Universelles und effizientes Elektroporationsprotokoll für die Gentechnik von gastrointestinalen Organoiden

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Elektroporationsmethode zur Transfektion von vier verschiedenen gastrointestinalen organoiden Entitäten mit größeren Plasmiden (bis zu 10 kB). Es kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden und benötigt keine umfangreiche Vorbereitung oder spezielle, kostenintensive Elektroporationspuffer.

Zusammenfassung

Elektroporation ist eine gängige Methode zur Transfektion mit verschiedenen Arten von Molekülen durch elektrische Permeabilisierung der Plasmamembran. Mit dem zunehmenden Einsatz von Organoiden als Kultivierungsmethode für Primärpatientenmaterial in den letzten Jahren sind effiziente Übertragungsmethoden von Komponenten für die Gentechnik in diesem 3D-Kultursystem notwendig. Besonders bei Organoiden hängt die Effizienz genetischer Manipulationen von einer erfolgreichen Transfektion ab. So wurde dieses Protokoll entwickelt, um die Elektroporation von Organoiden zu erleichtern und seine universelle Funktionalität in verschiedenen Einheiten zu beweisen. Humane Dickdarm-, Bauchspeicheldrüsen-, Leber- und Magenkrebs-Organoide wurden im Vergleich mit kleinen und großen Plasmiden erfolgreich elektropoiert. Basierend auf GFP-Codierungsvektoren wurde die Transfektionseffizienz von FACS bestimmt. Eine umfangreiche Vorbereitung der Zellen oder spezielle, kostenintensive Elektroporationspuffer sind nicht erforderlich, und das Protokoll kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden.

Einleitung

In den letzten Jahren wurde ein neuartiges 3D-Zellkultursystem, die so genannten Organoide, für verschiedene normale und krebserende Gewebe entwickelt. Organoide sind funktionell und morphologisch sehr nah an ihrem Ursprungsgewebe. Sie können aus verschiedenen Arten erzeugt werden, sind leicht erweiterbar, genomstabil und genetisch veränderbar, was sie zu einem idealen Modellsystem für genetische Untersuchungen^1,2,3macht. Gentechnik-Techniken wie das CRISPR -System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9-System ermöglichen vielfältige Manipulationen. Die Auswahl der Klone kann durch definierte Medienbedingungen realisiert werden, z.B. durch WNT-Ligandentzug für APC (Adenomatosis Polyposis Coli) Knockout-Klone^4,5. Alternativ müssen Selektionsmarker durch homologe gezielte Reparatur eines Targeting-Vektors^6,7eingeführt werden. Aufgrund der Tatsache, dass oft mehr als ein Plasmid eingeführt werden muss, wird eine effiziente Transfektion zu einem entscheidenden Parameter. Um unspezifische Off-Target-Effekte zu reduzieren, ist eine vorübergehende Expression der Cas9-Endonuklease wünschenswert⁸.

Elektroporation ist eine vergleichsweise einfache Methode, um Zellen mit DNA, RNA, Proteinen oder anderen Makromolekülen zu transfekieren. Durch elektrische Impulse wird die Zellmembran durchlässiger und verursacht eine erhöhte Aufnahme⁹. In einem zuvor veröffentlichten Elektroporationsprotokoll von Kolonorganoiden wurde in einem viertägigen Verfahren¹⁰ein 30 %iger Wirkungsgrad mit einem Piggy-Bac GFP (grünes fluoreszierendes Protein) Exzessvektor (7,4 kB) erreicht. Das folgende Protokoll wurde entwickelt, um eine effiziente Transfektion von Krebs oder gesunden Organoiden mit großen Plasmiden zu ermöglichen, die für Single Guide RNA (sgRNA) und die Cas9 Endonuklease-Sequenz (z.B. px458 als Vektor mit 9,3 kb) kodieren. Der gesamte Elektroporationsprozess kann innerhalb eines Tages ohne spezielle Elektroporationspuffer und mit mindestens vergleichbaren Wirkungsgraden zwischen verschiedenen gastrointestinalen Organoiden, nämlich pankreastischem duktogalem Adenokarzinom (PDAC), Dickdarmkrebs (CRC), Cholangiokarzinom (CCC) und Magenkrebs (GC) Organoiden durchgeführt werden.

Protokoll

Die Ethik-Zulassung wurde von der Ethikkommission der TU Dresden (#EK451122014 eingeholt.

