Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Zusammenfassung

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Zusammenfassung

Die intravitale Mikroskopie des Darms mittels konfokaler Bildgebung ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Epithelzellvergießen und Barrierelecks bei lebenden Tieren. Daher ist die Darmschleimhaut von anästhesierten Mäusen topisch mit unspezifischen Färbungen (Acriflavin) und einem fluoreszierenden Tracer (Rhodamine-B-Dextran) befleckt, auf einer kochstofffreien, vorspülenden Platte montiert und direkt mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Diese Technik kann andere nicht-invasive Techniken ergänzen, um Leckagen der Darmdurchlässigkeit zu identifizieren, wie z. B. transmukosale Passagen oral verabreichter Tracer. Darüber hinaus ermöglicht der hier vorgestellte Ansatz die direkte Beobachtung von Zellabwurfereignissen in Echtzeit. In Kombination mit geeigneten fluoreszierenden Reportermäusen eignet sich dieser Ansatz, um Licht in zelluläre und molekulare Mechanismen zur Steuerung der Darmepithelzellextrusion sowie in andere biologische Prozesse zu werfen. In den letzten Jahrzehnten haben interessante Studien mit intravitaler Mikroskopie unter anderem zu Erkenntnissen über endotheliale Permeabilität, Immunzelldarmhoming, immunepitheliale Kommunikation und Invasion von Leuchtkörperkomponenten beigetragen. Zusammen würde das hier vorgestellte Protokoll nicht nur dazu beitragen, das Verständnis von Mechanismen zur Steuerung der Epithelzellextrusion zu erhöhen, sondern könnte auch die Grundlage für die Entwicklung anderer Ansätze sein, die als Instrumente zur Visualisierung anderer hochdynamischer zellulärer Prozesse, auch in anderen Geweben, verwendet werden sollen. Unter den technischen Einschränkungen würden die optischen Eigenschaften des spezifischen Gewebes sowie die ausgewählte Bildgebungstechnologie und Mikroskopkonfiguration wiederum den bildgebenden Arbeitsabstand und die Auflösung der aufgenommenen Bilder bestimmen.

Einleitung

Der Darm ist ein hochspezialisiertes Organ mit einer streng regulierten Funktion, die widersprüchliche Prozesse ermöglicht, nämlich Ernährung und Schutz vor schädlichen Leuchtstoffen. Das Darmepithel wirkt als physikalische und immunologische Barriere und trägt zur Aufrechterhaltung der Schleimhautostase im Darm^1,2bei. Verlust der epitheliale Integrität und erhöhte enge Knotendurchlässigkeit ist bekannt, mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) verbunden sein^3,4,5,6. Epithelveränderungen werden dann als Ursachen und Sekundärverstärker für chronische Darmentzündungen bei IBD betrachtet. Somit wäre ein verbessertes Verständnis der frühen epitheliale Veränderungen im Darm von IBD-Patienten von immensem Wert für die Entwicklung neuer Strategien zur Wiederherstellung der Epithelintegrität für eine zuverlässige Vorhersage und anschließende Prävention von IBD-Rückfällen.

Das Darmepithel folgt einem komplexen und streng regulierten Umsatzprozess. Vom Kryptaboden wandern endlos differenzierte Darmepithelzellen (IECs), die aus pluripotenten Stammzellen abgeleitet sind, nach oben zur Villusspitze, wo gealterte/geschädigte Zellen in das Lumen⁷vergossen werden. Das Gleichgewicht zwischen Teilung und Zellextrusion ermöglicht die Aufrechterhaltung von Darmepithelzellzahlen, wodurch die Bildung von Lücken und Leckagen vermieden wird, sowie die Ansammlung von Epithelzellen, die potenziell zu Zellmassen und Tumorgenese^8,9,10führen. Trotz der Schlüsselrolle des Epithelzellvergießens bei der physiologischen Erneuerung des Darmepithels ist das Wissen über die molekularen Mechanismen, die die Extrusion von Zellen an der Villusspitze vorantreiben, begrenzt. Daher ist eine Grundlagenforschung erforderlich, die eine genaue Beschreibung der Abfolge molekularer Ereignisse liefert, die an der Epithelzellvergießen beteiligt sind.

