Stabiler Knockdown von Genen, die extrazelluläre Matrixproteine in der C2C12 Myoblast-Zelllinie mit Small-Hairpin (sh)RNA kodieren

Zusammenfassung

Wir bieten ein Protokoll, um Gene, die extrazelluläre Matrixproteine (ECM) in C2C12-Myoblasten kodieren, mit Small-Hairpin (sh) RNA zu fallig zu senken. Als Beispiel für ADAMTSL2 beschreiben wir die Methoden zur Validierung der Knockdown-Effizienz auf mRNA-, Protein- und Zellebene während der Myotube-Differenzierung von C2C12.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Matrixproteine (ECM) sind entscheidend für die Entwicklung von Skelettmuskeln und Homöostase. Der stabile Knockdown von Genen, die für ECM-Proteine in C2C12-Myoblasten kodieren, kann angewendet werden, um die Rolle dieser Proteine bei der Entwicklung der Skelettmuskeln zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erschöpfung des ECM-Proteins ADAMTSL2 als Beispiel, indem man small-hairpin (sh) RNA in C2C12-Zellen verwendet. Nach der Transfektion von shRNA-Plasmiden wurden stabile Zellen mit Puromycin chargenausgewählt. Wir beschreiben weiter die Aufrechterhaltung dieser Zelllinien und die phänotypische Analyse mittels mRNA-Expression, Proteinexpression und C2C12-Differenzierung. Die Vorteile der Methode sind die relativ schnelle Erzeugung stabiler C2C12-Knockdown-Zellen und die zuverlässige Differenzierung von C2C12-Zellen in mehrkernige Myotuben bei Erschöpfung des Serums im Zellkulturmedium. Die Differenzierung von C2C12-Zellen kann durch Hellfeldmikroskopie und durch Messung der Expressionskonzentrationen kanonischer Markergene wie MyoD, Myogenin oder Myosin-Schwere Kette (MyHC) überwacht werden, was auf das Fortschreiten der C2C12-Myoblastendifferenzierung in Myoröhren hinweist. Im Gegensatz zum vorübergehenden Knockdown von Genen mit small-interfering (si) RNA können Gene, die später bei der C2C12-Differenzierung oder während der Myotube-Reifung exprimiert werden, effizienter gezielter werden, indem C2C12-Zellen erzeugt werden, die shRNA stabil exprimieren. Einschränkungen der Methode sind eine Variabilität der Knockdown-Effizienz, abhängig von der spezifischen shRNA, die durch die Verwendung von Gen-Knockout-Strategien auf der Grundlage von CRISPR/Cas9 überwunden werden kann, sowie potenziellen Off-Target-Effekten der shRNA, die in Betracht gezogen werden sollten.

Einleitung

Extrazelluläre Matrixproteine (ECM) unterstützen strukturell alle Gewebe, vermitteln die Zell-Zell-Kommunikation und bestimmen das Zellschicksal. Die Bildung und dynamische Umgestaltung des ECM ist daher entscheidend für die Erhaltung der Gewebe- und Organhomöostase^1,2. Pathologische Varianten in mehreren Genen, die für ECM-Proteine kodieren, führen zu Muskel-Skelett-Erkrankungen mit Phänotypen, die von Muskeldystrophien bis zum pseudomouscularen Aufbau^3,4reichen. Zum Beispiel verursachen pathogene Varianten in ADAMTSL2 die extrem seltene Muskel-Skelett-Störung geleophysische Dysplasie, die mit pseudomuskulärem Aufbau, d.h. einer scheinbaren Zunahme der Skelettmuskelmasse⁵. Zusammen mit Genexpressionsdaten bei Maus und Menschen deutet dies auf eine Rolle für ADAMTSL2 bei der Entwicklung von Skelettmuskeln oder der Homöostase^6,7hin.