1. Organoidkultur und Zubereitungen vor der Elektroporation

1. Organoide nach Gewebeverdauung wie zuvor beschrieben festlegen und mit ihrem entsprechenden entitätsspezifischen Kulturmedium in einer Kellermatrix erweitern (Übersicht siehe Tabelle 1 und Tabelle der Materialien)^{11,12,13,14,15,16,17}.
   HINWEIS: Für menschliche Gewebeproben ist die zustimmung s in Kenntnis der Einwilligung und Genehmigung der Studie durch eine Ethikkommission erforderlich.
2. 48-Well-Platten bei 37 °C für die Nachelektroporation vorwärmen.
3. Bereiten Sie basales Medium mit Antibiotika sowie ein unternehmensspezifisches organoides Kulturmedium mit Antibiotika vor (siehe Tabelle 1), einschließlich 10 M Y-27632 und 3 M CHIR99021.
   HINWEIS: Der Entzug von Antibiotika ist wichtig, um toxische Wirkungen zu reduzieren. Y-27632 und CHIR99021 zur Zellrückgewinnung¹⁰.
4. Vorbereitung der Organoide (siehe Abbildung 1)
   1. Kultivieren Sie 5 Brunnen von Organoiden in einer 48-Well-Platte pro Elektroporationsprobe in Kulturmedium.
      HINWEIS: Proliferative Organoide sollten verwendet werden (ca. 2-3 Tage nach der letzten Spaltung).
   2. Bereiten Sie 230 L Dissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) vor, einschließlich 10 M Y-27632 pro Bohrplatz.
   3. Entfernen Sie das Kulturmedium aus jedem Brunnen und dissoziieren Sie die Organoide mechanisch in 230 l des vorbereiteten Dissoziationsgemisches. 5 Brunnen pro Elektroporationsprobe in ein 15 ml-Rohr geben.
   4. Mischen Sie durch Wirbel und inkubieren Sie für 5-15 min bei 37 °C, bis Cluster von 10-15 Zellen auftreten. Überprüfen Sie daher die Dissoziation mikroskopisch. Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von Basalmedium mit Antibiotika bis zu 10 ml.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr kritisch! Die Elektroporationseffizienz wird reduziert, wenn die Inkubation zu kurz ist, aber eine lange Verdauung die Überlebensfähigkeit verringert.
   5. Zentrifuge bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur, den Überstand entsorgen und zweimal mit 4 ml Elektroporationspuffer waschen (siehe Materialtabelle).

2. Elektroporation

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde für Elektroporatoren entwickelt, die in der Lage sind, quadratische Wellen und getrennte Poring- und Übertragungspulssequenzen zu verwenden (siehe Abbildung 2). Optional können Impedanzwerte sowie die in die Probe übertragenen Spannungen, Ströme und Energien als Steuerung für reproduzierbare Experimente gemessen werden.

1. Setzen Sie das Organoidpellet in 100 l Elektroporationspuffer (siehe Materialtabelle) mit 30 g Plasmid-DNA aus.
   HINWEIS: Die Konzentration der verwendeten Plasmid-DNA sollte 5 g/l überschreiten, um eine optimale Salzkonzentration während des Elektroporationsprozesses zu erhalten. Daher werden endofreie Plasmid-Maxi-Kits (siehe Materialtabelle) zur Herstellung von Vektoren empfohlen. Eine Gesamtmenge von bis zu 45 g DNA kann ohne zytotoxische Wirkungen verwendet werden.
2. Geben Sie die komplette DNA-Organoid-Mischung in eine Elektroporationsküvette mit 2 mm Spaltbreite, ohne Luftblasen zu erzeugen.
3. Stellen Sie die Elektroporationsparameter nach Fujii et al.¹⁰ ein (siehe Tabelle 2, Abbildung 2).
4. Mischen Sie die Zellen leicht, ohne zu schäumen, indem Sie mit einem Finger auf die Küvette tippen. Legen Sie die Küvette in die Küvettenkammer.
5. Drücken Sie die Taste des Elektroporators, und notieren Sie sich den Impedanzwert.
   HINWEIS: Eine Impedanz zwischen 30-40 x zeigte die besten Ergebnisse. Im Allgemeinen sollte es im Bereich zwischen 30-55 ° liegen. Wenn dies nicht der Fall ist, steuern Sie bitte die folgenden Aspekte: Spaltbreite der verwendeten Küvette, Kabelanschlüsse des Elektroporators, mögliche Luftblasen, korrektes Volumen und Salzkonzentration des Elektroporationsgemisches.
6. Drücken Sie die Starttaste, um das Elektroporationsprogramm auszuführen und die Werte der angezeigten Ströme, Spannungen und Energien zu steuern.
   HINWEIS: Die Werte der gemessenen Spannungen, Ströme und Energien sollten den eingestellten Elektroporationsparametern entsprechen. Für den Vergleich wiederholter Experimente kann es hilfreich sein, diese Daten zu notieren.
7. Nach der Elektroporation sofort 500 l Kulturmedium mit Antibiotika hinzufügen (mit CHIR99021 und Y-27632; siehe Schritt 1.3). Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten, um den weißen Schaum zu dissoziieren.
   HINWEIS: Der weiße Schaum erscheint nach dem Elektroporationsprozess und eine erhebliche Anzahl von Zellen ist daran befestigt. Also, Dissoziation davon ist sehr wichtig, um zellenlos nicht zu verlieren.
8. Übertragen Sie die Probe vollständig von der Küvette in ein neues 15 ml Rohr mit der Pipette, die zu den Elektroporationsküvetten gehört (siehe Tabelle der Materialien). Es wird empfohlen, die Küvette wieder mit Basalmedium zu spülen, um verbleibende Zellen zu erhalten.
9. Zur Regeneration der Zellen 40 min bei Raumtemperatur inkubieren.

