JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

Zusammenfassung

Chemische und biokonjugationische Techniken wurden in den letzten Jahren schnell entwickelt und ermöglichen den Aufbau von Proteinpolymeren. Ein kontrollierter Proteinpolymerisationsprozess ist jedoch immer eine Herausforderung. Hier haben wir eine enzymatische Methodik entwickelt, um polymerisiertes Protein Schritt für Schritt in einer rational gesteuerten Sequenz zu konstruieren. Bei dieser Methode ist der C-Terminus eines Proteinmonomers NGL für die Proteinkonjugation mit OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1), während der N-Terminus eine skleavable TEV (Tabak-Etch-Virus) Spaltungsstelle plus ein L (ENLYFQ/GL) zum vorübergehenden N-Terminal-Schutz war. Folglich konnte OaAEP1 jeweils nur ein Proteinmonomer hinzufügen, und dann spaltete die TEV-Protease die N-Terminus zwischen Q und G, um den NH2-Gly-Leu freizulegen. Dann ist das Gerät bereit für die nächste OaAEP1 Ligation. Das entwickelte Polyprotein wird durch Die Entfaltung einzelner Proteindomäne mittels atomarer Mikroskopie-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (AFM-SMFS) untersucht. Daher bietet diese Studie eine nützliche Strategie für Die Polyprotein-Engineering und Immobilisierung.

Einleitung

Im Vergleich zu synthetischen Polymeren haben natürliche Mehrdomänenproteine eine einheitliche Struktur mit einer gut kontrollierten Anzahl und Art der Subdomains1. Diese Funktion führt in der Regel zu einer verbesserten biologischen Funktion und Stabilität2,3. Viele Ansätze, wie z. B. die Zysulfidbindungskopplung und die rekombinante DNA-Technologie, wurden für den Aufbau eines solchen polymerisierten Proteins mit mehreren Domänen4,5,6,7entwickelt. Die erste Methode führt jedoch immer zu einer zufälligen und unkontrollierten Sequenz, und die zweite führt zu anderen Problemen, einschließlich der Schwierigkeit für die Überexpression toxischer und großformatigen Proteine und der Reinigung komplexer Proteine mit Kofaktor und anderen empfindlichen Enzymen.

Um dieser Herausforderung gerecht zu werden, entwickeln wir eine enzymatische Methode, die Proteinmonomer für Polymer/Polyprotein schrittweise mit einer Proteinligase OaAEP1 in Kombination mit einem Protease TEV8,9konjugiert. OaAEP1 ist eine strenge und effiziente Endopeptidase. Zwei Proteine können kovalent als Asn-Gly-Leu-Sequenz (NGL) durch zwei Termini von OaAEP1 in weniger als 30 min verbunden werden, wenn der N-Terminus Gly-Leu-Rückstände(GL) und das andere, von dem der C-Terminus NGL-Rückstände10ist. Die Verwendung von OaAEP1 führt jedoch nur zur Verknüpfung von Proteinmonomer zu einem Proteinpolymer mit einer unkontrollierten Sequenz wie der Cystein-basierten Kopplungsmethode. Daher entwerfen wir den N-Terminus der Proteineinheit mit einer abnehmbaren TEV-Protease-Site plus einem Leucin-Rückstand als ENLYFQ/G-L-POI. Vor der TEV-Spaltung würde das N-Terminal nicht an der OaAEP1-Liga teilnehmen. Und dann werden die GL-Rückstände am N-terminus, die mit weiterer OaAEP1-Ligatur kompatibel sind, nach der TEV-Spaltung freigelegt. So haben wir eine sequenzielle enzymatische Biosynthesemethode von Polyprotein mit einer relativ gut kontrollierten Sequenz erreicht.

Hier kann unsere schrittweise enzymatische Synthesemethode in der Polyproteinprobenvorbereitung eingesetzt werden, einschließlich sequenzgesteuerter und unkontrollierter, und Proteinimmobilisierung auch für Einzelmolekül-Studien, insbesondere für das komplexe System wie Metalloprotein.