Komplexe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb der Darmschleimhaut sind der Schlüssel zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die den Epithelumsatz und die Darmhomöostase regulieren. In-vivo-Studien bieten in diesem Zusammenhang hohe Vorteile gegenüber In-vitro- und Ex-vivo-Ansätzen. Darüber hinaus ermöglichen Echtzeit-Bildgebungstechniken die Beschreibung der Abfolge von Ereignissen, die bestimmte Phänomene steuern. In diesem Zusammenhang erfordert die Untersuchung hochdynamischer Prozesse den Einsatz optimierter hochauflösender Techniken zur direkten Beobachtung des Gewebes. Intravitale bildgebende Verfahren erscheinen als einzigartige geeignete Werkzeuge für die Untersuchung von Epithelzellvergießen im Darm.

Der Begriff "Intravitale Mikroskopie" bezieht sich auf experimentelle Ansätze, bei denen hochauflösende bildgebende Verfahren (Multiphotonen- oder Konfokalmikroskopie) genutzt werden, um Zellen und Gewebe in ihrer heimischen Umgebung innerhalb eines lebenden Tieres direkt zu visualisieren¹¹. Es ermöglicht die Echtzeiterfassung von In-vivo-Informationen bis hin zur Einzelzellauflösung und bringt klare Vorteile gegenüber statischen oder niedrig auflösenden Methoden mit sich. Die Intravital-Mikroskopie bietet ergänzende Informationen und überwindet einige Einschränkungen klassischer und/oder High-End-Techniken, wie z. B. Artefakte aufgrund der Gewebeverarbeitung. Im Gegensatz dazu besteht die Hauptbeschränkung der intravitalen Mikroskopie darin, dass das Gewebe direkt dem Mikroskop ausgesetzt werden sollte, was in den meisten Fällen einer Operation bedarf. Obwohl ausgeklügelte Ansätze die Vitalität bewahren und die Auswirkungen des abgebildeten Gewebes (Hautkammern und bildgebende Fenster)^12,13minimieren, wird in den meisten Fällen ein einfacher Hautschnitt für die Externalisierung des Gewebes (Hautklappen) durchgeführt¹⁴. In den letzten zehn Jahren haben diese Ansätze wichtige Beweise für hochdynamische Prozesse beigesteuert, die zuvor undurchschaubar waren. Übersetzt lieferte die Echtzeit-Bildgebung neue biologische Erkenntnisse über Stammzell und Leukozyten mit¹⁵, sowie Krebsverbreitung und Metastasenbildung^13,16. Im klinischen Kontext wird die Endomikroskopie derzeit als diagnostisches Instrument für Krebs¹⁷ und Magen-Darm-Erkrankungen wie IBD^18,19genutzt; während konfokale Mosaikmikroskopie wurde ein schnelles Pathologie-Werkzeug während der Operation²⁰. Gemeinsam hat sich die intravitale Mikroskopie in letzter Zeit zu einem wertvollen und vielseitigen Werkzeug für die biomedizinische Forschung und zukünftige Anwendung in der Klinik entwickelt.

Die Intravital-Mikroskopie ist hier für die Echtzeit-Visualisierung der Darmepithel-Leckage und die Beobachtung von Epithelzellabwurfereignissen implementiert. Die Leckage der Darmdurchlässigkeit kann durch andere in vivo nichtinvasive Techniken identifiziert werden, wie die Quantifizierung der oralen Verabreichung von fluoreszierenden Tracern im Serum²¹. Diese Technik erlaubt jedoch weder die direkte Beobachtung der Abwurfleistung noch die Segregation zwischen para- und transzellulärer Durchlässigkeit. Die Kombination von Standard-Tracer-Experimenten und intravitaler Mikroskopie stellt einen geeigneten Ansatz dar, um: i) Störungen der Darmdurchlässigkeit zu identifizieren und ii) zwischen para- und transzellulärer Epithelpermeabilität zu trennen. Neben dem Zellabwurf ermöglicht die intravitale Mikroskopie in Kombination mit der In-vivo-Fluoreszenzkennzeichnung die Untersuchung anderer zellulärer und molekularer Mechanismen (z. B. enge Umverteilung der Verbindung beim Zellabwurf mit fluoreszierenden Reportermäusen²² oder Wechselwirkungen zwischen IECs und anderen Zellen innerhalb der Darmschleimhaut²³).

Die hier vorgestellte Methode stellt eine Anpassung der intravitalen Mikroskopie dar, um die Echtzeitbeobachtung der Darmschleimhaut mittels konfokaler Laserscanmikroskopie (CLSM) zu ermöglichen. Daher verwenden wir bedingte Knock-out-Mäuse von GGTase (Geranylgeranyltransferase) in Darmepithelzellen (IECs) bei (Pggt1b^{i-IEC-Mäusen),} da sie an einer schweren Darmerkrankung und erhöhter epithelialen Permeabilität leiden²⁴. Die chirurgische Präparation der Maus und die Färbung der Darmschleimhaut sowie geeignete Einstellungen für die bildgebende Erfassung und Nacherfassungsanalyse werden beschrieben. Dieses Protokoll könnte zukünftige Studien ermöglichen, die zum aktuellen Wissen über Dynamik und Kinetik des Darmepithelzellabwurfs beitragen. Darüber hinaus könnte das Protokoll als Grundlage für verschiedene Anpassungen dienen, um andere Phänomene zu untersuchen, die an der Oberfläche der Darmschleimhaut und sogar an anderen Geweben auftreten.

Protokoll

Das folgende Protokoll wurde von den zuständigen Gemeinden in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Deutschland) genehmigt. Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht.

HINWEIS: Die Hemmung der GGTase-vermittelten Pränylierung innerhalb der IECs führt zu einer starken Veränderung der²⁴Darmdurchlässigkeit bei Pggt1b-I-IEC-Mäusen 24 . Pggt1b^iΔIEC Daher wurde dieses Mausmodell verwendet, um zu demonstrieren, wie das Protokoll nützlich sein kann, um Darmbarrieredefekte zu untersuchen. Dieses Protokoll könnte jedoch für das Studium jeder anderen Mauslinie verwendet werden.

1. Chirurgische Präparation und Maus Darmschleimhaut Färbung

HINWEIS: Das chirurgische Präparat basiert auf den zuvor beschriebenen Protokollen²⁵. Halten Sie die anästhesierte Maus während der chirurgischen Vorbereitung unter einer roten Lampe, um einen Rückgang der Körpertemperatur zu vermeiden.

1. Anästhesisieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin (96 mg/kg Ketamin; und 12,8 mg/kg Xylazin). Überprüfen Sie die Anästhesie, indem Sie auf das Fehlen eines Augenlidreflexes überprüfen.
2. Tragen Sie Augenschutzcreme mit einer Baumwollknospe auf.
3. Machen Sie einen Schnitt (1 cm) auf dem linken ventralen Bereich mit Standardzange und gerade feine Schere.
4. Exteriorisieren Sie ein Segment des Darms (5-7 cm, ungefähr).
5. Öffnen Sie das exteriorisierte Darmsegment längs durch Elektrokauterisierung an der antimesenterseite.
6. Stellen Sie die Schleimhaut aus und spülen Sie sie kurz mit einer Salinelösung ab, um den Fäkaliengehalt zu entfernen.
   HINWEIS: Optional wenden Sie Xylazin direkt auf den Darm an, um Bewegungsartefakte aufgrund von Peristalsis zu vermeiden.
7. Färben Sie die Oberfläche der Darmschleimhaut mit Akriflavine und Rhodamine-B-Dextran (10 kDa).
   1. Tragen Sie die 1 mg/ml-Akriflavinlösung (100 l) auf, indem Sie Tropfen für Tropfen auf die Schleimhaut pfeifen und 3 min brüten. Waschen Sie die restliche Lösung mit PBS aus.
   2. Tragen Sie die 2 mg/ml Rhodamine-Dextran-Lösung (100 l) auf, indem Sie Tropfen für Tropfen auf die Schleimhaut pfeifen und 3 min brüten. Waschen Sie die restliche Lösung mit PBS aus.
      HINWEIS: Optional bluten Sie mit aseptischer Baumwolle aus der Zubereitung.
8. Legen Sie die anästhesierte Maussupine auf einen Abdeckschlitten, der in einer kammerförmigen, mit vorgewärmter Herz-Skelett-Lösung (37 °C) gespült ist.
   HINWEIS: Das geöffnete Darmsegment wird dann luminal oberfläche nach unten platziert, auf dem Deckschlitten.
9. Legen Sie das Präparat (anästhetisierte Maus in der Kammer) auf die invertierte Mikroskopstufe.
10. Bedecken Sie das Tier mit einem isothermen Pad (ca. 37 °C).
11. Fahren Sie sofort mit der intravitalen Mikroskopie fort.
    HINWEIS: Bewahren Sie das chirurgische Präparat mit vorgewärmter Herzlösung vor, um eine Austrocknung des Gewebes und den Zelltod zu vermeiden.

2. Intravitale Mikroskopie

HINWEIS: Führen Sie Schritt 2.1 vor Beginn der chirurgischen Vorbereitung durch, um lange Wartezeiten zwischen Anästhesie, Operation und Bildaufnahme zu vermeiden. Bei Bedarf können chirurgisch zubereiteten Tieren zusätzliche Dosen von Anästhetika verabreicht werden, um sie für die bildgebenden Experimente unter Narkose zu halten.

1. Richten Sie das CLSM-Mikroskop ein.
   1. Starten Sie das CLSM-Mikroskop, indem Sie die Mikroskopbasis und die Scannerbox einschalten. Schalten Sie den Computer ein, indem Sie die Starttaste drücken.
   2. Starten Sie die Bildaufnahmesoftware (z.B. LAS X) durch Doppelklick auf das Symbol. Wählen Sie die entsprechende Konfiguration (Konfiguration: Maschine; Mikroskop: DMI6000) und klicken Sie auf OK.
      1. Definieren Sie die entsprechende Auflösung. Gehen Sie zu Konfiguration | Hardware | Auflösung | Bittiefe. Wählen Sie 12.
   3. Wechseln Sie zum Menü "Anschaffung". Wählen Sie xyzt für den Bildaufnahmemodus aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie das Ziel aus dem Drop-off-Menü (20x oder 40x).
   4. Entwerfen Sie die sequenzielle Erfassungseinstellung. Klicken Sie auf Seq. Fügen Sie eine zweite Sequenz hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen (+) klicken. Wählen Sie Zwischen Frames.
      1. Konfigurieren Sie Sequenz 1 (Erkennung von Akriflavine; 416 nm Anregung; 514 nm Emission). Schalten Sie die sichtbare Laserbox ein. Aktivieren Sie den PMT1 (ON). Definieren Sie das Emissionswellenlängenfenster (490-550 nm).
      2. Konfigurieren Sie Sequenz 2 (Nachweis von RhodamineB-Dextran; 570 nm Anregung; 590 nm, Emission). Schalten Sie die sichtbare Laserbox ein. Aktivieren Sie das PMT2 (ON). Definieren Sie das Emissionswellenlängenfenster (550-760).
   5. Aktivieren Sie die entsprechenden Laser (488 und 552). Gehen Sie zu Konfiguration | Laser. Aktivieren Sie 488- und 552-nm-Laser (einschalten).
2. Passen Sie die Einstellung an die spezifischen Features des aktuellen Experiments an.
   1. Schalten Sie die Lichtquelle ein (drücken Sie die Leistung). Legen Sie das Präparat (anästhetisierte Maus in der Kammer) auf die Mikroskopstufe und ändern Sie die xy-Position, bis die Beleuchtungsachse auf das Gewebepräparat fokussiert ist.
   2. Wählen Sie das Interessenfeld mit der Standard-Lichtquelle und den Okularen aus.
      1. Wählen Sie den Filterwürfel (I3) aus. Öffnen Sie den Verschluss. Konzentrieren Sie sich mit dem Makro- und Mikrorad auf die Oberfläche der Darmschleimhaut. Suchen Sie nach einem Bereich, in dem mehrere Zotten im Sichtfeld visualisiert werden können, indem Sie die XY-Position ändern.
   3. Stellen Sie sicher, dass die Rhodamine-Dextran-Färbung auch in diesem Bereich sichtbar ist. Ändern Sie den Filterwürfel (N2.1). Überprüfen Sie das Bild durch die Okularen.
   4. Starten Sie die CLSM-Bildaufnahme aus der Software. Optimieren Sie die Einstellungen für die beiden Sequenzen.
      1. Wählen Sie Sequenz 1 aus. Passen Sie Laserleistung, Verstärkung und Offset für Sequenz 1 an.
      2. Wählen Sie Sequenz 2. Passen Sie Laserleistung, Verstärkung und Offset für Sequenz 2 an.
   5. Definieren Sie den Z-Stack-Bereich.
      1. Öffnen Sie das Z-Stack-Drop-off-Menü. Konzentrieren Sie sich mit der Z-Achsen-Steuerung auf die Oberfläche der Schleimhaut. Drücken Sie Begin.
      2. Konzentrieren Sie sich auf die untere Grenze, an der das Signal noch nachweisbar ist. Drücken Sie Ende.
      3. Definieren Sie die Anzahl der z-Stacks (10). Vermeiden Sie Zeitraffer länger als 2 min für zwei aufeinander folgende Zeitpunkte.
   6. Definieren Sie die Zeiteinstellungen. Gehen Sie zum Menü Zeit. Klicken Sie auf Minimieren. Wählen Sie Acquire aus, bis sie beendet wurden.
   7. Definieren Sie den Zeilendurchschnitt. Wählen Sie Seq 1. Wählen Sie Zeilendurchschnitt 2 aus. Wählen Sie Seq 2. Wählen Sie Zeilendurchschnitt 2 aus.
3. Erfassen Sie entsprechende Bilder.
   1. Wählen Sie Format (1024 x 1024) und Geschwindigkeit (400). Drücken Sie Start.
   2. Drücken Sie nach der gewünschten Bildaufnahmezeit auf Stopp.
4. Speichern Sie die Datei. Wechseln Sie zu Projekt. Rechtsklick auf die entsprechende Datei. Drücken Sie Speichern als.
   1. Benennen Sie die Datei entsprechend. Wählen Sie den entsprechenden Ordner aus. Drücken Sie Speichern.
5. Euthanisieren Sie das Tier (zervikale Dislokation) und sammeln Sie Gewebe für die zusätzliche Analyse, wenn nötig.

3. Bildanalyse: Bestimmen der Zellabwurfrate und des Darmepithels

1. Zellabwurfrate
   1. Starten Sie die Bildaufnahmesoftware.
   2. Wechseln Sie zu Offene Projekte. Wählen Sie die entsprechende Datei aus.
   3. Definieren Sie die Gesamtzeit der Bildaufnahme.
      1. Wählen Sie den letzten vollständigen z-Stack aus. Wählen Sie die letzte Z-Position aus dem zuvor ausgewählten Zeitpunkt aus. Lesen Sie die Uhrzeit in der rechten unteren Ecke des Bildschirms (Gesamtzeit der Bildaufnahme).
   4. Wählen Sie einen Villus aus.
      1. Wählen Sie die entsprechende Z-Stack-Position (Oberfläche des Villus, aber tief genug, um die Interferenz mit bereits vergossenen Zellen und anderen Komponenten, die am Lumen vorhanden sind) zu vermeiden.
      2. Messen Sie die Länge der Basalmembran. Wählen Sie das Linealwerkzeug aus. Teilen Sie den Villus in mehrere Linien, um den gesamten Villus-Umfang zu bedecken oder zu zeichnen. Fügen Sie die verschiedenen Werte hinzu (Gesamtlänge der Basalmembran). Löschen Sie die Segmente des Linealwerkzeugs.
   5. Zählen Sie die Anzahl der Ereignisse, die während der gesamten Dauer der Bildaufnahme auftreten.
      1. Teilen Sie den Villus in Segmente mit einer angemessenen Größe auf. Analysieren Sie die Abfolge von Ereignissen/Segmenten, indem Sie den Balken durch die verschiedenen Zeitpunkte schieben. Kommentieren Sie die identifizierten Zellabwurfereignisse.
   6. Berechnen Sie die Anzahl der Abwurfereignisse/Zeit/Länge der Basalmembran, die die Zellabwurfrate angibt. Zählen Sie bis zu 5 Villi/Video und mindestens zwei Videos/Maus. Berechnen Sie den Mittelwert dieser 10 Messungen.
2. Leckage
   1. Wählen Sie einen Villus aus.
   2. Wählen Sie die entsprechende Z-Stack-Position (Oberfläche des Villus, aber tief genug, um die Interferenz mit bereits vergossenen Zellen und anderen Komponenten, die am Lumen vorhanden sind) zu vermeiden. Zählen Sie die Gesamtzahl der Epithelzellen/Villus.
   3. Zählen Sie die Anzahl der Leckagepunkte (Parazelluläre Präsenz von Rhodamine dextran. Dieses Ereignis ist vorübergehend, was durch Die Überprüfung früherer und nachstehender aufgenommener Bilder bestätigt werden kann).
   4. Berechnen Sie die Anzahl der Leckage/Gesamtanzahl der Epithelzellen. Analysieren Sie 10 verschiedene Villus/Sample/Video und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Leckagen und durchlässigen Zellen/Villus.

Ergebnisse

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt einen intravitalen Mikroskopie-basierten Ansatz zur Visualisierung von Darmepithellecks und zur Beobachtung der Zellabwurfleistung im Darm in Echtzeit. Kurz gesagt, Mäuse werden anästhesiert und der chirurgischen Präparation unterzogen, um die Oberfläche der Dünndarmschleimhaut freizulegen. IECs werden dann durch topische Anwendung von Acriflavine gefärbt; während luminale Rhodalin B-Dextran als Tracer verwendet wird, um transmukosale Pass...

Diskussion

Obwohl die intravitale Mikroskopie-basierte Methodik technisch anspruchsvoll ist, stellt sie einen einzigartigen experimentellen Ansatz dar, um hochdynamische zelluläre Prozesse in Echtzeit zu visualisieren, wie z. B. die Zellabwurfleistung. Bisher gibt es keinen alternativen experimentellen Ansatz zur Visualisierung der Zellextrusion in vivo. Wir glauben, dass dieses Protokoll zur Beschreibung verschiedener zellulärer Prozesse beitragen kann, die eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmhomöostase spielen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acriflavine hydrochloride	Sigma Aldrich	A8251	1 mg/mL solution in PBS
Deltaphase isothermal pad	BrainTree	B-DP-PAD	-
Gemini Cautery System	BrainTree	B-GEM-5917	-
Ketamin	WDT	9089.01.00
LAS X	Leica	-	-
LSM microscope SP8	Leica	-	-
PBS	Biochrom	L182
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1824	10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution
Standard forceps (Dumont SS)	Fine Science Tools	11203-23	-
Straight fine scissors	Fine Science Tools	14060-10	-
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648	50 mg/mL in ethanol
Xylazin	Bayer	1320422