3. Aussaat von Zellen

1. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
2. Setzen Sie das Pellet in 100 l Kellermatrix und Samen 20 l Tropfen in einer vorgewärmten 48-Well-Platte (siehe Schritt 1.2). 10 min bei 37 °C zur Polymerisation inkubieren und 250 L Kulturmedium hinzufügen, das mit Y-27632 und CHIR99021 bis zur nächsten Spaltung der angebauten Organoide (ca. 5-7 Tage) ergänzt wird.

4. Bestimmung der Transfektionseffizienz

HINWEIS: Im Allgemeinen wird empfohlen, einen Vektor, der einen Fluoreszenzmarker trägt, als zusätzliche Transfektionskontrolle zu elektroporatisieren. Abhängig vom gewählten Marker und seiner Chromophorreifung wird die Fluoreszenz innerhalb von etwa 24-48 h nach der Transfektion¹⁸sichtbar sein.

1. Überprüfen Sie die Fluoreszenz mikroskopisch nach 24-48 h in der Transfektionskontrolle (siehe Abbildung 4B).
2. Fluoreszierendes aktiviertes Zellscannen (FACS)
   1. Ernten Sie die Zellen analog zu Schritt 1.4.2-1.4.4 und verdauen Sie etwa 10-20 min, bis es einzelne Zellen gibt. Addieren Sie bis zu 10 ml Phosphat-gepufferte Saline (PBS).
   2. Zentrifuge bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand entsorgen.
   3. Optional zur Diskriminierung lebender Zellen: Das Pellet in 1 ml phosphatgepufferter Saline (PBS) aussetzen und einen geeigneten Antikörper (siehe Materialtabelle)oder Propidiumjodid (PI) hinzufügen. Mischen Sie sehr sorgfältig nur durch Tippen und inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Mit 10 ml PBS, Zentrifuge waschen und den Überstand entsorgen.
   4. Setzen Sie das Zellpellet in 200 l PBS wieder auf und filtern Sie die Suspension optional durch ein 100-m-Zellsieb in ein FACS-Rohr.
   5. Analysieren Der Zellen anhand einer FACS-Maschine mithilfe einer geeigneten Gating-Strategie (siehe Abbildung 3; Abbildung 4A) und bestimmen die Transfektionseffizienz.

Ergebnisse

Organoide von vier verschiedenen Krebsentitäten (CRC, CCC, PDAC, GC) wurden mindestens dreimal mit 30 g eines kleinen Plasmids (pCMV-EGFP, 4,2 kb) oder einem großen Plasmid (px458, 9,3 kb) elektropoiert. Beide Vektoren tragen eine GFP-Kassette, die die Bestimmung der Transfektionseffizienz 48 h nach Elektroporation durch Durchflusszytometrie ermöglicht. Um nur lebende Zellen zu analysieren, wurde vor dem Scannen mit einem lebensbedrohlichen Antikörper gefärbt. Die Gating-Strategie ist in Abbildung 3dargestellt.