Darüber hinaus ermöglichen uns AFM-basierte SMFS-Experimente, die Proteinpolymerkonstruktion und -stabilität auf Einzelmolekülebene zu bestätigen. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie, einschließlich AFM, optischer Pinzette und magnetischer Pinzette, ist ein allgemeines Werkzeug in der Nanotechnologie, um Biomoleküle mechanisch zu manipulieren und deren Stabilität zu messen11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ein-Molekül AFM wurde weit verbreitet in der Untersuchung von Protein (un)folding21,22,23,24,25, die Festigkeitsmessung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, anorganische chemische Bindung20,36,37,38,39,40,41,42,43 und Metall-Ligand-Bindung in Metallprotein44,45,46,47,48,49,50 . Hier wird einmolekulares AFM verwendet, um die synthetisierte Polyproteinsequenz auf Basis des entsprechenden Proteinentfaltungssignals zu verifizieren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Proteinproduktion

  1. Genklon
    1. Kaufen Sie Gene, die für das Protein von Interesse (POI) kodieren: Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, das Cellulose-Bindungsmodul (CBM), dockerin-X Domain (XDoc) und Kohäsion aus Ruminococcus flavefacience, Tabak-Etch-Virus (TEV) Protease, Elastin-ähnliche Polypeptide (ELPs).
    2. Führen Sie polymerase-Kettenreaktion durch und verwenden Sie das Drei-Restriktions-Verdauungsenzymsystem BamHI-BglII-KpnI, um das Gen aus verschiedenen Proteinfragmenten zu rekombinieren.
    3. Bestätigen Sie alle Gene durch direkte DNA-Sequenzierung.
  2. Proteinexpression und -produktion
    1. Transformieren Sie E. coli BL21(DE3) mit dem pQE80L-POI oder pET28a-POI Plasmid zur Expression.
    2. Wählen Sie eine einzelne Kolonie in 15 ml LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika (z. B. 100 g/ml Ampicillin-Natriumsalz oder 50 g/ml Kanamycin). Schütteln Sie die Kulturen bei 200 Umdrehungen von Euro bei 37 °C für 16-20 h.
    3. Verdünnen Sie die Nachtkulturen in 800 ml LB-Medium (1:50 Verdünnung). Zentrifugieren Sie bei Rubredoxin die Kultur bei 1.800 x g, setzen Sie sie dann in 15 ml M9-Medium (ergänzt mit 0,4% Glukose, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4) aus und verdünnen Sie sie dann in 800 ml M9-Medium.
    4. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C, während sie bei 200 Umdrehungen von mir schüttelt, bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,6 erreicht. Speichern Sie 100 l Probe der Kultur als Vorinduktionskontrolle für die Prüfung der Proteinexpression.
    5. Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM und schütteln Sie die Kultur bei 37 °C für 4 h bei 200 Rprossen. Reservieren Sie eine 100-L-Probe der Kultur als Nachinduktionskontrolle für die Prüfung der Proteinexpression.
    6. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 13.000 x g für 25 min bei 4 °C und lagern Sie bei -80 °C vor der Reinigung.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
  3. Reinigung von Proteinvon Interesse
    1. Setzen Sie die Zellen in 25 ml Lysepuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 mit DNase, RNase, PMSF) wieder auf und verwenden Sie einen Beschallungsmittel (15% Amplitude), um sie 30 min auf Eis zu lysieren.
    2. Das Zelllysat bei 19.000 x g 40 min bei 4 °C klären.
    3. 1 ml (Bettvolumen) co-NTA oder Ni-NTA Affinitätssäule packen und die Säule mit 10 Säulenvolumina (CV) Reinstwasser und dann 10 CVs Waschpuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM Imidazol, pH 7,4) durch Schwerkraftfluss waschen.
    4. Passieren Sie das Protein-Übertät durch die Säule durch Schwerkraftfluss für dreimal.
    5. Gießen Sie den Waschpuffer auf die Säule mit 50 Lebensläufen, um Schadstoffproteine wegzubewegen.
    6. Das gebundene Protein mit 3 Lebensläufen eiskalter Elutionspuffer (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 7,4) zu verleuchten. Bei Rubredoxin-Proteinen ist eine weitere Anionenaustauschreinigung mittels Anionenaustauschsäule bei pH 8,5 bei 4 °C erforderlich.
    7. Analysieren Sie das Beispiel nach SDS-PAGE.