Das Protokoll, das wir hier beschreiben, wurde entwickelt, um den Mechanismus zu untersuchen, mit dem ADAMTSL2 die Entwicklung von Skelettmuskeln und/oder Homöostase in einer Zellkulturumgebung moduliert. Wir schlugen ADAMTSL2 in der murinen C2C12 Myoblast-Zelllinie stabil nieder. C2C12 Myoblaste und ihre Differenzierung in Myotuben ist ein gut beschriebenes und weit verbreitetes Zellkulturmodell für Skelettmuskeldifferenzierung und Skelettmuskelbioengineering^8,9. C2C12-Zellen durchlaufen nach serumerumerentzug unterschiedliche Differenzierungsschritte, was zur Bildung von mehrnukleierten Myoröhren nach 3 bis 10 Tagen in der Kultur führt. Diese Differenzierungsschritte können zuverlässig überwacht werden, indem mRNA-Spiegel verschiedener Markergene wie MyoD, Myogenin oder Myosin schwere Kette (MyHC) gemessen werden. Ein Vorteil der Erzeugung stabiler Genknockdowns in C2C12-Zellen besteht darin, dass Gene, die in späteren Stadien der C2C12-Differenzierung exprimiert werden, effizienter ins Visier genommen werden können, verglichen mit einem vorübergehenden Knockdown, der durch klein störende (si) RNA erreicht wird, die in der Regel 5 bis 7 Tage nach der Transfektion dauert und von der Transfektionseffizienz beeinflusst wird. Ein zweiter Vorteil des hier beschriebenen Protokolls ist die relativ schnelle Generierung von Chargen von C2C12-Knockdown-Zellen mit Puromycin-Auswahl. Alternativen wie CRISPR/Cas9-vermittelter Genknockout oder die Isolierung von primären Skelettmuskelzellvorläufern von Mäusen mit menschlichem oder Zielgenmangel sind technisch schwieriger oder erfordern die Verfügbarkeit von Patientenmuskelbiopsien bzw. Zielgen-Mangelmäusen. Ähnlich wie bei anderen zellkulturbasierten Ansätzen gibt es jedoch Einschränkungen bei der Verwendung von C2C12-Zellen als Modell für die Differenzierung von Skelettmuskelzellen, wie die zweidimensionale (2D) Natur des Zellkultur-Setups und das Fehlen der in vivo Mikroumgebung, die entscheidend ist, um undifferenzierte Skelettmuskelvorläuferzellen¹⁰zu erhalten.

Protokoll

1. Vorbereitung der shRNA Plasmid DNA von Escherichia coli

1. Erzeugung klonaler Bakterienkolonien, die die shRNA-Plasmide tragen
   1. Erhalten Sie Glyzerinvorräte von E. coli, die zielspezifische shRNA-Plasmide und ein Kontrollplasmid aus kommerziellen Quellen tragen (Materialtabelle).
      HINWEIS: Es wurden drei verschiedene shRNA-Plasmide verwendet, die auf verschiedene Regionen der murinen Adamtsl2 mRNA abzielen. Eine shRNA wurde ausgewählt, um die 3'-unübersetzte Region (3'UTR) von Adamtsl2 zu zielen, um Rettungsexperimente mit Expressionsplasmiden zu erleichtern, die rekombinante ADAMTSL2- oder einzelne ADAMTSL2-Proteindomänen kodieren. Darüber hinaus wurde ein rühriges shRNA-Plasmid als Negativkontrolle aufgenommen. Einzelheiten zu den shRNA-Sequenzen sind in Abbildung 1Aangegeben.
   2. Den shRNA-Bakterienglycerinbestand bei Raumtemperatur (RT) auftauen. Übertragen Sie 10 l bakterielleglyzerin-Bestände auf eine Luria-Bertani (LB) Agarplatte, ergänzt durch 100 g/ml Ampicillin (LB-Amp).
      HINWEIS: LB-Amp Platten werden durch Autoklavieren von 1 L LB Medium (für 1 L: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, pH auf 7,0) zusammen mit 12 g Agar hergestellt. Lassen Sie das Medium auf 50 °C abkühlen und Ampicillin (Lagerlösung: 50 mg/ml in sterilem Wasser) zu einer Endkonzentration von g/ml (LB-Amp-Agar) hinzufügen. 20 ml LB-Amp-Agar sofort in eine 10 cm Petrischale geben und den Agar vor Gebrauch erstarren lassen. 1 L LB-Amp Agar ist in der Regel ausreichend, um etwa 40 10 cm Petrischalen zu gießen. Petrischalen, die LB-Amp-Agar enthalten, sind mindestens einen Monat stabil, wenn sie bei 4 °C im Dunkeln versiegelt gelagert werden.
   3. Verbreiten Sie Bakterien mit sterilen Drygalski Spachtel oder jede andere geeignete Methode, um einzelne Bakterienkolonien zu erreichen. Bakterienplatten über Nacht bei 37 °C auf den Kopf stellen.
2. Plasmid-Präparation
   1. Am nächsten Morgen entfernen Sie die Petrischale mit den einzelnen Bakterienkolonien und lagern Sie bei 4 °C, um ein Überwuchern der Bakterienkolonien und die Bildung von Satellitenkolonien zu vermeiden. Versiegeln Sie die Petrischale, wenn sie über Nacht oder länger gelagert wird.
   2. Am Nachmittag 5 ml LB-Amp Medium in ein Polypropylen-Bakterienkulturrohr geben. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie aus der Übernacht mit einer Pipette-Spitze kultivierten Petrischale und impfen Sie LB-Amp-Medium, indem Sie die Pipettenspitze in das Bakterienkulturrohr auswerfen, das das LB-Amp-Medium enthält.
   3. Inkubieren Sie die Bakterienkultur über Nacht in einem Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C mit lose anbringendem Deckel, um die Belüftung zu ermöglichen.
   4. Nehmen Sie am nächsten Morgen eine bakterielle Kulturröhre heraus und halten Sie sie bei 4 °C, um bakterielles Überwuchern zu vermeiden. Am Nachmittag bakterien durch Wirbeln wieder aussetzen und 1 ml der nächtlichen Bakterienkultur in 50 ml LB-Amp-Medium in einem 250 ml Kegelkolben übertragen. Über Nacht in einem Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C inkubieren.
   5. Am nächsten Morgen Bakterien in ein 50 ml Einwegzentrifugenrohr und Zentrifugenbakterien bei 6.000 x g bei RT für 15 min übertragen. Entfernen Sie das Medium und fahren Sie mit Schritt 1.2.6 fort.
      HINWEIS: Wenn Plasmid-DNA nicht sofort isoliert werden kann, entfernen Sie das LB-Amp-Medium nach dem Zentrifugationsschritt und lagern Sie das Bakterienpellet bei -20 °C.
   6. Befolgen Sie die Anweisungen für Plasmid-Vorbereitungkit (Midi-Skala), um die Plasmid-DNA aus den Bakterien zu extrahieren. Bewerten Sie die DNA-Qualität von Plasmiden, indem Sie das Verhältnis A_260/A280 mit einem Spektralphotometer messen.
      HINWEIS: Ein A₂₆₀/A₂₈₀ Verhältnis von >1.8 ist wünschenswert, was auf eine hohe Reinheit der Plasmid-DNA-Präparation hinweist. Ein niedrigeres A₂₆₀/A₂₈₀ Verhältnis deutet auf eine Kontamination mit Protein oder eine unzureichende Entfernung von Extraktionsreagenzien hin. Zusätzliche Plasmidreinigungsschritte können erforderlich sein.

2. Kulinatur und Transfektion von C2C12-Zellen und Puromycin-Auswahl

1. C2C12-Zellkultur
   1. C2C12-Zellen(Materialtabelle) schnell in einem 37 °C-Wasserbad auftauen und Zellen in sterilen Einweg-15 ml Zentrifugenrohrgießen gießen, das 8 ml des modifizierten Eagle Mediums (DMEM) von Dulbecco enthält, ergänzt mit 100 Einheiten Penicillin- und Streptomycin-Antibiotika (serumfreies DMEM) in einer Zellkulturhaube. Zentrifugenzellen für 3 min bei 160 x g bei RT.
   2. Aspirieren Sie überstand und setzen Sie das Zellpellet in 10 ml serumfreiem DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) (komplettes DMEM) wieder auf. Übertragen Sie Zellen auf 10 cm Gewebekultur behandelt Kunststoffgeschirr. Inkubieren Sie Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
   3. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch frisches komplettes DMEM.
   4. Erweitern Sie die C2C12-Zellen mit niedriger Durchgang auf 3 x 4 10 cm Großen Unden. Wenn die C2C12-Zellen einen Zusammenfluss von 50 bis 60 % erreichen, aspirieren Sie das Medium und spülen C2C12-Zellen mit 10 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
   5. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzu und brüten 2 min bei RT. Überwachen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop und verlängern Sie bei Bedarf die Inkubationszeit, bis die meisten Zellen getrennt sind.
      HINWEIS: Sorgfältiges Tippen auf die Schale kann helfen, die Zellen zu vertreiben.
   6. Wenn die meisten Zellen abgetrennt sind, fügen Sie der Schale 10 ml komplettes DMEM hinzu, pipetteieren Sie das Volumen mehrmals nach oben und unten und übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles Einweg-Zentrifugenrohr von 15 ml. Zentrifugenzellen für 3 min bei 160 x g bei RT. Abstandaden aspirieren und das Zellpellet in 2 ml Gefriermedium (10% Dimethylsulfoxid [DMSO]/90% FBS) wieder aufsetzen.
   7. Zwei 1 ml Aliquots pro 10 cm Schale in Kryovials übertragen. In einem mit RT Isopropanol gefüllten Zellgefrierbehälter für mindestens 24 h in einem Gefrierschrank von -80 °C inkubieren, was zu einer Gefrierrate von etwa -1 °C pro Min führt, um die Bildung von Eiskristallen zu vermeiden. Speichern Sie Zellen für den langfristigen Einsatz in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff.
      HINWEIS: Der Hersteller empfiehlt die Verwendung von C2C12-Zellen bis zu Durchgangsnummer 15. Die Erfahrungen der Autoren zeigten auch, dass zellender niedrigerer Durchgangszahl eine konsistentere und schnellere Differenzierung in Myotuben aufwiesen. Es ist wichtig, C2C12-Zellen bei geringer Zelldichte (<50% Zusammenfluss) zu erhalten, um einen vorzeitigen Beginn der Differenzierung zu vermeiden. Differenzierende oder differenzierte C2C12-Zellen können nicht in den ursprünglichen Myoblast-Zustand zurückgesetzt werden und müssen verworfen werden.
2. Vorbereitung von C2C12-Zellen für die Transfektion
   1. Kultur undifferenzierte C2C12-Zellen in einer 10 cm Schale, bis sie 50 bis 60% Zusammenfluss erreichen. Saugen Sie das Medium, spülen C2C12-Zellen mit 10 ml PBS, und fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzu. 2 min bei RT inkubieren, die Zellablösung unter dem Mikroskop überwachen und bei Bedarf die Inkubationszeit verlängern, bis die meisten Zellen getrennt sind.
      HINWEIS: Sorgfältiges Tippen auf die Schale kann helfen, die Zellen zu vertreiben.
   2. Wenn die meisten Zellen abgetrennt sind, fügen Sie der Schale 10 ml komplettes DMEM hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles Einweg-Zentrifugenrohr von 15 ml. Zentrifugenzellen für 3 min bei 160 x g bei RT. Abstandaum aspirieren und das Zellpellet in 4 ml komplettem DMEM wieder aufsetzen.
   3. Kombinieren Sie 10 l Zellsuspension mit 10 l Trypan-Blau in einem 1,5 ml Reaktionsrohr, mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten und sorgfältig das Reaktionsrohr, und übertragen Sie Zellen zu einem Zählschlitten. Bestimmen Sie die Zellennummer/ml mithilfe eines automatisierten Zellenzählers.
   4. Verdünnen Sie C2C12-Zellen auf 50.000 Zellen/ml und säen Sie 100.000 Zellen (2 ml) pro Brunnen in einer 6-Well-Platte, um nach einer nächtlichen Inkubation einen Zusammenfluss von ca. 40 bis 50 % zu erreichen. Inkubieren Sie Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
3. Transfektion von C2C12-Zellen mit dem shRNA-Plasmid mit Polyethylenimin (PEI) und Puromycin-Auswahl
   1. Vorbereitung der PEI-Lagerlösung
      1. 16 mg PEI in 50 ml sterilem destilliertem Wasser (Konzentration der Stammlösung: 0,32 mg/ml) in einer 50 ml Glasmedienflasche mit Schraubverschluss auflösen. Inkubieren Sie die Lösung bei 65 °C für 1 h und wirbeln Sie die Lösung während der Inkubationszeit mehrmals kräftig aus, um die PEI vollständig aufzulösen.
      2. Stellen Sie sich auf pH 8 ein, indem Sie 15 l von 1N HCl pro 50 ml hinzufügen.
         VORSICHT: HCl ist ätzend. Konzentriertes HCl sollte unter der Dunstabzugshaube behandelt werden. Die Ermittler sollten geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
      3. Die PEI-Lösung bei -80 °C für 1 h mit einem locker befestigten Deckel einfrieren und bei 37 °C in einem Wasserbad schnell auftauen, um die Löslichkeit weiter zu verbessern. Wiederholen Sie den Freeze-Thaw-Zyklus 3x.
      4. Pei-Lagerlösung in 0,5 ml Aliquots für den einmaligen Einsatz bei -20 °C lagern.
   2. Transfektion von C2C12-Zellen
      1. Kombinieren Sie 25,5 l (8,5 l/g Plasmid-DNA) der PEI-Stammlösung mit 100 l von 25 mM NaCl in einem 1,5 ml Reaktionsröhrchen und inkubieren Sie 5 min bei 37 °C. Kombinieren Sie 3 g der Plasmid-DNA mit 100 l von 25 mM NaCl und inkubieren Sie für 5 min bei 37 °C.
      2. Kombinieren Sie das gesamte Volumen des verdünnten PEI-Reagenz mit dem verdünnten Plasmid und mischen Sie, indem Sie sanft nach oben und unten pipetieren. 25 min bei 37 °C inkubieren.
      3. Ändern Sie während der Inkubationszeit das Medium der C2C12-Zellen, die für die Transfektion in DMEM ohne FBS oder Antibiotika bestimmt sind.
      4. Fügen Sie die PEI/DNA-Transfektionsmischung zu C2C12-Zellen Tropfen für Tropfen hinzu und mischen Sie sie ständig, indem Sie die Zellkulturschale vorsichtig verschieben. Inkubationszentrum in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in einer 5%igen_{CO2-Atmosphäre.} Nach 6 h das Medium in DMEM umstellen.
   3. Puromycin-Auswahl
      1. 24 h nach der Transfektion, Schalten Medium auf Auswahlmedium (komplettes DMEM plus 5 g/ml Puromycin). Setzen Sie die Puromycin-Auswahl fort, bis Puromycin-resistente C2C12-Zellen erhalten sind, was in der Regel 10 bis 14 Tage dauert.
      2. Erweitern Sie puromycinresistente C2C12-Zellen bei geringer Zelldichte (<50-60%-Konfluence), d.h. um den undifferenzierten Zustand und die Kryokonservierung von 6-10 Durchstechflaschen für zukünftige Experimente beizubehalten, wie in den Schritten 2.1.4-2.1.7 beschrieben.
         ANMERKUNG: Bewahren Sie puromycinresistente C2C12-Zellen in Gegenwart von 5 g/ml Puromycin für die routinemäßige Zellkultur und -expansion auf. Puromycin wurde jedoch in den Differenzierungsexperimenten weggelassen.

3. Phänotypische Analyse der C2C12-Differenzierung

ANMERKUNG: Die nachstehend beschriebenen Methoden können leicht für die allgemeine phänotypische Analyse der Myoblastendifferenzierung c2C12 in Myotuben angepasst werden, indem die spezifischen Antikörper, die bei der westlichen Blotting verwendet werden, oder die in der quantitativen Polymerase verwendeten genspezifischen Primer variiert werden. Kettenreaktionsanalyse (qPCR).

1. C2C12 Differenzierungsprotokoll und Hellfeldmikroskopie
   1. Samen 150.000 Zellen/gut in einer 12 Well Platte. Kultur puromycinresistente C2C12-stabile Zellen in einer 12-Well-Platte in Selektionsmedium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.} Kultur C2C12-Zellen in vollständiger DMEM, bis sie einen Zusammenfluss von 95 % erreichen.
   2. Um eine Differenzierung der C2C12-Zellen zu induzieren, ersetzen Sie vollständiges DMEM durch serumfreies DMEM (Tag 0 der Differenzierung). Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage und folgen Sie der C2C12-Myotube-Formation mit einem invertierten Hellfeldmikroskop mit Kamera.
      HINWEIS: Viele Protokolle verwenden 2% Pferdeserum, um C2C12-Zellen in Myotuben zu differenzieren. In den Händen der Autoren hatte das entfernen des Serums einen ähnlichen Effekt. Insulin wird als Additiv zum Zellkulturmedium beschrieben, um die C2C12-Differenzierung zu beschleunigen. Im aktuellen Protokoll unterschieden sich C2C12-Zellen jedoch innerhalb von 3 bis 5 Tagen zuverlässig in Myotuben, nachdem Serumentzug und Insulinzusatz als unnötig erachtet wurden.
2. Myosin schwere Kette (MyHC) Immunostaining zur Visualisierung von Myotuben
   1. Samen 50.000 puromycinresistente C2C12-Zellen pro Kammer in einem 8-Well-Kammer-Dia in 500 l komplettem DMEM. Kulturzellen, bis sie 95% Zusammenfluss in vollständiger DMEM erreichen (ca. 24 h).
   2. Um eine Differenzierung zu induzieren, wechseln Sie von der vollständigen DMEM auf 500 l serumfreies DMEM (Tag 0 der Differenzierung). Zum gewünschten Zeitpunkt(en) das Medium und spülen Zellen 3x mit 0,5 ml PBS.
      HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte bei RT aus.
   3. Fixzellen mit 0,2 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min verdünnt. Spülen Sie Zellen mit 0,5 ml PBS 3x für je 5 min.
      VORSICHT: PFA ist gefährlich. Ergreifen Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen und entsorgen Sie Paraformaldehydlösung als gefährlichen Abfall.
   4. PfA mit 0,2 ml 0,5 m Glycin in PBS für 5 min. Spülen Sie Zellen mit 0,5 ml PBS 3x für je 5 min.
   5. Inkubieren Sie Zellen mit 0,2 ml 0,1% nichtionisches Tensid/Waschmittel (Materialtabelle) in PBS für 10 min, um die Zellmembran zu permeabilisieren. Block mit 0,2 ml 5% Rinderserumalbumin in PBS für 1 h. Spülzellen mit 0,5 ml PBS 3x für je 5 min.
   6. Inkubieren Sie Zellen mit 0,2 ml MyHC-Antikörper (1:200 in PBS) für 2 h. Spülen Sie Zellen mit 0,5 ml PBS 3x für je 5 min.
   7. Inkubationszellen mit 0,2 ml Ziegen-Anti-Maus-Rhodamin rotkonjugierter Sekundärantikörper (1:200 in PBS). Spülen Sie Zellen mit 0,5 ml PBS 3x für je 5 min.
   8. Nach dem Entfernen von PBS quantitativ, fügen Sie einen Tropfen Desontiermedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) pro Kammer. Abdeckungsrutsch- und Aushärtungsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers. Siegel mit Nagellack.
   9. Beobachten Sie C2C12-Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit dem entsprechenden Filtersatz.
3. Bewertung der Knockdown-Effizienz durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)
   1. Kultur C2C12-Zellen unter Differenzierungsbedingungen in 12 Brunnenplatten, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben.
   2. Zum gewünschten Zeitpunkt(en) entfernen Sie das Differenzierungsmedium, spülen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS ab und fügen Sie 0,5 ml RNA-Extraktionsreagenz (Tabelle der Materialien) pro Brunnen hinzu. Lyse die Zellen durch sorgfältiges Pipetieren nach oben und unten und übertragen Zelle Lysat in ein steriles 1,5 ml Reaktionsrohr. Isolieren Sie die RNA, indem Sie das Protokoll des Herstellers sorgfältig befolgen.
      VORSICHT: Das RNA-Extraktionsreagenz enthält Phenol. Es sollte unter einer Dunstabzugshaube verwendet werden. Sammeln Sie die RNA-Extraktionsreagenzabfälle und entsorgen Sie sie als sonderstofflichen Abfall. Die Ermittler sollten geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
   3. Lösen Sie das endgültige RNA-Pellet in 20 l Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser auf. Bestimmen Sie die Quantität und Qualität der RNA-Zubereitung mit einem Spektralphotometer und bestimmen Sie das Verhältnis A₂₆₀/A₂₈₀ als Qualitätsmaß.
      ANMERKUNG: Eine typische Ausbeute von 1 Bohrgut einer 12-Well-Platte beträgt 5 x 7 g Gesamt-RNA mit einem A₂₆₀/A_{280-Verhältnis} von 1,8 x 2.
   4. Um die mitgereinigte genomische DNA zu verdauen, verdünnen Sie 1 g RNA in einem Gesamtvolumen von 8 l DEPC-behandeltem Wasser in einer PCR-Röhre. Fügen Sie 1 l 10x Reaktionspuffer und 1 l DNase I (1 Einheit/L)(Materialtabelle)hinzu und 15 min bei RT inkubieren. 1 L Stopplösung (25 mM EDTA) hinzufügen und bei 70 °C 10 min inkubieren.
   5. Um cDNA zu erzeugen, kombinieren Sie 10 l DNase-behandelte RNA mit 10 l 2x Reverse-Transkriptase-Master-Mix, der die Reverse-Transkriptase, zufällige Primer, 4 mM dNTP-Mix (je 1 mM dATP, dTTP, dGTP und dCTP) und reverse transcriptase reaction buffer enthält. Inkubieren Sie die Reaktion in einem Thermocycler mit dem Programm, wie vom Hersteller empfohlen. CDNA mit Wasser im Verhältnis 1:5 verdünnen.
   6. Zur Vorbereitung der qRT-PCR-Reaktion können Sie 5 l SYBR-grünqPCR-Master-Mix mit 0,5 l genspezifischen Vorwärts- und Reverse-Primern (Bestand: 10 m) bzw. 2 l DEPC-behandeltem Wasser pro Reaktion kombinieren. Pipette qPCR-Reaktion in einem Brunnen einer 96-Well-qRT-PCR-Platte und fügen Sie 2 l verdünnte cDNA hinzu. Richten Sie drei technische Replikationen für jede biologische Replikation ein und enthalten ein Housekeeping-Gen wie Gapdh oder Hprt1.
   7. Verstärken Sie das PCR-Produkt mit einem qRT-PCR-Thermocycler mit folgendem Programm: 50 °C für 2 min (Uracil-DNA Glycosylase [UDG] Aktivierung), 95 °C für 2 min (Dual-Lock-DNA-Polymerase-Aktivierung), 40 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 1 min.
   8. Quantifizieren Sie qRT-PCR-Ergebnisse mit der DDCt-Methode, die auf ein Housekeeping-Gen normalisiert wird, z. B. Gapdh oder Hprt1.
4. Bewertung der Knockdown-Effizienz durch Western Blotting
   1. Samen 300.000 Puromycin-resistente C2C12-Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte für die Western-Blot-Analyse. Nach 24 h das medium in serumfreie DMEM wechseln, um eine Differenzierung einzuleiten (Tag 0 der Differenzierung).
   2. Zum gewünschten Zeitpunkt(en) zwei 1 ml serumfreies konditioniertes Medium in einem 1,5 ml Reaktionsrohr und einer Zentrifuge für 5 min bei 500 x g bei RT sammeln, um freistehende Zellen und Zellablagerungen zu entfernen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn ECM-Proteine oder andere sezernierte Proteine in konditioniertem Medium untersucht werden. Wenn das Protein von Interesse im Zytoplasma lokalisiert ist oder membrangebunden ist, saugen Sie das Zellkulturmedium an und fahren Sie mit den Zelllyseschritten fort (3.4.7-3.4.12). Die Zelllyse sollte parallel zur Proteinfällung aus dem serumfreien konditionierten Medium durchgeführt werden, um den proteolytischen Abbau und andere unbeabsichtigte Folgen einer längeren Lagerung der Zellschicht zu minimieren.
   3. Nach zentrifugieren, übertragen Sie 1 ml konditioniertes Medium in ein neues 1,5 ml Reaktionsrohr und niederschlagen Proteine durch Zugabe von 0,391 ml einer Mischung aus Trichloressigsäure (TCA) und nichtionischem Tensid/Waschmittel. Kurz wirbeln sie und brüten 10 min auf Eis.
      HINWEIS: Bereiten Sie das Protein-Fällungsgemisch direkt vor der Verwendung vor, indem Sie 0,252 ml 55% TCA und 0,139 ml von 1% nichtionischem Tensid/Waschmittel pro ml konditioniertem Medium und Wirbel kurz kombinieren. Die Lösung wird trüb.
      VORSICHT: TCA ist korrosiv und muss angemessen behandelt werden.
   4. Pellet die gefällten Proteine bei >16.000 x g für 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
      VORSICHT: Der Überstand enthält TCA und sollte separat gesammelt und als Gefahrgut entsorgt werden.
   5. Das Proteinpellet 3x mit eiskaltem Aceton und Zentrifuge jedes Mal bei >16.000 x g 10 min bei 4 °C waschen.
   6. Das Proteinpellet für 3 x 4 min bei RT lufttrocknen und in 50 l 1x Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Probenpuffer auflösen (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 6% Glycerin und 0,004% Bromphenolblau, ergänzt durch 5% Kochen Sie die Probe 5 min bei 95 °C und verwenden Sie für Western Blotting, um das gewünschte Zielprotein mit Standardverfahren zu erkennen.
      VORSICHT: Mercaptoethanol ist geruchs- und giftig und muss in einer Dunstabzugshaube behandelt werden.
   7. Für intrazelluläre und membrangebundene Proteine spülen Sie die Zellschicht einmal mit 2 ml PBS ab.
   8. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und lösen Sie Zellen, indem Sie sie mit einem Zellschaber aus dem Brunnen kratzen. Sammeln Sie Zellen in einem 1,5 ml Reaktionsrohr und Zentrifuge bei 3.420 x g für 3 min bei 4 °C. Waschen Sie das Zellpellet 3x mit 1 ml PBS und Zentrifuge bei 3.420 x g für 3 min bei 4 °C jedes Mal.
   9. Um die Zellen zu lysieren, setzen Sie das Zellpellet in 0,2 ml Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% Natriumdeoxycholat, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM-Glyzerophosphat und 1 mM Natriumorthovanadate) ergänzt durch 1x EDTA-freies Protease-Hemmer-Cocktailreagenz und Inkubat für 30 min auf Eis.
   10. Ultraschall für 15 s auf Eis mit einer Ausgangseinstellung von 10 bei einer Betriebsfrequenz von 23 kHz.
   11. Zellablagerungen durch Zentrifugation bei 13.680 x g für 20 min bei 4 °C entfernen. Sammeln Sie Überstand in einem neuen 1,5 ml Reaktionsröhrchen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem kommerziellen Bradford-Assay oder einer anderen geeigneten Methode.
   12. Kombinieren Sie für jede Probe 100 g Protein mit einem 5x SDS-PAGE-Probenpuffer in einem Gesamtvolumen von 60 l und kochen Sie 5 min bei 95 °C. Analysieren Sie Proben nach standardmäßigen Westlichen Blotting-Verfahren für das Vorhandensein des gewünschten Zielproteins.

Ergebnisse

Die Auswahl von puromycinresistentem C2C12 kann in 10 bis 14 Tagen nach der Transfektion durch effiziente Eliminierung nicht resistenter, d.h. untransfizierter Zellen erreicht werden (Abbildung 1B). In der Regel lösen sich mehr als 80 % der Zellen von der Zellkulturschale und diese Zellen werden während der routinemäßigen Zellerhaltung entfernt. Puromycin-resistente C2C12-Zellen, die die Kontroll-schRNA exzellent, behalten die Spindelform, die längsförmige Zellmorpholo...

Diskussion

Wir beschreiben hier ein Protokoll für den stabilen Abbau von ECM-Proteinen in C2C12-Myoblasten und für die phänotypische Analyse der Differenzierung von C2C12-Myoblasten in Myotuben. Mehrere Faktoren bestimmen das Ergebnis des Experiments und müssen sorgfältig geprüft werden. Die Aufrechterhaltung von C2C12-Zellen in der Vermehrungsphase ist ein entscheidender Schritt, um die C2C12-Zellen im Myoblast-Vorläuferzustand zu halten. Die Beibehaltung der Fähigkeit von C2C12-Zellen, sich konsequent in Myotuben zu diffe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	191784
Agar	Fisher Bioreagents	BP1423
Ampicillin	Fisher Bioreagents	BP1760-5
Automated cell counter Countesse II	Invitrogen	A27977
Bradford Reagent	Thermo Scientific	P4205987
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772
Chamber slides	Invitrogen	C10283
Chloroform	Fisher Chemical	183172
DMEM	GIBCO	11965-092
DMSO	Fisher Bioreagents	BP231-100
DNase I (Amplification Grade)	Invitrogen	18068015
Fetal bovine serum	VWR	97068-085
GAPDH	EMD Millipore	MAB374
Glycine	VWR Life Sciences	19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW)	Li-Cor	C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red)	Jackson Immune Research	133389
HCl	Fisher Chemical	A144S
Incubator (Shaker)	Denville Scientific Corporation	1704N205BC105
Mercaptoethanol	Amresco, VWR Life Sciences	2707C122
Midiprep plasmid extraction kit	Qiagen	12643
Myosin 4 (myosin heavy chain)	Invitrogen	14-6503-82
Mounting medium	Invitrogen	2086310
NaCl	VWR Life Sciences	241
non-ionic surfactant/detergent	VWR Life Sciences	18D1856500
Paraformaldehyde	MP	199983
PBS	Fisher Bioreagents	BP399-4
PEI	Polysciences	23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics	GIBCO	15140-122
Petridishes	Corning	353003
Polypropylene tubes	Fisherbrand	149569C
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	33576300
Puromycin	Fisher Scientific	BP2956100
PCR (Real Time)	Applied Biosystems	4359284
Reaction tubes	Eppendorf	22364111
Reverse Transcription Master Mix	Applied Biosystems	4368814
RIPA buffer	Thermo Scientific	TK274910
sh control plasmid	Sigma-Aldrich	07201820MN
sh 3086 plasmid	Sigma-Aldrich	TRCN0000092578
sh 972 plasmid	Sigma-Aldrich	TRCN0000092579
sh 1977 plasmid	Sigma-Aldrich	TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop)	Thermo Scientific	NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix	Applied Biosystems	743566
Trichloroacetic acid	Acros Organics	30145369
Trizol reagent	Ambion	254707
Trypan blue	GIBCO	15250-061
Tryptone	Fisher Bioreagents	BP1421
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco-Life Technology Corporation	2085459
Water (DEPC treated and nuclease free)	Fisher Bioreagents	186163
Western blotting apparatus	Biorad	Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract	Fisher Bioreagents	BP1422