenzien: feine Zange, Dias, Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Abdeckungen und konfokale Mikroskop. Nach der sekundären Antikörperfärbung montieren Sie die Kulturen mit den folgenden Schritten zur Bildgebung auf Dias.

1. Ziehen Sie die Membran vorsichtig vom Einsatz mit feinen Zangen ab und übertragen Sie sie auf die Dias, indem Sie die Membranseite nach unten legen und die Explantkulturen nach oben setzen. Platzieren Sie die Replikationsproben in denselben Folien, und beschriften Sie die Folien als Steuerelement oder VEGF-A. Fügen Sie ein paar Tropfen Montagemedium mit DAPI direkt auf die Membran und bedecken Sie die Dias mit Deckelscheinen.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden, während Sie die Abdeckungen platzieren.
2. Die Ränder der Dias mit klarem Nagellack abdichten und trocknen lassen.
   HINWEIS: Dias können für eine Langzeitlagerung in -20 °C gelagert werden.
3. Bilddiagleitet mit einem konfokalen Mikroskop.
4. Führen Sie Analysen durch, um die Länge des angiogenen Auswuchses zu messen. Quantifizieren Sie die angiogene Auswuchslänge, indem Sie den Abstand der Endothelzellen (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) messen, die sich von der Innengrenze der ERG 1/2/3+-Zellen in den Ventrikelkulturen und vom Zentrum der SV-Explantationen in den SV-Kulturen ausdehnt.
   1. Um die Quantifizierung mit FIJI/ImageJ durchzuführen, laden Sie zuerst FIJI Software herunter.
   2. Bilddateien in FIJI öffnen: Gehen Sie zu Datei | Öffnen | Ordner | Dateiname | Öffnen.
   3. Gehen Sie zu Analysieren | Festlegen von Messungen | Wählen Sie Perimeter.
   4. Wählen Sie das Werkzeug Gerade Linie aus dem Hauptfenster aus.
   5. Zeichnen Sie eine Linie über die Länge eines Keims, wie in Schritt 9.4 vorgeschlagen.
   6. Gehen Sie zu Analysieren | Maßnahme.
      HINWEIS: Längenmessungen werden im neuen Fenster angezeigt.
   7. Führen Sie die Quantifizierung in Bildern durch, die mindestens drei zufällig ausgewählte Sichtfelder darstellen. Durchschnittlich die Sprossenlängenmessungen und melden Sie sie als Mittelwert - Standardabweichung.

Ergebnisse

Eines der auffälligsten Merkmale der SV-Angiogenese in vivo ist, dass sie einem bestimmten Weg folgt und Zelldedifferenzierungs- und Redifferenzierungsereignisse beinhaltet, die zu stereotypen Zeiten und Positionen¹auftreten. Da die ersten SV-Zellen auf den Herzventrikel wachsen, stellen sie die Produktion von venösen Markern wie COUP-TFII (Abbildung 7) ein. Anschließend nehmen koronare Sprossen zwei Migrationspfade, entweder über ...

Diskussion

Einige der wichtigsten Schritte für den erfolgreichen Anbau von Herzkranzgefäßen aus dem SV- und Endo-Vorläufergewebe sind: 1) Korrekte Identifizierung und Isolierung des SV-Gewebes für die SV-Kultur; 2) Verwendung von Ventrikeln aus Embryonen im Alter von e11-11,5 für eine genaue Endo-Kultur; 3) Aufrechterhaltung steriler Bedingungen während der gesamten Sezierzeit und halten das Gewebe zu jeder Zeit kalt; und 4) Beibehaltung der Anspannung der ECM-beschichteten Membran, um zu vermeiden, dass Gewebe im Medium sch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 20 MM Tissue Culture Dish	Fisher Scientific	877222	Referred in the protocol as Petri dish
24-well plates	Fisher Scientific	08-772-51
8.0 uM PET membrane culture inserts	Millipore Sigma	MCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555	Fisher Scientific	A31572	Secondary antibody
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488	Fisher Scientific	A21206	Secondary antibody
Angled Metal Probe	Fine science tools	10088-15	Angled 45 degree, used for detecting deep plugs
Anti- ERG 1/2/3 antibody	Abcam	Ab92513	Primary antibody
Anti- VE-Cadherin antibody	Fisher Scientific	BDB550548	Primary antibody, manufacturer BD BioSciences
CO2 gas tank	Various suppliers	N/A
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13998223	For 37 °C, 5% CO2 incubation
Dissection stereomicrosope	Leica	S9i	Leica S9i Stereomicroscope
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156	Endothelial cell growth basal media
ECM solution	Corning	354230	Commercially known as Matrigel
EGM-2 MV Singlequots Kit	Lonza	CC-4147	Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007003IR
FiJi	NIH	NA	Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fine Forceps	Fine science tools	11412-11	Used for embryo dissection
Fisherbrand Straight-Blade operating scissors	Fisher Scientific	13-808-4
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	SH-302-5601LR
Laminar flow tissue culture hood	Fisher Scientific	various models available
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1200	Vectashield with DAPI
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy/Fisher	50-980-494	This is available at 32%; needs to be diluted to 4%
Perforated spoon	Fine science tools	10370-18	Useful in removing embryo/tissues from a solution
Recombinant Murine VEGF-A 165	PeproTech	450-32
Standard forceps, Dumont #5	Fine science tools	11251-30
Sure-Seal Mouse/Rat chamber	Easysysteminc	EZ-1785	Euthanasia chamber