2. Funktionalisierung der Deck- und Auslegeroberfläche

  1. Funktionalisierte Deckslip-Oberflächenvorbereitung
    1. 20 g Kaliumchromat in 40 ml Reinstwasser auflösen. 360 ml konzentrierte Schwefelsäure mit Glasstab langsam umrühren und die Chromsäure zuzubereiten, 360 ml konzentrierte Schwefelsäure langsam zugeben.
      VORSICHT: Die hier verwendete Chemikalie und die endgültige Chromsäure ist stark korrosiv und sauer. Arbeiten Sie mit der richtigen Schutzausrüstung. Die Lösung gibt Wärme ab, wenn konzentrierte Schwefelsäure hinzugefügt wird, was bedeutet, dass das Hinzufügen und die richtige Pause zum Abkühlen langsam ist.
    2. Reinigen und aktivieren Sie einen Glasdeckel bei 80 °C für 30 min durch Chromsäurebehandlung. Tauchen Sie die Abdeckungen vollständig in 1% (v/v) APTES Toluenlösung für 1 h bei Raumtemperatur ein und schützen Sie sie vor Licht.
    3. Den Deckelrutsch mit Toluin und absolutem Ethylalkohol waschen und den Deckelrutsch mit einem Stickstoffstrom trocknen.
    4. Den Deckelrutsch bei 80 °C 15 min inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen.
    5. Fügen Sie 200 l Sulfo-SMCC (1 mg/ml) in Dimethylsulfoxid (DMSO)-Lösung zwischen zwei immobilisierten Abdeckungen und Inkubation für 1 h vor Licht geschützt.
    6. Waschen Sie den Deckelrutsch zuerst mit DMSO und dann mit absolutem Ethylalkohol, um Restsulfo-SMCC zu entfernen.
    7. Trocknen Sie den Deckelunterstrich unter einem Stickstoffstrom.
    8. Pipetten Sie 60 l von 200 'M GL-ELP50nm-C Proteinlösung auf einen funktionalisierten Deckelschlupf und inkubieren für ca. 3 h.
    9. Waschen Sie den Deckelrutsch mit reinstem Wasser, um den unreagierten GL-ELP50nm-C zu entfernen.
      HINWEIS: Funktionalisierte Abdeckungen sind für etwa zwei Wochen unter Lagerung bei 4 °C in der Lage.
  2. Funktionalisierte Freischwinger-Oberflächenvorbereitung
    1. Reinigen Sie die Ausleger bei 80 °C für 10 min durch Chromsäurebehandlung.
    2. Funktionalisieren Sie den Ausleger durch Amino-Silanisierung mit 1% (v/v) APTES Tolululuonlösung und backen Sie den Ausleger dann 15 min bei 80 °C, bevor er zu Sulfo-SMCC konjugiert wird.
    3. Verknüpfen Sie den C-ELP50nm-NGL mit der Oberfläche mit der Maleimidgruppe von Sulfo-SMCC für 1,5 h.
    4. Waschen Sie den unreagierten C-ELP50nm-NGL auf dem Deckelrutsch durch Reinstwasser weg.
    5. Tauchen Sie einen funktionalisierten Ausleger in 200 L mit 50 M GL-CBM-XDoc-Proteinlösung ein, die 200 nM OaAEP1 bei 25 °C für 20-30 min enthält. Dann verwenden Sie AFM-Puffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4), um unreagiertes Protein wegzuwaschen.
      HINWEIS: Die Oberflächenchemie der Ausleger und der Deckslip sind ähnlich.

3. Schrittweise Polyproteinzubereitung mit kontrollierten Sequenzen

  1. Verknüpfen Sie die Ligationseinheit Coh-tev-L-POI-NGL mit dem GL-ELP50nm, der von OaAEP1 30 min auf der Deckbedeckungsfläche immobilisiert ist.
  2. Verwenden Sie 15-20 ml AFM-Puffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4), um unreagierte Proteine wegzuwaschen.
  3. Fügen Sie 100 l TEV-Protease (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] Glycerin, pH 8,0) hinzu, um die Proteineinheit an der TEV-Erkennungsstelle für 1 h bei 25 °C zu spalten.
  4. Verwenden Sie 15-20 ml AFM-Puffer, um Restproteine wegzuwaschen.
  5. Verknüpfen Sie die Ligationseinheit Coh-tev-L-POI-NGL 30 min mit dem GL-Ub-NGL-Glass von OaAEP1.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 3,3 bis 3,5 N-1 mal, um das Proteinkonstrukt GL-(Ub)n-NGL auf der Glasoberfläche zu bauen. Lassen Sie die letzte TEV-Spaltungsreaktion aus, um Kohesin auf dem Proteinpolymer als Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass zu reservieren.

