Lokalisation und Quantifizierung von Begomoviren in Whitefly-Geweben durch Immunfluoreszenz und quantitative PCR

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Immunfluoreszenz und quantitative PCR-Methode zur Lokalisierung und Quantifizierung von Begomoviren in Insektengeweben. Das Immunfluoreszenzprotokoll kann zur Kolokalisierung viraler und vektorieller Proteine verwendet werden. Das quantitative PCR-Protokoll kann erweitert werden, um Viren in ganzen Weißfliegenkörpern und virusinfizierten Pflanzen zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Begomoviren (Gattung Begomovirus, Geminiviridae)werden von Weißfliegen des Bemisia Tabaci-Komplexes in einer anhaltenden, zirkulierenden Weise übertragen. Angesichts der umfangreichen Schäden, die begomoviren weltweit durch Begomoviren verursacht werden, ist es unerlässlich, die Wechselwirkung zwischen Begomoviren und ihrem Whitefly-Vektor zu verstehen. Dazu ist die Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in den Vektorgeweben von entscheidender Bedeutung. Hier beschreiben wir am Beispiel des Tomaten-Gelbblattcurlvirus (TYLCV) ein detailliertes Protokoll zur Lokalisierung von Begomoviren in Weißfliegen-Midguts, primären Speicheldrüsen und Eierstöcken durch Immunfluoreszenz. Die Methode basiert auf der Verwendung spezifischer Antikörper gegen ein Virusbeschichtungsprotein, mit Farbstoff gekennzeichnete Sekundärantikörper und ein konfokales Mikroskop. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um begomovirale und Whitefly-Proteine zu kolokalisieren. Wir beschreiben ferner ein Protokoll zur Quantifizierung von TYLCV in Weißfliegen-Midguts, primären Speicheldrüsen, Hämolymphen und Eierstöcken nach quantitativer PCR (qPCR). Mit Primern, die speziell für TYLCV entwickelt wurden, ermöglichen die Protokolle zur Quantifizierung den Vergleich der TYLCV-Menge in verschiedenen Geweben der Weißfliege. Das beschriebene Protokoll ist potenziell nützlich für die Quantifizierung von Begomoviren im Körper einer Weißfliege und einer virusinfizierten Pflanze. Diese Protokolle können verwendet werden, um den Zirkulationsweg von Begomoviren in der Weißfliege zu analysieren oder als Ergänzung zu anderen Methoden zur Untersuchung von Whitefly-Begomovirus-Wechselwirkungen.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten haben Begomoviren (Gattung Begomovirus, Familie Geminiviridae) schwere Schäden an der Produktion von vielen Pflanzlichen, Fasern und Zierpflanzen weltweit verursacht¹. Begomoviren werden in beharrlicher Weise durch die Weißfliege Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) übertragen, die eine komplexe Art mit über 35 kryptischen Arten^2,3ist. Begomoviren können direkt oder indirekt Diephysiologie und das Verhalten von Weißfliegen beeinflussen, wie z. B. Fruchtbarkeit⁴, Langlebigkeit⁴und Wirtspräferenz^5,6. Darüber hinaus variiert die Übertragungseffizienz einer bestimmten Begomovirus-Art/Stamm für verschiedene weißfliegende kryptische Arten auch unter den gleichen experimentellen Bedingungen^7,8,9,10, was darauf hindeutet, dass es eine komplexe Wechselwirkung zwischen Begomoviren und Weißfliegen gibt. Um die Mechanismen, die den Wechselwirkungen zwischen Whitefly-Begomovirus zugrunde liegen, besser zu verstehen, sind Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in Weißfliegengeweben unerlässlich.

Tomatengelbblatt-Curlvirus (TYLCV) ist ein Begomovirus, das zuerst in Israel berichtet wurde, aber heutzutage schwere Schäden an der Tomatenproduktion weltweit verursacht^11,12. Aufgrund seiner wirtschaftlichen Bedeutung ist es eines der am besten untersuchten Begomoviren¹³. Wie andere monopartitige Begomoviren ist TYLCV ein einsträngiges kreisförmiges DNA-Virus mit einer Genomgröße von etwa 2.800 Nukleotiden¹⁴. Während noch diskutiert, mehrere Evidenzlinien unterstützen die Replikation von TYLCV in Weißfliegen^15,16,17. Darüber hinaus wurde die Wechselwirkung von TYLCV-Partikeln und Whitefly-Proteinen^6,18,19,20berichtet. Für die Virusübertragung erhalten Weißfliegen TYLCV, indem sie sich von virusinfizierten Pflanzen ernähren, Virionen passieren den Nahrungskanal, um die Speiseröhre zu erreichen, dringen in die Mitteldarmwand ein, um die Hämolymphe zu erreichen, und transortisieren sich dann in die primären Speicheldrüsen (PSGs). Schließlich werden Virionen mit Speichel entlang des Speichelkanals in Pflanzenphloem²¹aufgenommen. Darüber hinaus zeigen mehrere Studien, dass TYLCV transovarial von weiblichen Weißfliegen auf ihre Nachkommen übertragen werden kann^22,23. Mit anderen Worten, um eine produktive Übertragung zu erreichen, muss das Virus zelluläre Barrieren innerhalb der Weißfliege überwinden, um sich von einem Gewebe zum anderen zu verlagern. Während des Überschreitens dieser Barrieren sind Wechselwirkungen zwischen Whitefly- und Virusproteinen wahrscheinlich, was wahrscheinlich die Effizienz bestimmt, mit der die Viren übertragen werden.

Immunfluoreszenz ist eine häufig verwendete Technik für die Proteinverteilungsanalyse. Die Spezifität von Antikörpern, die an ihr Antigen binden, bilden die Grundlage der Immunfluoreszenz. Aufgrund der wirtschaftlichen Bedeutung von TYLCV wurden monoklonale Antikörper gegen das TYLCV-Beschichtungsprotein entwickelt, die eine hochempfindliche Möglichkeit bieten, das Virus zu lokalisieren²⁴. Quantitative PCR (qPCR) ermöglicht eine empfindliche und spezifische Quantifizierung von Nukleinsäuren. Diese Technik basiert am häufigsten auf der Verwendung von Hydrolysesonden (z. B. TaqMan) oder Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR Green) Detektion. Für hydrolysesondenbasierte qPCR werden spezifische Sonden benötigt, die die Kosten erhöhen. Fluoreszierende Farbstoff-basierte qPCR ist einfacher und kostengünstiger, da markierte ampliconspezifische Hybridisierungssonden nicht erforderlich sind²⁵. Bisher wurden in mehreren Studien Immunfluoreszenz und qPCR zusammen mit anderen Methoden zur Untersuchung der komplexen Begomovirus-Whitefly-Wechselwirkungen verwendet. Zum Beispiel führten Pan et al. qPCR und Immunfluoreszenzanalyse des Virus in Weißfliegengeweben durch und fanden heraus, dass der Unterschied in der Fähigkeit, Tabak-Curly-Shoot-Virus (TbCSV) zwischen den Whitefly-Arten AsiaII 1 und Middle East Asia Minor 1 (MEAM1) zu übertragen, darauf zurückzuführen war, dass das Virus in der Lage war, effizient die Mittelgutwand von AsiaII1, aber nicht MEAM1⁸zu überqueren. In ähnlicher Weise können mediterrane (MED) Weißfliegen tYLCV leicht übertragen, aber sie können das tomatengelbe Blatt Curl China Virus (TYLCCNV) nicht übertragen. Die selektive Übertragung wurde mit Hilfe des Immunfluoreszenznachweises von Viren in den PSGs untersucht, was zeigte, dass TYLCCNV die PSGs von MED Whiteflies²⁶nicht leicht kreuzen. Die Immunfluoreszenzkolokalisierung von TYLCV CP und dem autophagy Marker Protein ATG8-II in Whitefly Midguts zeigt, dass die Autophagie eine entscheidende Rolle bei der Unterdrückung der Infektion von TYLCV im Whitefly²⁷spielt.

Hier beschreiben wir am Beispiel TYLCV ein Protokoll zur Lokalisierung von Begomoviren in Weißfliegen-Midguts, PSGs und Eierstöcken durch eine Immunfluoreszenztechnik. Die Technik umfasst Sezieren, Fixieren und Inkubation mit primären und farbstoffmarkierten sekundären Antikörpern. Fluoreszenzsignale, die die Position viraler Proteine im Weißfliegengewebe anzeigen, können dann unter einem konfokalen Mikroskop nachgewiesen werden. Noch wichtiger ist, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um begomovirale und Whitefly-Proteine zu kolokalisieren. Wir beschreiben ferner ein Protokoll zur Quantifizierung von TYLCV mit SYBR Green-based qPCR in Whitefly Midguts, PSGs, Hämolymphe und Eierstöcken, das verwendet werden kann, um die Virusmenge in verschiedenen Whitefly-Gewebeproben zu vergleichen.

Protokoll

1. Whitefly, Virus, Pflanzen und Erwerb des Virus

1. Hintere Weißfliegen (MEAM1) auf Baumwolle (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) in insektensicheren Käfigen in einem Gewächshaus bei 26 °C bei 14:10 Licht:Dunkel-Zyklus und 60 x 10% relativer Luftfeuchtigkeit.
2. Führen Sie konventionelle PCR basierend auf Whitefly mitochondriale Cytochromoxidase I Gen, um die Reinheit der Whitefly-Population zu bestimmen.
   1. Sammeln Sie 20 erwachsene Weißfliegen und übertragen Sie sie einzeln in ein PCR-Rohr mit 30 l Lysepuffer (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] Gelatine, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinase K).
   2. Fügen Sie 5–7 Keramikperlen (2 mm Durchmesser) in jedes PCR-Rohr ein und schleifen Sie die Proben, um die Gewebelyse durchzuführen.
   3. Alle Proben bei 65 °C für 1 h, gefolgt von 10 min bei 100 °C inkubieren und dann kurz zentrieren. Verwenden Sie diesen Überstand als Vorlage für die PCR-Verstärkung.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit bei 65 °C kann bei Bedarf erhöht werden.
   4. Bereiten Sie die PCR-Reaktion wie folgt vor: 1 U Taq-DNA-Polymerase, 2 l 10x Puffer (mit Mg^2+),1,6 l dNTP-Gemisch (2,5 mM), 0,5 l pro Primer (je 10 M), 2 l Weißfliegengewebelysat-Überstand und doppelt destilliertes Wasser mit einem Gesamtvolumen von 20 l pro Reaktion. Die Vorwärts-Primer-Sequenz ist 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3' und die umgekehrte Primersequenz ist 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
      HINWEIS: Eine negative Kontrolle, bei der die DNA durch nukleasefreies Wasser ersetzt wird, und eine positive Kontrolle mit zuvor verifizierter MEAM1-Whitefly-DNA sollten enthalten sein.
   5. PCR mit folgenden Zyklusparametern durchführen: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 min, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s, Glühen bei 50–55 °C für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 1 min, gefolgt von 72 °C für 10 min.
   6. Verdauen Sie das verstärkte Produkt mit dem Restriktionsenzym Taq I. Bereiten Sie dazu die Verdauungsmischung mit 0,1 l (1 U) Enzym, 1 l 10x Taq I Puffer, 1 l BSA, 5 l verstärktem Produkt und doppelt destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 l vor. Bei 65 °C für 1 h in einem Thermocycler inkubieren.
   7. Führen Sie die Agarose-Gel-Elektrophorese der Proben durch Das Einladen von 5–7 l jedes verdauten Produkts und einer DNA-Leiter (100-2.000 bp) in die Brunnen eines 1% Agarose-Gels durch. Beobachten Sie dann die DNA-Bandgrößen durch gelrote Färbung in einer Geldokumentationsmaschine mit UV-Licht. Vergleichen Sie die Bandgrößen der verdauten Produkte mit der Positivkontrolle, um die Reinheit der Whitefly-Population zu bestimmen.
3. Agro-inoculate den infektiösen Klon von TYLCV (GenBank-Beitrittsnummer AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) in 3–4 echte Blattstadium Tomatenpflanzen (Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
   1. Impfung von 10 ml Luria-Bertani (LB) Medium, das Kanamycin (50 g/ml) und Rifampicin (50 g/ml) mit einer einzigen Kolonie enthält. Bei 28 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen bei 200 Umdrehungen min inkubieren, bis die OD₆₀₀ 1,5 € erreicht.
   2. Ernten Sie Agrobakterien durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand.
   3. Pellets in 10 ml Infiltrationspuffer, bestehend aus 200 M Acetosyringon, 10 mM 2-(N-Morpholino) Ethansulfonsäure (MES) und 10 mM MgCl₂. Bei Raumtemperatur (RT) für 1–2 h inkubieren.
   4. Infiltrieren Sie 2–3 Pflanzenblätter mit der Mischung aus Schritt 1.3.3 mit einer 1 ml nadellosen Spritze. Pflanzen in einem Gewächshaus bei 26 °C erhalten.
4. Etwa 1 Monat später, führen Sie eine visuelle Inspektion und wählen Sie Pflanzen mit gelben Lockenblatt und Stunt-Symptome.
5. Übertragen Sie nicht-viruliferous Whitefly Erwachsene auf TYLCV-infizierte Tomatenpflanzen für 48 h für die Virusakquise.

2. Dissektion und Sammlung von Midguts, Primären Speicheldrüsen (PSG), Eierstöcken und Hämolymphe weiblicher Weißfliegen

1. Sammeln Sie weiße Fliegen mit Aspiration, und legen Sie sie dann auf Eis, um sie ins Koma zu legen. Fügen Sie 1x PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Saline) auf ein Mikroskopschlitten und legen Sie dann Weißfliegen in den 1x PBS-Puffer für die Zerlegung unter einem Stereomikroskop.
   1. Für die Mittelgutsektion den Bauch der Weißfliege brechen und das Mittelgut mit einer feinen Akupunkturnadel (0,25 mm Durchmesser) herausziehen. Übertragen Sie das Mittelgut zu reinigen, 1x PBS.
   2. Für PSG-Sektion, brechen Sie den Körper der Weißfliege in den Thorax in der Nähe des Kopfes von der dorsalen Seite. Als nächstes legen Sie eine Nadel in den Thorax, um die Weißfliege zu fixieren, und verwenden Sie eine andere Nadel, um die Weißfliege zu schütteln, bis die beiden Speicheldrüsen vom Körper getrennt sind. Dann übertragen Sie die PSGs zu reinigen, 1x PBS.
   3. Für die Eierstocksektion, brechen Sie den Bauch der Weißfliege vollständig, und verwenden Sie eine Nadel, um die Eierstöcke von anderen Geweben zu trennen. Entfernen Sie dann überschüssiges Gewebe durch Pipettieren.
   4. Fügen Sie für die Hämolymph-Sammlung 10 L 1x PBS-Puffer auf ein Mikroskopschlitten ein, und legen Sie dann eine Weißfliege in den Puffer. Um die Hämolymphe zu erhalten, reißen Sie vorsichtig ein Loch in den Bauch mit einer feinen Akupunkturnadel, und drücken Sie leicht den Bauch, um die Hämolymphe in den Puffer freizusetzen. Sammeln Sie 8 l der Flüssigkeit als Hämlymphprobe.

3. Lokalisation von TYLCV in Whitefly Midgut, Primary Salivary Dlands, und Ovarien durch Immunfluoreszenz

HINWEIS: Als Beispiel wird das Verfahren zur Lokalisierung von TYLCV in den Mittenguts dargestellt. Die Methode kann für PSGs und Eierstöcke verwendet werden.

1. Sezieren Sie die Mittelguts im TBS-Puffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM Natriumchlorid, pH = 7,5) wie in Schritt 2.2.1 beschrieben. Sammeln Sie 15–20 Whitefly Midguts, übertragen Sie sie in eine glase Petrischale (3,5 cm Durchmesser) und entfernen Sie dann überschüssigen TBS-Puffer.
2. Fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd hinzu, um Midguts für 2 h bei Raumtemperatur zu fixieren, und entfernen Sie dann die fixative Lösung. Pipette langsam die Mittelguts 3x in TBS für 2 min zu waschen.
3. Inkubieren Sie die Mittelguts in 1 ml von 0,5% Triton X-100 für 30 min zu permeabilisieren. Entfernen Sie dann die Permeabilisationslösung und waschen Sie die Mittelguts 3x mit TBST (1x TBS mit 0,05% Tween 20) wie in Schritt 3.2 beschrieben.
4. Fügen Sie 1 ml 1% BSA (Rinderserumalbumin in TBST) hinzu, um die Midguts zu blockieren. Führen Sie den Sperrschritt bei RT für 2 h aus, und entfernen Sie dann die Blockierlösung und waschen Sie die Midguts 3x in TBST.
5. Die primären Antikörper (MAb 1C4 gegen TYLCV-Beschichtungsprotein) bei 1:400 mit TBST²⁴ verdünnen und die Lösung in die Petrischale geben, um die Mittelguts einzutauchen. Bei 4 °C über Nacht im Dunkeln inkubieren. Entsorgen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie 3x in TBST.
6. Die sekundären Antikörper (Anti-Maus) bei 1:400 mit TBST verdünnen und die Lösung in die Petrischale geben, um die Midguts einzutauchen. Inkubieren Sie das Gericht für 2 h bei RT im Dunkeln. Entsorgen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Midguts 3x in TBST.
7. Übertragen Sie die Mittelguts auf ein klares Mikroskopschlitten. Aspirieren Sie so viel TBST wie möglich von der Rutsche. Fügen Sie 1 Tropfen DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochlorid) den Kern zu färben, und legen Sie dann den Deckelrutsch und Versiegelung mit Nagellack. Untersuchen Sie unter einem konfokalen Mikroskop.

4. Quantifizierung von TYLCV in Whitefly Midgut, Primary Salivary Dlands, Hemolymph, und Ovarien mit qPCR

1. Sezieren Sie die Weißfliegen-Mittelguts, PSGs, Hämolympium und Eierstöcke in 1x PBS wie oben beschrieben.
2. Extrahieren Sie die DNA der Mittelguts, PSGs, Hämolympi, und Eierstöcke.
   1. Waschen Sie nach der Zerlegung die Mittelguts, PSGs und Eierstöcke in einem sauberen, 1x PBS Puffer 2–3x.
   2. Sammeln Sie 20 Midguts oder 20 PSGs in 5 l 1x PBS und übertragen Sie sie in eine 25-L-Lyselösung. Übertragen Sie jeden Eierstock in 5 l von 1x PBS und übertragen Sie dann einzeln in eine 25-L-Lyselösung.
   3. Schleifen Sie Mittelguts-, PSGs- und Eierstöckeproben, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben.
   4. Sammeln Sie 8 l Hämolymphe mit 1x PBS in ein PCR-Rohr, und fügen Sie dann 10 l Lyselösung hinzu. Mischen Sie gründlich.
3. Extrahieren Sie DNA aus allen Proben, wie in 1.2.3 beschrieben.
4. Bereiten Sie zwei separate qPCR-Mastermischungen (je 18 l) für TYLCV und die interne Kontrolle(-Actin-Gen) wie folgt vor: 10 l SYBR-Grünmischung, 0,8 l pro Primer (je 10 -M) und 6,4 l doppeldestilliertes Wasser pro Reaktion. Bei TYLCV beträgt die Vorwärtsprimersequenz 5-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3 und die umgekehrte Primersequenz 5-GGAACATCAGGGCGC-GATA-3. Bei derVorwärts-Primer-Sequenz ist die Vorwärts-Primer-Sequenz 5-TCTTCCAGCCATCCTTCTTG-3 und die umgekehrte Primer-Sequenz 5-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3.
5. Geben Sie 18 l der Master-Mischung in Fläschchen von qPCR-Streifenrohren oder einer 96-Well-Platte aus. Fügen Sie dann 2 L der DNA-Proben in jede Durchstechflasche ein. Führen Sie alle Reaktionen mit mindestens drei technischen Replikationen und drei biologischen Replikationen durch.
   HINWEIS: Schritt 4.5 sollte auf Eis durchgeführt werden.
6. Schließen Sie die qPCR-Rohre oder versiegeln Sie die 96 Wellplatten mit Klebeplattendichtung.
7. Zentrifuge, um die Flüssigkeit an der Unterseite der qPCR-Rohre oder 96 Brunnenplatte zu sammeln.
8. Legen Sie die Rohre oder die Platte in den Echtzeit-Thermocycler und führen Sie qPCR aus.
   1. Führen Sie die qPCR mit den folgenden Zyklusparametern aus: 95 °C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 5 s und 60 °C für 34 s für Primer-Glühen und -Dehnung, 1 Zyklus bei 95 °C für 15 s, endend mit einem Schmelzkurvenschritt von 60 °C bis 95 °C mit ein Inkrement von 0,5 °C pro 15 s.
   2. Wählen Sie SYBR als Fluorophorfarbstoff und unbekannt als Probentyp.
9. Exportieren Sie die quantitativen Daten in ein Tabellenformat und analysieren Sie die relative Menge der viralen DNA nach der^{2-CT-Methode 28}.

Ergebnisse

Die MEAM1 Whiteflies des B. tabaci Komplexes und TYLCV wurden hier als Beispiel verwendet, um die Verfahren zu beschreiben. Abbildung 1zeigt die in diesem Manuskript beschriebenen Immunfluoreszenz- und viralen Quantifizierungsverfahren. Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse des Immunfluoreszenznachweises von TYLCV- und DAPI-Färbung in PSGs, Mittelgut und Eierstöcken, was darauf hindeutet, dass sich TYLCV in den PSGs und Midguts mehr angesammelt...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Lokalisierung und Quantifizierung eines Begomovirus in den Geweben seines Whitefly-Vektors durch Immunfluoreszenz und qPCR. Die Dissektion stellt den ersten Schritt zur Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in Weißfliegengeweben dar. Der Weißfliegenkörper ist etwa 1 mm lang, was bedeutet, dass die Gewebe extrem klein sind, und es ist schwierig, sie zu sezieren. Außerdem gibt es starke Verbindungen zwischen den Geweben. Zum Beispiel sind die Eierstöcke eng mit den Bakterio...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	MultiSciences	F0001
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Abcam	ab104139
Bovine Serum Albumin (BSA)	MultiSciences	A3828
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-RAD	185-5201
Confocal microscopy	Zeiss	LSM800
Dylight 549-goat anti-mouse	Earthox	E032310-02	Secondary antibody
Monoclonal antibody (MAb 1C4)			Primary antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sangon Biotech	B548119-0500
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)	TaKaRa	RR820A	qPCR master mix
Thermocycler	Thermofisher	A41182
Tissuelyzer	Shaghai jingxin	Tissuelyser-48
Triton-X-100	BBI life sciences	9002-93-1
Tween 20	BBI life sciences	9005-64-5