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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt experimentelle Verfahren zur Beurteilung von Gedächtnisstörungen bei pilocarpine-induzierten epileptischen Mäusen vor. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die pathophysiologischen Mechanismen der Epilepsie-assoziierten kognitiven Abnahme zu studieren, die eine der häufigsten Komorbiditäten bei Epilepsie ist.

Zusammenfassung

Kognitive Beeinträchtigung ist eine der häufigsten Komorbiditäten bei der temporalen Lappenepilepsie. Um epilepsieassoziierte kognitive Abnahme in einem Tiermodell der Epilepsie zu rekapitulieren, haben wir pilocarpinebehandelte chronische epileptische Mäuse generiert. Wir präsentieren ein Protokoll für drei verschiedene Verhaltenstests mit diesen epileptischen Mäusen: neuartige Objektposition (NL), neuartige Objekterkennung (NO) und Mustertrennungstests (PS), um Lernen und Gedächtnis für Orte, Objekte bzw. Kontexte zu bewerten. Wir erklären, wie man die Verhaltensvorrichtungen einstellt und experimentelle Verfahren für die NL-, NO- und PS-Tests nach einem Offenen Feldtest durchführt, der die basalen Bewegungsaktivitäten der Tiere misst. Wir beschreiben auch die technischen Vorteile der NL-, NO- und PS-Tests im Vergleich zu anderen Verhaltenstests zur Beurteilung der Gedächtnisfunktion bei epileptischen Mäusen. Schließlich besprechen wir mögliche Ursachen und Lösungen für epileptische Mäuse, die während der Einarbeitungssitzungen keinen guten Kontakt zu den Objekten herstellen, was ein entscheidender Schritt für erfolgreiche Gedächtnistests ist. Daher bietet dieses Protokoll detaillierte Informationen darüber, wie Epilepsie-assoziierte Gedächtnisstörungen mit Mäusen bewertet werden können. Die NL-, NO- und PS-Tests sind einfache, effiziente Assays, die für die Bewertung verschiedener Arten von Gedächtnis bei epileptischen Mäusen geeignet sind.

Einleitung

Epilepsie ist eine chronische Erkrankung, die durch spontane wiederkehrende Anfälle1,2,3gekennzeichnet ist. Da sich wiederholende Anfälle strukturelle und funktionelle Anomalien im Gehirn verursachen können1,2,3, abnormale Anfallsaktivität kann zu kognitiver Dysfunktion beitragen, Die eine der häufigsten Epilepsie-assoziierten Komorbiditäten4,5,6. Im Gegensatz zu den chronischen Anfallsereignissen, die vorübergehend und vorübergehend sind, können kognitive Beeinträchtigungen im Leben epileptischer Patienten fortbestehen und ihre Lebensqualität verschlechtern. Daher ist es wichtig, die pathophysiologischen Mechanismen des epilepsieassoziierten kognitiven Rückgangs zu verstehen.

Verschiedene experimentelle Tiermodelle der Epilepsie wurden verwendet, um die Lern- und Gedächtnisdefizite im Zusammenhang mit chronischer Epilepsie7,8,9,,10,11,12zu demonstrieren. Zum Beispiel wurden häufig das Morris-Wasserlabyrinth, die kontextuelle Angstkonditionierung, Das Hole-Board, die neue Objektposition (NL) und die Tests zur neuartigen Objekterkennung (NO) verwendet, um Gedächtnisfunktionsstörungen bei der temporalen Lappenepilepsie (TLE) zu bewerten. Da der Hippocampus einer der primären Regionen ist, in denen TLE Pathologie zeigt, werden Verhaltenstests, die hippocampus-abhängige Gedächtnisfunktion bewerten können, oft bevorzugt ausgewählt. Da Anfälle jedoch eine abnorme Hippocampus-Neurogenese induzieren und zur Epilepsie-assoziierten kognitiven Abnahme beitragen können10, können Verhaltensparadigmen für tests die neuronale Funktion von Neugeborenen (d. h. räumliche Mustertrennung, PS)8,13 auch wertvolle Informationen über die zellulären Mechanismen von Gedächtnisstörungen bei Epilepsie liefern.