4. AFM Experimentmessung und Datenanalyse

  1. AFM-Messungen
    1. 1 ml AFM-Puffer mit 10 mM CaCl2 und 5 mM Ascorbinsäure in die Kammer geben.
    2. Wählen Sie die D-Spitze der funktionalisierten AFM-Sonde für das Experiment aus. Verwenden Sie den Equipartitionssatz, um den Ausleger im AFM-Puffer vor jedem Experiment mit einem genauen Federkonstantenwert (k) zu kalibrieren.
    3. Befestigen Sie die Auslegerspitze an der Probenoberfläche, um das Paar Cohesin/Dockerin zu bilden.
    4. Ziehen Sie den Ausleger mit einer konstanten Geschwindigkeit von 400 nmvon der Oberfläche ein. Zeichnen Sie in der Zwischenzeit die Kraftverlängerungskurve mit einer Abtastrate von 4000 Hz auf.
  2. Datenanalyse
    1. Verwenden Sie JPK-Datenverarbeitung select force-extension traces.
    2. Verwenden Sie Software, um die Ablaufverfolgungen zu analysieren. Passen Sie die Kurven mit dem Wurm-like-Chain (WLC) Modell der Polymerelastizität an und erhalten Sie Entfaltungskraft und Konturlängeninkremente für einzelne Protein-Entfaltungsspitzen.
    3. Passen Sie die Histogramme der sich entfaltenden Kräfte mit dem Gaußschen Modell an, um die wahrscheinlichsten Werte der Entfaltungskraft (u>) und des Konturlängeninkrements (<-Lc>) zu erhalten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Die NGL-Rückstände, die durch OaAEP1-Ligation zwischen benachbarten Proteinen eingebracht werden, haben keinen Einfluss auf die Proteinmonomerstabilität im Polymer, da die Entfaltungskraft (u>) und das Konturlängeninkrement (<-Lc>) mit der vorherigen Studie vergleichbar ist (Abbildung 1). Das Reinigungsergebnis des Rubredoxin-Proteins ist in Abbildung 2dargestellt. Um das Protein nach der TEV-Spaltung zu beweisen, ist es kompatibel mi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Wir haben ein Protokoll zur enzymatischen Biosynthese und Immobilisierung von Polyprotein beschrieben und das Polyproteindesign durch AFM-basierte SMFS verifiziert. Diese Methode bietet einen neuartigen Ansatz für den Aufbau des Protein-Polymers in einer entworfenen Sequenz, die frühere Methoden für Polyprotein-Engineering und Immobilisierung4,6,52,53,54

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. BK20160639) und Shuangchuang-Programm der Provinz Jiangsu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
iron (III) chloride hexahydrateEnergy chemical99%
Zinc chlorideAlfa Aesar100.00%
calcium chloride hydrateAlfa Aesar99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic AcidSigma Life ScienceBio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilaneSigma-Aldrich≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylateThermo Scientific90%
GlycerolMacklin99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)Alfa Aesar
GenesGenscript
Equipment
Nanowizard 4 AFMJPK Germany
MLCT cantileverBruker Corp
Mono Q 5/50 GLGE Healthcare
AKTA FPLC systemGE Healthcare
Glass coverslipSail Brand
Nanodrop 2000Thermo Scientific
Avanti JXN-30 CentrifugeBeckman Coulter
Gel Image SystemTanon

Referenzen

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775(2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881(2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328(2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989(2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950(2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456(2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185(2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894(2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518(2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569(2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167(2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BiochemieAusgabe 156Einzelmolek l KraftspektroskopieBiokonjugationProteinimmobilisierungAtomkraftspektroskopieOaAEP1Proteintechnik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten