Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Die mikroskalige Thermophorese erhält schnell Bindungskonstanten bei geringen Materialkosten. Entweder gekennzeichnete oder markierungsfreie mikroskalige Thermophorese ist kommerziell erhältlich; Die markierungsfreie Thermophorese ist jedoch nicht in der Lage, die Vielfalt der Wechselwirkungsmessungen zu erreichen, die mit fluoreszierenden Markierungen durchgeführt werden können. Wir bieten ein Protokoll für markierte Thermophoresemessungen an.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, die Bindungsaffinität von Lipiden an Proteine zu bestimmen, ist ein wesentlicher Bestandteil des Verständnisses von Protein-Lipid-Wechselwirkungen beim Membrantransport, der Signaltransduktion und dem Zytoskelett-Umbau. Klassische Werkzeuge zur Messung solcher Wechselwirkungen sind die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC). Obwohl diese Ansätze mächtige Werkzeuge sind, haben sie Rückschläge. ITC erfordert große Mengen an gereinigtem Protein sowie Lipiden, die teuer und schwierig herzustellen sein können. Darüber hinaus sind sowohl ITC als auch SPR sehr zeitaufwendig, was die Kosten für die Durchführung dieser Experimente erheblich erhöhen könnte. Eine Möglichkeit, diese Einschränkungen zu umgehen, besteht darin, die relativ neue Technik der Mikroskalen-Thermophorese (MST) zu verwenden. MST ist schnell und kostengünstig, wenn kleine Probenmengen verwendet werden, um eine Sättigungskurve für ein bestimmtes Bindungsereignis zu erhalten. Derzeit stehen zwei Arten von MST-Systemen zur Verfügung. Eine Art von MST erfordert die Kennzeichnung mit einem Fluorophor im blauen oder roten Spektrum. Das zweite System beruht auf der intrinsischen Fluoreszenz aromatischer Aminosäuren im UV-Bereich. Beide Systeme erkennen die Bewegung von Molekülen als Reaktion auf die lokalisierte Induktion von Wärme durch einen Infrarotlaser. Jeder Ansatz hat seine Vor- und Nachteile. Markierungsfreie MST kann native Proteine ohne Tags verwenden; Viele Analyten, einschließlich Pharmazeutika, fluoreszieren jedoch im UV-Bereich, was die Bestimmung genauer _KD-Werte beeinträchtigen kann. Im Vergleich dazu ermöglicht die markierte MST eine größere Vielfalt messbarer paarweiser Wechselwirkungen unter Verwendung fluoreszierend markierter Sonden, die an Liganden mit messbaren Absorptionen im sichtbaren Bereich im Gegensatz zu UV befestigt sind, wodurch das Potenzial für Störsignale von Analyten begrenzt wird.

Einleitung

Die mikroskalige Thermophorese ist eine relativ neue Technik zur Bestimmung von Dissoziationskonstanten (KD) sowie Hemmungskonstanten (_IC50) zwischen biochemisch relevanten Liganden. Der führende kommerzielle Einzelhändler für MST (z. B. NanoTemper) bietet zwei beliebte MST-Technologien an: 1) labelfreie MST, die einen fluoreszierenden Tag erfordert, und 2) markierte Thermophorese, die die inhärente Fluoreszenz von Proteinen in Abhängigkeit von der Anzahl der in jedem Protein vorhandenen aromatischen Rückstände ^verwendet1. Ein Nachteil der markierungsfreien Thermophorese besteht darin, dass sie in den meisten Fällen keine Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zulässt. Es könnte jedoch möglich sein, Proteine ohne aromatische Aminosäuren wie Tryptophan für die Verwendung in der markierungsfreien Thermophorese zu ^entwickeln2.

MST misst die Bewegung von Partikeln als Reaktion auf die Induktion mikroskopischer Temperaturfelder, die von einem Infrarotlaser in derzeit verfügbaren Technologien initiiert ^werden1. MST kann verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen, Protein-Lipid-Interaktionen, Protein-Kleinmolekül-Experimente, Wettbewerbsexperimente und sogar Interaktionen zwischen kleinen Molekülen zu messen, solange man eine ausreichende Signaltrennung erzeugen kann. Darüber hinaus ermöglicht MST die Messung von Membran-Protein-basierten Interaktionen, die entweder in Liposomen oder Nanoscheiben eingebettet sind. Die markierte Thermophorese nutzt die Verwendung fluoreszierend markierter Tags, die eine chemisch kontrollierbare Trennung des Signals zwischen Ligand und Analyt ermöglichen. _KD-Werte können mittels Thermophorese für Wechselwirkungen mit Proteinbindung bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen erhalten werden, was in den meisten Fällen eine viel niedrigere Proteinkonzentration darstellt als für die isotherme Kalorimetrie (ITC)^3. Darüber hinaus hat MST keine strengen Pufferanforderungen, wie sie für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)4 erforderlich sind^, und die markierte Thermophorese kann sogar verwendet werden, um Bindungskonstanten von Proteinen von Interesse aus nicht vollständig gereinigten ^{Proteinlösungen5} mit genetisch eingefügten fluoreszierenden Tags zu ^messen6. Ein Nachteil von MST ist, dass kinetische Parameter für MST wie in ^SPR2 nicht ohne weiteres erhalten werden können.

Thermophoresemessungen hängen von der lokalen Temperaturdifferenz einer Lösung ab. Diese Wärme kann von einem Infrarotlaser erzeugt werden. Das MST-Gerät verfügt über einen Fluoreszenzdetektor, der an einen Infrarotstrahl (IR) gekoppelt ist und Änderungen der Fluoreszenz durch lokale Konzentrationsänderungen der fluoreszierenden Moleküle an dem Punkt aufnehmen kann, an dem der IR-Laser anvisiert wird. Das MST-Gerät verwendet einen IR-gezielten Laser, der direkt mit einem Fluoreszenzdetektor gekoppelt ist, der auf den gleichen Punkt fokussiert ist, an dem die Wärme in der Lösung erzeugt wird. Dies ermöglicht eine robuste Detektion von Temperaturänderungen, die der Erschöpfung von Molekülen an der vom IR-Laser erzeugten Wärmestelle entsprechen. Die gemessene Fluoreszenz nimmt im Allgemeinen näher am IR-Laser als Reaktion auf Temperaturerhöhungen ab. Die als Ergebnis gemessenen Unterschiede können auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein, darunter Ladung, Größe oder Solvatationsentropie. Diese Unterschiede werden als Änderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf die Induktion von Wärme oder die Bewegung von Molekülen von heißen zu kälteren Teilen der Kapillare gemessen.

Beim Laden einer Kapillare mit einer gegebenen Lösung ist es wichtig, Luft an beiden Enden der Kapillare zu belassen und die Kapillare nicht vollständig voll zu laden. Die kommerzielle Kapillare fasst etwa 10 μL Lösung. Man kann genaue Messungen mit 5 μL Lösung erreichen, solange die Lösung bis zur Mitte der Kapillare manipuliert wird, es keine Luftblasen gibt (möglicherweise vor dem Laden der Kapillare entgasen) und man vorsichtig ist, das Rack zu laden, um die Lösung nicht aus der Mitte der Kapillare zu drängen, wo der Infrarotlaser anvisiert wird. Wenn der Laser nicht vollständig mit der Lösung in Berührung kommt, wird das Ergebnis höchstwahrscheinlich einer von drei unbrauchbaren Ausgängen für diese Konzentration sein: 1) keine oder niedrige Fluoreszenzdetektion, 2) höhere Fluoreszenzdetektion (möglicherweise mit gezacktem Peak) oder 3) Fluoreszenzdetektion innerhalb anderer Werte aus gegebener Titration, jedoch mit einem gezackten und ungerundeten Peak.

Für die markierte Thermophorese ist es optimal, ein Fluoreszenzsignal über 200 und unter 2000 Fluoreszenzeinheiten zu ^haben7. Das MST-Gerät verwendet einen Bereich von LED-Intensitäten von 0 bis 100, die ausgewählt werden können, um ein Signal über 200 oder unter 2000 zu erreichen. Alternativ kann man verschiedene Konzentrationen des markierten Liganden verwenden, um das Fluoreszenzsignal auf ein optimales Niveau zu modifizieren. Es ist wichtig, bei der Datenanalyse einen Cap-Scan mit einer bestimmten MST-Messung als Referenz durchzuführen, da ein schlechter Cap-Scan oft zu einem Punkt führen kann, der später als Ausreißer eingestuft werden kann. Jeder Durchlauf sollte ungefähr 30 Minuten dauern, wenn eine einzelne MST-Leistung mit einem Cap-Scan gemessen wird. Die kommerziellen Geräte ermöglichen Änderungen der MST-Leistung. In älteren Softwareversionen konnte dies von 0 auf 100 eingestellt werden; und in späteren Versionen kann man niedrige, mittlere oder hohe MST wählen. Um robuste Ablaufverfolgungen zu erhalten, muss ein Forscher möglicherweise jede dieser Ablaufverfolgungen ausprobieren und entscheiden, welche MST-Einstellung zu den robustesten Daten für eine bestimmte Interaktion führt.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Materialien

1. Herstellung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 und 2 mM _KH2PO4, pH 7,41.
2. Bereiten Sie NTA-Atto 647 N Farbstoff vor. Verdünnen Sie den NTA-Atto 647 N-Farbstoff auf 100 nM von einer 100%igen DMSO-Lösung in PBS ohne Tween.
3. Express Vam7-His8 – Protein als Fusionsprotein in E. coli und Reinigung mittels Ni-NTA und Größenausschlusschromatographie8.
4. Titrieren Sie den Analyten im PBS-Puffer. Wenn sich der Analyt in einem anderen Puffer befindet, ist der markierte MST nicht besonders empfindlich gegenüber geringfügigen Pufferunterschieden von Molekülen wie DMSO, es sei denn, der Gehalt des Analytpuffers interagiert mit dem markierten Protein.

2. Vorbereitung des MST-Geräts

1. Schalten Sie den Netzschalter auf der Rückseite des Geräts ein.
2. Öffnen Sie die Steuerungssoftware und stellen Sie sicher, dass der Laptop auf dem an das Gerät angeschlossenen Computer eingeschaltet und verbunden ist.
3. Geben Sie die Fluoreszenz- und MST-Einstellungen für dieses Experiment ein. Stellen Sie MST Before auf 3 s, MST auf 30 s und Fluoreszenzrückgewinnung (Fluo.) nach 1 s ein. Vorher misst die anfängliche Fluoreszenz und benötigt keine langen Zeiten; MST ist die tatsächliche Zeitspanne, in der das Gleichgewicht nach der Wärmeinduktion erreicht werden muss.
4. Tabelle der Kapillaren: Geben Sie für jedes Kapillarröhrchen den Namen des Ziels (Liganden), den Namen des Liganden (Analyten), die Konzentration des Ziels und die höchste Titrationskonzentration ein und verwenden Sie das Autofill-Titrationsverhältnis. Geben Sie beispielsweise 50 nM für die Zielkonzentration von Vam7-His8, Vam7-His8 für den Zielnamen, (1,2-Dioctanoylphosphatidsäure) Di-C8 PA für den Ligandennamen und die höchste Konzentration des Liganden ein, der 1:1 auswählt und zu den Autofill-Steckplätzen 2-16 nach unten zieht.
5. Führen Sie einen Cap Scan durch, um die entsprechende LED (20% LED (Preset)) basierend auf dem Signal des Zielproteins auszuwählen und zwischen 200 und 2000 Fluoreszenzeinheiten für markierte MST einzustellen. Cap Scans sollten einheitliche, abgerundete glockenförmige Spitzen zeigen.
6. Wählen Sie einen Bereich von MST-Leistungen aus und geben Sie Werte für jeden ein, um die robusteste Bindungsanpassung zu testen, und drücken Sie Start Cap Scan + Measurement, wobei verschiedene Werte gescannt werden, um die besten Betriebsbedingungen für die zu testende Interaktion zu bestimmen.
7. Bestimmen Sie die MST-Leistung mit einer optimalen Passform mit der Analysesoftware und der Voreinstellung für die Thermophorese mit Tjump. Analysieren Sie die Anpassungen entsprechend der meisten Fluoreszenztrennung zwischen niedrigster und höchster Konzentration im Vergleich zur MST-Leistung mit der besten Passform und wählen Sie die MST-Leistung für Replikationsversuche.
8. Stellen Sie fest, ob zwischen dem ersten und zweiten Durchlauf Photobleaching stattgefunden hat, indem Sie zur Analysesoftware gehen und die Analyse in den Expertenmodus schalten. Als nächstes wählen Sie Fluoreszenz anstelle von Thermophorese für die Analyse. Wählen Sie den Expertenmodus und dann das Fotobleichen.

3. Vorbereitung von Proben für etikettierte MST

1. Bringen Sie die Vam7-His8-Lösung auf eine Konzentration von 200 nM in PBS ohne Tween.
2. Bringen Sie den NTA-Atto 647 Farbstoff auf 100 nM in PBS ohne Tween.
3. Mischen Sie den Farbstoff Vam7-His8 und NTA-Atto 647 in einem volumetrischen Verhältnis von 1:1 und lassen Sie ihn 30 min bei Raumtemperatur sitzen, die von Licht bedeckt ist. Bestimmen Sie die geeignete Konzentration des Zielproteins gemäß Abschnitt 2.5 (siehe Ergänzung zur Verwendung von KD von Ni-NTA-Farbstoff wie im Video gezeigt).
4. Zentrifugenmischung aus NTA-Atto 647 N-Farbstoff und Protein für 10 min in einem dunklen Raum mit einer Tischzentrifuge bei ca. 8.161 x g.
5. Die Mischung nach dem Experiment bei 4 °C oder während des Experiments auf Eis lagern, um sie bei Bedarf innerhalb weniger Stunden wiederzuverwenden, um eine Denaturierung des Proteins zu verhindern.
6. Verwenden Sie den NT-Konzentrationsfinder, um den für die Titration erforderlichen Konzentrationsbereich zu bestimmen.
7. Bringen Sie Di-C8 PA auf die entsprechende maximale Konzentration in Wasser.
8. Titrieren Sie den Analyten mit einer seriellen 1:1-Verdünnung im PBS-Puffer für 16 Konzentrationen basierend auf dem vorherigen Schritt. Im Gegensatz zu SPR ist die Thermophorese nicht so empfindlich gegenüber Pufferunterschieden.

4. MST von Proben

1. Schalten Sie das Gerät und den angeschlossenen Laptop ein.
2. Drücken Sie den Aufwärtspfeil an der Vorderseite des Geräts und schieben Sie das Kapillargestell heraus.
3. Laden Sie Kapillaren im Rack mit der höchsten Konzentration an Position 1.
4. Wählen Sie in der Steuerungssoftware den Roten Kanal aus, der NTA-Atto 647 N entspricht.
5. Geben Sie Konzentrations-, Positions- und Namensinformationen für jede Kapillare in die Tabelle der Kapillaren ein.
6. Führen Sie einen Kapillarscan durch, indem Sie auf Start Cap Scan bei 20% LED (voreingestellt) klicken und zwischen 200 und 2000 Fluoreszenzeinheiten entsprechend einstellen, indem Sie entweder LED-Intensitätseinstellungen oder die Konzentration des Liganden (markiertes Protein) verwenden.
7. Wählen Sie einen Bereich der MST-Leistung aus.
8. Starten Sie Cap Scan + MST-Messung.
9. Analysieren Sie mit der Analysesoftware.

5. Analyse von MST-Daten

HINWEIS: Die von Nanotemper bereitgestellte Analysesoftware ist proprietär und wird mit M.O. Affinity Analysis durchgeführt. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, Bindungsaffinitäten basierend auf Fluoreszenz oder Thermophorese zu messen. Neuere Versionen dieser Software sind voreingestellt, um Daten mithilfe der Thermophorese automatisch auszuwerten, und sind für die Verwendung der Thermophorese voreingestellt, wobei Tjump beide Messungen nutzt. Alternativ kann man entweder Tjump alone oder Thermophorese alone wählen. Darüber hinaus ermöglicht die Analysesoftware geschätzte Affinitätsmessungen unter Verwendung der anfänglichen Fluoreszenz. Auf diese Einstellungen kann nur im Expertenmodus zugegriffen werden.

1. Stellen Sie die Auswertungsstrategie in der Analysesoftware auf expert ein, indem Sie auf das Kästchen für den Blitz neben einem Datensatz im Datenauswahlbildschirm klicken. Die Analysesoftware ist für die Analyse auf MST-Analyse voreingestellt. Ein Forscher kann jedoch Neue Analyse erstellen und Initiale Fluoreszenzanalyse auswählen, um Bindungsaffinitäten basierend auf der anfänglichen Fluoreszenz zu schätzen. Der Expertenmodus ist auch für die anfängliche Fluoreszenz verfügbar. In der unten beschriebenen Analyse wurden Thermophorese und Tjump verwendet, um das KD des vorgestellten Vam7-His8 mit seinem natürlichen Substrat, der Lipidphosphatidsäure, zu bestimmen.

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Ergebnisse

Dies ist eine Beispielausgabe, die die Affinitätsanalyse verwendet. Die markierte MST wurde verwendet, um die Bindungskonstante des Vam7-His8 an das lösliche Dioctanoyl (DiC8) PA eines seiner natürlichen Substrate zu ^bestimmen9. Abbildung 1 zeigt die thermophoretischen Spuren aus einem Versuch einer 1:1-Titration von DiC8 PA ab 500 μM gegenüber 50 nM Vam7-His8. Die anfängliche Fluoreszenz (Zeit vor dem Einschalten des Infrarotlasers), Tjump (Zeit nach dem Einsch...

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Diskussion

Die Bestimmung der Vam7-His8-Bindung an DiC8-PA ergab ein robustes angepasstes KD für die gegebene Wechselwirkung, das eine etwas geringere Affinität aufweist als das gemessene _KD von Vam7-His8 zu PA-Liposomen (unveröffentlicht). Dieser Unterschied ist höchstwahrscheinlich auf das Fehlen einer Membran zurückzuführen, was im Allgemeinen zu einer geringeren Affinität für membranspezifische Lipidbindungsinteraktionen führt und daher die Rolle des Liposomenme...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	For protein labeleing
Graphpad Prsim	Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)	Nanotemper	MO-K022	Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid for binding experiments