In diesem Artikel zeigen wir eine Batterie von Gedächtnistests, NL, NO und PS, für epileptische Mäuse. Die Tests sind einfach und leicht zugänglich und erfordern kein ausgeklügeltes System.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission der Katholischen Universität Korea genehmigt und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80-23) durchgeführt.

1. Neuartiger Objektpositionstest (NL)

  1. Bereiten Sie epileptische C57BL/6 oder transgene Mäuse 4-6 Wochen nach Derphäapin-Injektion vor.
    HINWEIS: Akute Anfälle wurden durch intraperitoneale (IP) Pilokarininjektion induziert, nach dem Protokoll, das in unserem vorherigen Bericht14beschrieben wurde.
  2. Übertragen Sie die epileptischen Mäuse aus dem Brutraum einen Tag vor Beginn der Verhaltenstests in den Verhaltensraum. Lassen Sie die Mäuse mindestens 12 h über Nacht gewöhnen.
  3. Im Verhaltensraum trennen Sie einzelne Mäuse in neue Käfige für Einzelgehäuse. Schreiben Sie die Informationen für jedes Tier auf die Käfigkarte und halten Sie die Tiere während der Verhaltenstests in denselben Käfigen. Mehrere Käfige können gleichzeitig mit einem Warenkorb übertragen werden.
  4. Beginnen Sie am nächsten Tag am frühen Morgen mit 3 Tagen Gewöhnungssitzungen (H1–H3). Die Tiere mindestens 30 min in ihren heimischen Käfigen an das schwache Licht ankleben.
  5. Bereiten Sie eine offene Feldbox mit Außenmaßen von 44 x 44 x 31 cm und Innenabmessungen von 43 x 43 x 30,5 cm vor. Legen Sie am ersten Tag der Gewöhnung (H1) ein Beleuchtungstoometer in die Mitte des offenen Feldkastens und stellen Sie die Beleuchtungsstärke auf 60 Lux ein.
  6. Den Boden und die Wände der offenen Feldbox mit 70% Ethanol besprühen und mit einem sauberen Papiertuch abwischen, um mögliche Geruchshinweise zu entfernen. Warten Sie dann mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
  7. Bewerten Sie die Bewegungsaktivität jeder Maus, indem Sie einen OffenenFeldtest durchführen.
    1. Um das Verhalten jeder experimentellen Maus aufzuzeichnen und nachzuverfolgen, verwenden Sie Video-Tracking-Software für das Tierverhalten (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Sobald die Video-Tracking-Software geöffnet ist, kalibrieren Sie die Größe des offenen Feldfeldes. Legen Sie dann die Zone für die Nachverfolgung fest. Legen Sie 3 s Latenz und 15 min Erfassungszeit fest, um die Hände eines Experimentators nicht zu verfolgen. Geben Sie die Informationen zu jeder experimentellen Maus ein (Gruppe, Geschlecht, Alter usw.).
    3. Legen Sie dann vorsichtig eine experimentelle Maus in den offenen Feldkasten mit Blick auf die Wand. Tun Sie dies, indem Sie es auf den Käfigdeckel legen, um Umgang-assoziierten Stress und Angst zu minimieren. Lassen Sie dann die Maus in der Nähe der Wand des offenen Feldfelds los, das am weitesten von dem Ort entfernt ist, an dem sich die Objekte während der Einarbeitungssitzung befinden (Schritt 1.9.3.).
      HINWEIS: Sobald sich die Maus im offenen Feld befindet, erkennt die Maus-Tracking-Software sie automatisch und beginnt mit der Aufzeichnung. Für eine optimale Verfolgung der Erkundung kann die Kamera direkt über dem offenen Feldkasten platziert werden.
    4. Nach 15 min Aufnahme, kehren Sie das Tier in seinen Hauskäfig zurück, indem Sie es auf den Käfigdeckel legen. Reinigen Sie die offene Feldbox mit 70% Ethanolspray und wischen Sie sie zwischen den Versuchen mit einem sauberen Papiertuch ab. Stellen Sie das helle Licht wieder her und messen Sie die Gesamtentfernung des Tieres, die mit der Video-Tracking-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers bewegt wurde.
      1. Öffnen Sie die Video-Tracking-Software und Videoclips. Klicken Sie dann auf Analyse, um die gesamtbewegte Entfernung basierend auf der Kalibrierung der Größe des offenen Feldfelds zu berechnen.
  8. Führen Sie am 2. und 3. Tag die Gewöhnungssitzungen (H2, H3) durch, indem Sie die Schritte 1.3 bis 1.7 wiederholen.
  9. Führen Sie am 4. Tag die Einarbeitungssitzung (F1) durch.
    1. Platzieren Sie jede Maus im dim Licht für 3 min in das leere offene Feld. Nach dieser kurzen Reha, bringen Sie das Tier in seinen heimischen Käfig zurück.
    2. Während der Gewöhnung die Objekte mit 70% Ethanol gründlich reinigen und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
    3. Platzieren Sie zwei identische Objekte (Gummipuppen, Objekt A) in der offenen Feldarena 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Führen Sie die experimentelle Maus in das offene Feldfeld ein, mit Blick auf die Wand, die am weitesten von den Objekten entfernt ist.
    4. Lassen Sie eine kostenlose Erkundung für 20 min und messen Sie manuell die Zeit, die für die Erkundung beider Objekte aufgewendet wurde, mit zwei Stoppfeldern. Sobald die Maus die minimale Erkundungszeit (30 s) für beide Objekte erreicht hat, stoppen Sie die F1-Sitzung und übertragen Sie das Tier in seinen Heimischenkäfig. Wenn die Maus die Objekte für 30 s innerhalb von 20 min nicht erkunden kann, entfernen Sie die Maus aus dem geöffneten Feldfeld und schließen Sie sie aus weiteren Sitzungen aus.
    5. Nachdem das Tier aus dem offenen Feldkasten entfernt wurde, reinigen Sie den Boden und die Wände der Box gründlich mit 70% Ethanolspray und wischen Sie sie mit einem Papiertuch ab.
      HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen.
  10. Führen Sie am 5. Tag die NL-Testsitzung durch.
    1. Übertragen Sie die Maus von ihrem Hauskäfig auf den offenen Feldbereich für die Reha für 3 min. Dann bringen Sie das Tier in seinen heimischen Käfig zurück.
    2. Während der Gewöhnung die Objekte mit 70% Ethanol gründlich reinigen und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
    3. Bewegen Sie ein Objekt (Gummipuppe, Objekt A) in die diagonale Position, 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Fixieren Sie das Objekt mit doppelseitigem Klebeband. Übertragen Sie die Versuchsmaus auf ihrem Käfigdeckel auf den offenen Feldbereich und platzieren Sie sie mit Blick auf die Wand des offenen Feldkastens.
      HINWEIS: Gegengewicht zur Position des Objekts, das verschoben wurde, um die potenzielle angeborene Präferenz für eine bestimmte Richtung zu reduzieren. Ändern Sie z. B. die Position des bevorzugten Objekts aus der Einarbeitungssitzung für die Hälfte der Versuchstiere, und verschieben Sie für den Rest der Tiere das weniger bevorzugte Objekt aus der Einarbeitungssitzung.
    4. Erlauben Sie 10 min kostenlose Erkundung und Aufnahme mit einem Video-Tracking-System. Messen Sie die Zeit, die für die Erkundung jedes Objekts aufgewendet wird, mit zwei Stoppfeldern und berechnen Sie das
      figure-protocol-7177
      HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen.
    5. Schnappen Sie sich den Schwanz der Versuchsmaus und legen Sie ihn auf den Käfigdeckel, um ihn in den heimischen Käfig zu bringen. 3 Tage lang (Tage 6–8) lassen Sie die Maus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser ruhen.
    6. Sobald das Tier aus dem offenen Feldkasten entfernt wird, reinigen Sie den Boden und die Wände der Box gründlich mit 70% Ethanolspray und wischen Sie es mit einem Papiertuch ab.

2. Neuartiger Objekterkennungstest (NO)

  1. Führen Sie am 9. Tag eine 15-min-Gewöhnungssitzung durch, indem Sie die Schritte 1.2–1.7 wiederholen.
  2. Führen Sie am 10. Tag die Einarbeitungssitzung (F1) durch.
    1. Legen Sie die Maus bei leichtem Licht 3 min in das leere offene Feld. Nach der Rehabilitierung der Maus in den offenen Feldbereich, vorübergehend zurück in seinen heimischen Käfig.
    2. Während der Gewöhnung die Objekte mit 70% Ethanol gründlich reinigen und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
    3. Legen Sie zwei identische Objekte (50 ml Kunststoffrohre gefüllt mit 40 ml Wasser, Objekt B) in das offene Feld 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Führen Sie die experimentelle Maus in den offenen Feldkasten ein, der der Wand am weitesten von den Objekten zugewandt ist.
    4. Da das Tier den beiden verschiedenen Objekten (50 ml Kunststoffrohr gefüllt mit 40 ml Wasser, Objekt B; Glas Coplin Glas, Objekt C) im NO-Test ausgesetzt ist, wird das Objekt während der F1-Sitzung ausgeglichen. Stellen Sie beispielsweise zwei identische Objekte (Glas-Coplin-Gläser, Objekt C) für die Hälfte der Tiere in der Gruppe dar.
    5. Lassen Sie eine kostenlose Erkundung für 20 min und messen Sie manuell die Zeit, die für die Erkundung beider Objekte aufgewendet wurde, mit zwei Stoppfeldern. Sobald die Maus die minimale Erkundungszeit (30 s) für beide Objekte erreicht hat, stoppen Sie die F1-Sitzung und übertragen Sie das Tier in seinen Heimischenkäfig. Wenn die Maus die Objekte für 30 s innerhalb von 20 min nicht untersuchen kann, entfernen Sie sie aus dem geöffneten Feldfeld und schließen Sie sie aus weiteren Sitzungen aus.
    6. Nachdem das Tier aus dem offenen Feldkasten entfernt wurde, reinigen Sie den Boden und die Wände der Box gründlich mit 70% Ethanolspray und wischen Sie sie mit einem Papiertuch ab.
      HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen.
  3. Führen Sie am nächsten Tag (Tag 11) die NO-Testsitzung durch.
    1. Übertragen Sie die Maus von ihrem Hauskäfig auf das offene Feld für 3 min, und bringen Sie das Tier dann in seinen Hauskäfig zurück.
    2. Während der Gewöhnung die Objekte mit 70% Ethanol gründlich reinigen und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
    3. Ersetzen Sie ein Objekt (50 ml Kunststoffrohr gefüllt mit 40 ml Wasser, Objekt B) durch ein anderes Objekt (Glas Coplin Glas, Objekt C) 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Übertragen Sie die experimentelle Maus auf den Käfigdeckel auf das offene Feld, und platzieren Sie sie mit Blick auf die Wand. Gegengewicht zu den Objekten, die während des NO-Tests zusammen dargestellt werden. Ersetzen Sie beispielsweise ein Glas-Coplin-Glas (Objekt C) durch ein 50 ml Kunststoffrohr, das mit 40 ml Wasser (Objekt B) für die Mäuse gefüllt ist, die während der Einarbeitungssitzung den beiden Coplin-Gläsern (Objekt C) ausgesetzt sind.
      HINWEIS: Ein Gegengewicht zur Position des ersetzten Objekts kann auch durchgeführt werden, um die potentielle angeborene Präferenz für eine bestimmte Richtung zu reduzieren. Ändern Sie z. B. für jede Kohorte der Tiere, die dem Satz von zwei Objekten (Objekt B oder Objekt C) ausgesetzt sind, das bevorzugte Objekt in der Einarbeitungssitzung für die Hälfte der Versuchstiere, und ersetzen Sie für den Rest der Tiere das Objekt, das in der Einarbeitungssitzung weniger bevorzugt wird.
    4. Erlauben Sie 10 min kostenlose Erkundung und zeichnen Sie es mit einem Video-Tracking-System auf. Messen Sie die Zeit, die für die Erkundung jedes Objekts aufgewendet wird, mithilfe von zwei Stoppfeldern, und berechnen Sie das Diskriminierungsverhältnis.
      HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen.
    5. Schnappen Sie sich den Schwanz der Versuchsmaus und legen Sie ihn auf den Käfigdeckel, um ihn in den heimischen Käfig zu bringen. 3 Tage lang (Tage 12–14) lassen Sie die Maus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser ruhen.
    6. Sobald das Tier aus dem offenen Feldkasten entfernt wird, reinigen Sie den Boden und die Wände der offenen Feldbox gründlich mit 70% Ethanolspray und wischen Sie es mit einem Papiertuch ab.

3. Mustertrenntest (PS)

  1. Führen Sie am 15. Tag die erste Einarbeitungssitzung (F1) für den PS-Test durch.
    1. Übertragen Sie die Maus von ihrem Hauskäfig auf den offenen Feldbereich für 3 min, und kehren Sie sie dann in ihren Hauskäfig zurück.
    2. Während der Gewöhnung die Objekte und die gegitterte Bodenplatte mit 70% Ethanol gründlich reinigen und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
    3. Legen Sie die Bodenplatte (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) mit dem breiten Gitter (5,5 x 5,5 cm) in den offenen Feldkasten und platzieren Sie zwei identische Objekte (Kunststoff-T-Flaschen gefüllt mit 50 ml Wasser, Objekt D) im offenen Feld 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Führen Sie die experimentelle Maus in den offenen Feldkasten ein, der der Wand am weitesten von den Objekten zugewandt ist.
    4. Da das Tier im PS-Test zwei verschiedenen Gegenständen ausgesetzt ist (Kunststoff-T-Flasche, gefüllt mit 50 ml Wasser, Objekt D; Glasflasche, Objekt E), wird das Objekt während der F1- und F2-Sitzungen ausgeglichen. Stellen Sie beispielsweise zwei identische Objekte (Glasflaschen, Objekt E) auf dem breiten Gitterboden für die Hälfte der Tiere in der Gruppe dar.
    5. Lassen Sie eine kostenlose Erkundung für 20 min zu, und messen Sie manuell die Zeit, die für die Erkundung beider Objekte aufgewendet wird, indem Sie zwei Stoppfelder verwenden. Sobald die Maus die minimale Explorationszeit (30 s) für beide Objekte erreicht hat, stoppen Sie die F1-Sitzung und übertragen Sie das Tier in seinen Heimischenkäfig. Wenn die Maus die Objekte für 30 s innerhalb von 20 min nicht untersuchen kann, entfernen Sie sie aus dem geöffneten Feldfeld und schließen Sie sie aus weiteren Sitzungen aus.
      HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen.
    6. Nach Abschluss der ersten Einarbeitungssitzung (F1) die Objekte und die Bodenplatte gründlich mit 70% Ethanolspray reinigen und aus dem offenen Feldkasten entfernen.
  2. Führen Sie am nächsten Tag (Tag 16) die zweite Einarbeitungssitzung (F2) für den PS-Test durch.
    1. Übertragen Sie die Maus von ihrem Hauskäfig auf den offenen Feldbereich für 3 min, und bringen Sie das Tier dann in seinen Hauskäfig zurück.
    2. Während der Gewöhnung die Objekte gründlich reinigen und bodenplatte mit 70% Ethanol gittern und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
    3. Legen Sie die Bodenplatte (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) mit dem schmalen Gitter (2,75 x 2,75 cm) in den offenen Feldkasten und platzieren Sie zwei identische Objekte (Glasflaschen, Objekt E) im offenen Feld 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Führen Sie die experimentelle Maus in den offenen Feldkasten ein, der der Wand am weitesten von den Objekten zugewandt ist.
    4. Zum Ausgleich stellen Sie zwei identische Objekte (Kunststoff-T-Flaschen, gefüllt mit 50 ml Wasser, Objekt D) auf dem schmalen Gitterboden vor.
    5. Lassen Sie eine kostenlose Erkundung für 20 min und messen Sie manuell die Zeit, die für die Erkundung beider Objekte aufgewendet wurde, mit zwei Stoppfeldern. Sobald die Maus die minimale Explorationszeit (30 s) für beide Objekte erreicht hat, stoppen Sie die F2-Sitzung und übertragen Sie das Tier in seinen Heimischenkäfig. Wenn die Maus die Objekte für 30 s innerhalb von 20 min nicht untersuchen kann, entfernen Sie sie aus dem geöffneten Feldfeld und schließen Sie sie aus weiteren Sitzungen aus.
      HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen.
    6. Nach Abschluss der zweiten Einarbeitungssitzung (F2) die Objekte und die Bodenplatte gründlich mit 70% Ethanolspray reinigen und aus dem offenen Feldkasten entfernen.
  3. Führen Sie am nächsten Tag (Tag 17) die PS-Testsitzung durch.
    1. Übertragen Sie die Maus von ihrem Hauskäfig auf den offenen Feldbereich für 3 min, und kehren Sie sie dann in ihren Hauskäfig zurück.
    2. Während der Gewöhnung die Objekte gründlich reinigen und bodenplatte mit 70% Ethanol gittern und mit einem Papiertuch abwischen. Warten Sie mindestens 1 min, bis der Restalkohol vollständig getrocknet ist.
    3. Legen Sie die Bodenplatte mit dem schmalen Gitter (2,75 x 2,75 cm) in den offenen Feldkasten und legen Sie zwei verschiedene Objekte (Kunststoff-T-Flasche gefüllt mit 50 ml Wasser, Objekt D; Glasflasche, Objekt E) auf die Bodenplatte 5 cm von den angrenzenden Wänden entfernt. Befestigen Sie die Objekte mit doppelseitigem Klebeband. Übertragen Sie die experimentelle Maus auf den Käfigdeckel auf den offenen Feldbereich und platzieren Sie sie mit Blick auf die Wand.
    4. Gegengewicht zu den Objekten, die während des PS-Tests zusammen präsentiert wurden. Platzieren Sie z. B. jedes Objekt (Objekt D, Objekt E) auf dem schmalen Rasterboden, um das Objekt E in diesem Kontext zu einem neuartigen Objekt zu machen. Ein Gegengewicht zur Position von Objekt D oder Objekt E (ein neuartiges Objekt auf dem schmalen Bodenmuster) kann ebenfalls durchgeführt werden, um das Potenzial für eine angeborene Präferenz für eine bestimmte Richtung zu verringern. Ersetzen Sie beispielsweise das bevorzugte Objekt aus der zweiten Einarbeitungssitzung für die Hälfte der Versuchstiere, und ersetzen Sie für die übrigen Tiere das weniger bevorzugte Objekt aus der zweiten Einarbeitungssitzung.
    5. Erlauben Sie 10 min kostenlose Erkundung und Aufzeichnung mit einem Video-Tracking-System. Messen Sie die Zeit, die für die Erkundung jedes Objekts aufgewendet wird, mithilfe von zwei Stoppfeldern, und berechnen Sie das Diskriminierungsverhältnis.
      HINWEIS: Messen Sie die Zeit, zu der die Maus die Objekte mit ihren Schnurrhaaren, Schlaufe oder Vorderpfoten berührt. Quantifizieren Sie nicht als Sondierungszeit Verhaltensweisen, bei denen die Schnarbe des Tieres nicht auf das Objekt zeigt, wie z. B. auf dem Objekt sitzen, am Objekt vorbeigehen oder mit seinem hinteren Ende auf das Objekt zeigen.
    6. Schnappen Sie sich den Schwanz der Versuchsmaus und legen Sie ihn auf den Käfigdeckel, um ihn in den heimischen Käfig zu bringen.

4. Cresyl violette Färbung

  1. Nach Abschluss aller Verhaltenstests das Tier durch Injektion eines Cocktails (4:0,5) Ketamin (50 mg/ml) und Xylazin (23,3 mg/ml) in Saline in einer Dosis von 110 ml/kg Körpergewicht (IP; 1 ml Spritze; 26 G Nadel) gelöst. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen einer Antwort auf eine Zehenklemme.
  2. Sobald das Tier tief anästhesiert ist, führen Sie transkardiale Perfusion mit 4% Paraformaldehyd durch, um das Gehirn zu fixieren15.
  3. Nachdem die transkardiale Perfusion abgeschlossen ist, enthaupten Sie das Tier mit einer Schere15. Entfernen Sie dann den Schädel mit einer Irisschere, um das Gehirn freizulegen. Nachdem das Gehirn isoliert ist, postfixieren Sie es in 4% Paraformaldehyd über Nacht, gefolgt von Kryoschutz in 30% Saccharose in 0,01 M phosphatgepufferter Salin.
  4. Machen Sie koronale Abschnitte (30 m) aus dem snap-frozen Gehirn mit einem Kryostat.
  5. Montieren Sie das Hirngewebe auf Dias und führen Sie eine Reihe von Hydratationsschritten von 100% Ethanol zu Leitungswasser durch, indem Sie 3 min sequenziell in 100%, 95%, 90%, 80%, 70% Ethanol waschen.
  6. Inkubieren Sie das Gewebe in 0,1% Kresylviolettlösung für 15 min.
  7. Entfernen Sie übermäßige Flecken, indem Sie die Geweberutschen in 95% Ethanol/0,1% Eisessigsäure eintauchen, und dehydrieren Sie dann das Gewebe mit Lösungen von 100% Ethanol, 50% Ethanol/50% Xylol und 100% Xylol.
  8. Die Gewebeschlitten mit einem handelsüblichen Xylol-Montagemedium abdecken.

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Ergebnisse

Abbildung 1zeigt einen allgemeinen Versuchsplan und ein allgemeines Setup für die Bewertung der kognitiven Funktion. Sechs Wochen nach der Einführung von pilocarpine-induzierten akuten Anfällen wurden Mäuse den NL-, NO- und PS-Tests in dieser Reihenfolge unterzogen, die durch 3 Tage Ruhezeiten zwischen den Tests getrennt waren (Abbildung 1A). Für den NL-Test wurden während der Einarbeitungssitzung (F1) zwei identische Objekte im offenen Feld platziert, und...

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Diskussion

Diese Arbeit beschreibt experimentelle Verfahren zur Bewertung der kognitiven Funktion bei Mäusen mit chronischer Epilepsie. Viele verschiedene Verhaltenstestparadigmen werden verwendet, um Lern- und Gedächtnisfunktionen bei Mäusen18zu bewerten. Das Morris-Wasserlabyrinth, das Radialarmlabyrinth, das Y-Labyrinth, die kontextbezogene Angstkonditionierung und objektbasierte Tests sind die am häufigsten verwendeten Verhaltenstests und liefern zuverlässige Ergebnisse. Unter ihnen sind die NL-, NO...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Dr. Jae-Min Lee für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) Von der koreanischen Regierung finanziert (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml syringeSung-shimUse with the 26 or 30 gauge needle
70% EthanolDuksanUN1170Spray to clean the box and objects
black curtainFor avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violetSigmaC5042For Cresyl violet staining
cryotomeLeicaE21040041For tissue sectioning
double-sided sticky tapeFor the firm placement of the objects
DPX mounting mediumSigma06522
ethanol seriesDuksanUN1170Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patternsLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patternsLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometerTES Electrical Electronic Corp.1334AFor the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unitThermocare#W-1
ketamine hydrochlorideYuhan7003Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lampLungoP13A-0422-WW-04Lighting for the behavioral test room
objectsRubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field boxLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towelYuhan-Kimberly47201Use to dry open field box and objects
paraformaldehydeMerck Millipore104005Make 4% solution
pilocarpine hydrochlorideSigmaP6503
rulerUse to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrateSigmaS2250Make 10X stock
Smart system 3.0PanlabVideo tracking system
stopwatchJunsoJS-307For the measurement of explorative activities of mice
sucroseSigmaS9378For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate saltSigmaT2528Make 10X stock
video camera (CCD camera)VisionVCE56HQ-12Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun)Bayer koreaKR10381Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xyleneDuksanUN1307For Cresyl violet staining

Referenzen

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606(2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429(2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733(2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).

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