In allen vier organoiden Einheiten wurde das 4,2 kB große Plasmid mit höherer Effizienz im Vergleich zu dem größeren transfiziert (siehe Abbildung 4). Die effizienteste Transfektion des kleinen Plasmids wurde bei PDAC-Organoiden mit 92,1 x 5,2 % GFP-positiven Zellen erreicht, während das große Plasmid mit einem Wirkungsgrad von 46,7 x 3,7 % transfiziert wurde (mittlere Standardabweichung, n = 3). Im Vergleich zu Pankreaskrebsorganoiden wurde das größere Plasmid effizienter in CRC-Organoide mit einem mittleren Wirkungsgrad von 53,4 x 11,7 % transfiziert, während das kleine Plasmid mit einem mittleren Wirkungsgrad von 84,3 x 5,8 % transfiziert wurde. Am schwierigsten zu transfeken waren Magenkrebs-Organoide: Sowohl für das große als auch für das kleine Plasmid wurde in dieser Einheit die geringste Transfektionseffizienz erreicht (32,3 x 12,7 % bzw. 74,1 % bzw. 5,5 %). CCC-Organoide zeigten eine mittlere Transfektionseffizienz von 83,0 x 13,1 % für das kleine Plasmid und für das große Plasmid wurden 39,5 x 10,4 % ermittelt.

Als Beweis des Konzepts wurden menschliche normale Magenorganoide mit einem px458_Conc2 Plasmid-Codierung für Cas9, GFP und zwei sgRNAs für TP53elektropoiert. Die Cas9-induzierten Doppelstrangbrüche am Exon 8 wurden durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) repariert, was zu Frameverschiebungen und damit zu einem Knockout des Gens führte (siehe Ergänzende Abbildung 1).

Tabelle 1: Zusammensetzung von Basalmedien, Verdauungsmischungen und Kultivierungsmedien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Tabelle 2: Elektroporationseinstellungen nach Fujii et al.¹⁰.

Abbildung 1: Workflow zur Elektroporationsvorbereitung. Erstens sollten Organoide zu Clustern von 10-15 Zellen dissoziiert werden und Antibiotika sollten ausgewaschen werden. Nach der Elektroporation muss der weiße Schaum stofft werden. Zellen können nach 40 min Regenerierung bei Raumtemperatur ausgesät werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Zweistufige Elektroporation. Zwei Poringimpulse mit höherer Spannung und kurzer Dauer (175 V und 157,5 V, jeweils für 5 ms, Pause für 50 ms, Spannungsabfall 10%) zur Bildung von Poren in Zellmembranen führen. Folgende Transferimpulse liefern die DNA in die Zellen: fünf positive Transferimpulse (mit 20 V, 12 V, 7,2 V, 4,32 V und 2.592 V, jeweils 50 ms, Pause für 50 ms, Spannungsabfall 40%), gefolgt von fünf polaritätsgetauchten Übertragungsimpulsen (mit 20 V, 12 V, 7,2 V, 4,32 V und 2.592 V, jeweils 50 ms, Pause für 50 ms, Spannungsabfall 40%). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Gating-Strategie, die von CCC-Organoiden gezeigt wird. Alle elektropoierten Organoide wurden durch Durchflusszytometrie 48 h nach Elektroporation analysiert. Zellen, die ohne Plasmid-DNA elektropoiert wurden, wurden als Negativkontrollen verwendet. Die Tore wurden wie folgt gesetzt: (A) Gating für Zellform, (B,C) Gating für einzelne Zellen (doppelte Diskriminierung), (D) Gating für lebende Zellen (mit einem Antikörper für apoptotische Zellen gefärbt) und (E,F) schließlich Gating für eGFP-exemittierende Zellen (FITC-Kanal). FSC = Vorwärtsstreuung; SSC = Seitenstreuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Elektroporationseffizienz von vier organoiden Einheiten. (A) FACS-Analyse (n = 34, mittlere Standardabweichung und jeder einzelne Wert werden dargestellt) und (B) visueller Vergleich mit dem Fluoreszenzmikroskop. Skalenbalken = 1.000 m. BF = helles Feld; CCC = Cholangiokarzinom; CRC = Dickdarmkrebs; GC = Magenkrebs; PDAC = pankreasische duktale Adenokarzinom. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Beispielhafter CRISPR/Cas9-basierter Knockout von TP53 in normalen menschlichen Magenorganoiden. Der px458_Conc2 Vektor (siehe Materialtabelle) wurde durch die Kombination des 2 gRNA Concatemer Vektors geklont, ein großzügiges Geschenk von Bon-Kyoung Koo¹⁹, mit px458²⁰, was zu einer Plasmid-Codierung für 2 sgRNAs, Cas9 und GFP führte. Zwei sgRNAs, die auf TP53 abzielen, wurden in px458_Conc2 Vektor durch Golden Gate Klonen eingeführt (analog zu Andersson-Rolf et al.¹⁹). 10 g Plasmid-DNA wurden in menschlichen normalen Magenorganoiden (A) elektropoiert. Klone wurden von der Nutlin3-Administration ausgewählt (B) und der TP53 Knockout wurde durch TOPO TA Klonen und Sequenzieren der Allele bestätigt, hier exemplarisch für einen Klon gezeigt (C). Die sgRNAs werden in der Referenz unterstrichen. Skala bar = 200 m. BF = helles Feld. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen für eine effiziente, schnelle und einfach durchzuführende Elektroporation verschiedener organoider Einheiten. Zusätzlich zu den vorgestellten Tumororganoiden von PDAC, CRC, CCC und GC, funktioniert es erfolgreich für Organoide aus gesundem Gewebe sowie. Das Protokoll kann innerhalb eines Tages ausgeführt werden. In veröffentlichten Organoid-Transfektionsprotokollen dauerte das gesamte Verfahren vier Tage, einschließlich zwei Tage Vorbereitungen mit verschiedenen Arten von Anbaumedien^10,21. In unserem Protokoll ist keine spezielle Vorbehandlung erforderlich. Durch Waschen mit Elektroporationspuffer vor der Elektroporation wurden die antibiotischen Komponenten der Medien ausgewaschen und eine Einstellung der Saline-Konzentrationen für optimale Impedanzwerte erreicht. Dennoch sollten einige kritische Aspekte für eine erfolgreiche Elektroporation in Betracht gezogen werden:

Zellen
Im Elektroporationsprotokoll von Fujii et al.¹⁰ wird empfohlen, Organoide mit Einzelzellen zu dissoziieren und durch ein 20-m-Zell-Sieb zu filtern. In unseren Händen verringert die Verdauung einzelner Zellen die Überlebensfähigkeit der Zellen stark. Wie in Merenda et al.²¹vorgeschlagen, dissoziierten wir auch Organoide zu Clustern von 10-15 Zellen und konnten keine verminderte Effizienz im Vergleich zur Einzelzelldissoziation bestimmen. Nach der Elektroporation ist es ein sehr wichtiger Schritt, den weißen Schaum zu dissoziieren, so dass keine angeschlossenen Zellen verloren gehen.

Für die 2D-Zellkultur hat sich gezeigt, dass eine Regenerationszeit nach Elektroporation von mehr als 10 min bis zu 40 min die Überlebensfähigkeit und Transfektionseffizienz insbesondere bei großen Plasmiden erhöht²². In Testexperimenten konnte dasselbe für Organoide dokumentiert werden, was zu einem Inkubationsschritt von 40 min nach Elektroporation in diesem Protokoll führte. Um die Erholung von der Elektroporation zu erhöhen, kultivierten wir sie mit Rho-assoziiertem Proteinkinase (ROCK) Inhibitor Y-27632 für fünf bis sieben Tage²³. In ähnlicher Weise soll die zusätzliche Supplementierung von Glykogen-Synthase-Kinase-3-Hemmer CHIR99021 einzelnen Zellen helfen,¹⁰zurückzugewinnen.

Einstellungen
Einer der Vorteile des verwendeten Elektroporators ist, dass die Impedanz vor der Elektroporation für optimale Bedingungen gemessen werden kann. Nach Angaben des Herstellers sollten die Impedanzwerte 30-55 ° betragen. In unseren Händen haben Impedanzwerte von 30-40 ° eine optimale Effizienz gezeigt. In einem vorderen Experiment wurden unterschiedliche Spannungen und Pulslängenwerte des Porenimpulses variiert, um den optimalen Anteil der Effizienz an der Überlebensfähigkeit zu finden. Zusammenfassend konnten wir die beschriebenen Werte von Fujii et al.¹⁰ in den verschiedenen hier beschriebenen Entitäten bestätigen.

Dna
Die Wirkung unterschiedlicher DNA-Mengen wurde in Vorversuchen bis zu 45 g DNA pro Probe getestet. Es konnten keine zytotoxischen Wirkungen festgestellt werden. Die Transfektionseffizienz wurde in einer dosisabhängigen Weise mit Sättigung > 30 g erhöht. Wir haben also im Endprotokoll 30 g pro Probe verwendet, aber natürlich kann sie erhöht werden (z.B. für die Parallelelektroporation von mehr Plasmiden). Darüber hinaus scheint die Reinheit und Konzentration der DNA sehr wichtig zu sein. Eine Konzentration von mehr als 5 g/l hat eine optimale Transfektionseffizienz gezeigt.

Wie erwartet konnte das 9,3 kB-Plasmid mit einem geringeren Wirkungsgrad transfiziert werden als das kleinere 4,2 kB-Plasmid (siehe Abbildung 4). Die Verwendung von noch größeren Plasmiden als 10 kB wird die Effizienz weiter verringern. Für zukünftige Anwendungen könnte es interessant sein, Minikreis-DNA als Vektor zu testen, da diesen Genträgern das bakterielle Rückgrat eines Plasmids fehlt, was sie kleiner macht²⁴. Dies sollte zu einer verbesserten Transfektionseffizienz führen. Darüber hinaus könnte für CRISPR-basierte Manipulationen von Organoiden eine direkte Elektroporation von sgRNAs, die an Cas9 als Ribonukleoprotein (RNP) Komplex gebunden sind, eine Alternative oder Ergänzung sein²⁵.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
For establishment and culture medium
[Leu15] Gastrin	Sigma-Aldrich	G9145
A83-01	Tocris Bioscience	2939
Advanced DMEM/F-12	Invitrogen	12634010
B27	Invitrogen	17504044
B27 Supplement, minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
CHIR99021	Stemgent	04-0004
Collagenase II	Life Technologies	17101-015
Collagenase XI	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Collagenase D	Roche	11088866001
Dispase II	Roche	4942078001
Dnase I	Sigma-Aldrich	D5319
D-sorbitol	Roth	6213.1
Dithiothreitol	Thermo Scientific	1859330
EDTA	Roth	8040
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
Glutamax	Life Technologies	35050061
Hepes	Thermo Fisher Scientific	15630106
hFGF-10	Preprotech	100-26
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
KH2PO4	Roth	3904.2
Matrigel	Corning	356231	basement matrix
mEGF	Invitrogen	PMG8043
N2	Invitrogen	17502048
NaCl	Roth	3957.1
Na2HPO4	Roth	K300.2
N-Acetyl-L-Cystein	Sigma-Aldrich	A9165
Nicotinamid	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin	n.a.	n.a.	Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc)
PBS	Gibco	14190169
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Prostaglandin E2	Tocris Bioscience	2296
Recombinant Human HGF	Preprotech	100-39H
Rspondin	n.a.	n.a.	Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T)
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067
Sucrose	VWR	27,480,294
TrypLE Express	Gibco	12604021	Dissociation reagent
Wnt3A	n.a.	n.a.	Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj)
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Consumables
Cell Strainer 100 µm	Falcon	352360
48-well plate	Corning	3548
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes	Nepa Gene Co., Ltd.	EC-002S
Tubes 15 ml	Greiner	188271
Tubes 15 ml low binding	Eppendorf	30122208	Tubes for FACS preparing
Equipment
Electroporator Nepa21	Nepa Gene Co., Ltd.	n.a.
EVOS FL Auto	Invitrogen	AMAFD1000	Fluorescence microscope
LSRFortessa	BD Bioscience	647800E6	FACS
Reagents and plasmids
Live/dead fixable blue dead cell stain kit	Invitrogen	L34962	Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Nutlin-3	Selleckchem	S1061/07
Opti-MEM	Gibco	31985047	Electroporation buffer
2 gRNA concatemer vector	AddGene	84879
pCMV-EGFP	Nepa Gene Co., Ltd.	n.a.
px458 plasmid	AddGene	48138	coding for sgRNA and Cas9
px458_Conc2 plasmid	AddGene	134449	px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs
sgRNA_hTP53_1a	Eurofins Genomics	n.a.
sgRNA_hTP53_1b	Eurofins Genomics	n.a.
sgRNA_hTP53_2a	Eurofins Genomics	n.a.
sgRNA_hTP53_2b	Eurofins Genomics	n.a.