Hirntodinduktion bei Mäusen mit intraarterieller Blutdrucküberwachung und -beatmung mittels Tracheostomie

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein murines Modell der Hirntodinduktion, um den Einfluss seiner pathophysiologischen Wirkungen auf Organe sowie auf konsekutive Transplantate im Kontext einer soliden Organtransplantation zu bewerten.

Zusammenfassung

Während sowohl die lebende Spende als auch die Spende nach dem Kreislauftod alternative Möglichkeiten für eine Organtransplantation bieten, stellt die Spende nach dem Hirntod (BD) nach wie vor die Hauptquelle für feste Transplantationen dar. Leider ist der irreversible Verlust der Gehirnfunktion bekannt, mehrere pathophysiologische Veränderungen zu induzieren, einschließlich hämodynamischer sowie hormoneller Veränderungen, die schließlich zu einer systemischen Entzündungsreaktion führen. Modelle, die eine systematische Untersuchung dieser Effekte in vivo ermöglichen, sind rar. Wir präsentieren ein murines Modell der BD-Induktion, das Untersuchungen über die verheerenden Auswirkungen von BD auf die Allograft-Qualität unterstützen könnte. Nach der Durchführung der intraarteriellen Blutdruckmessung über die gemeinsame Karotisarterie und der zuverlässigen Beatmung über eine Tracheostomie wird BD durch stetig steigenden intrakraniellen Druck mit einem Ballonkatheter induziert. Vier Stunden nach der BD-Induktion können Organe zur Analyse oder für weitere Transplantationsverfahren geerntet werden. Unsere Strategie ermöglicht die umfassende Analyse von Spender-BD in einem murinen Modell, wodurch ein vertieftes Verständnis der BD-bezogenen Effekte bei der Festorgantransplantation ermöglicht und potenziell der Weg zu einer optimierten Organvorkonditionierung geebnet wird.

Einleitung

Die Transplantation ist derzeit die einzige heilende Behandlung für Organversagen im Endstadium. Bisher waren Patienten mit Hirntod (BD) die Hauptquelle für Organspenden, obwohl lebende Spende und Spende nach Kreislauftod wertvolle Alternativen sind¹. BD wird durch ein irreversibles Koma (mit einer bekannten Ursache), das Fehlen von Hirnstammreflexen und Apnoe²definiert. Leider zeigen BD-Organe minderwertige Ergebnisse im langfristigen Transplantatüberleben unabhängig von humanem Leukozyten-Antigen (HLA)-Missverhältnis und kalter ischämischer Zeit³. In der Zwischenzeit wurde intensive Forschung an diesem antigenunabhängigen Risikofaktor durchgeführt, was zu drei Hauptaspekten pathophysiologischer Veränderungen führte, die als Folge von BD vermittelt wurden: hämodynamisch, hormonell und entzündlich⁴.

Bis heute wurden experimentelle BD-Modelle bei Nagetieren hauptsächlich mit Ratten durchgeführt. Um einen besseren Einblick in die immunologischen Folgen fester Organe nach BD zu gewinnen, wollten wir ein murines BD-Modell etablieren, da derzeit nur Mausmodelle umfassende Untersuchungen genetischer oder immunologischer Faktoren ermöglichen. In diesem Zusammenhang bietet das Maussystem eine größere Auswahl an Analysewerkzeugen.

Das hier beschriebene Prinzip der BD-Induktion basiert auf einer Erhöhung des intrakraniellen Drucks, der durch die Inflation eines ballonkatheter unter dem Schädel eingesetzten Ballonkatheters induziert wird. Erhöhter intrakranieller Druck imitiert den physiologischen Mechanismus von BD, indem er die Perfusion des Großhirns, Kleinhirns und des Hirnstamms^5,6blockiert. Um eine ausreichende Durchblutung der peripheren Organe zu gewährleisten, ist die Blutdruckmessung während des Eingriffs obligatorisch. Der zu diesem Zweck verwendete Katheter dient gleichzeitig der Kochlinie, um den Blutdruck durch Flüssigkeitssubstitution zu stabilisieren. Da BD mit der Einstellung der spontanen Atmung einhergeht, muss eine ausreichende Beatmung gewährleistet sein. Eine elektrische Decke hält die physiologische Körperkörpertemperatur aufrecht.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell eingehende Studien über den Einfluss von BD-induzierten Verletzungen, auf Leukozytenmigration⁷, Komplimentaktivierung⁸, ischämische Reperfusionsverletzung⁹und andere Faktoren ermöglichen wird.

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Protokoll

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Labortierpflege durchgeführt, die von der National Society for Medical Research und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von der National Academy of Science erstellt und von den National Institutes of Health veröffentlicht wurden (NIH-Publikation Nr. 86-23, überarbeitet 1985). Alle Experimente wurden vom österreichischen Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur genehmigt (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).

1. Arterielle Katheterisierung

1. Anästhetisieren Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin und Xylazin¹⁰ und einem Schmerzmittel nach lokaler Praxis (z.B. Buprenorphin).  Kneifen Sie die Hinterbeine mit Zangen, um die richtige Tiefe der Anästhesie zu bestätigen.
   HINWEIS: Für diese Studie wurden männliche C57BL/6N-Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen verwendet (Gewicht 20 bis 25 g). Die Autoren haben männliche BALB/c des gleichen Alters erfolglos getestet, aber keine anderen Stämme ausprobiert (siehe Diskussion).
2. Entfernen Sie das Haar in den Bereichen von Interesse (Kopf, Hals) mit einem elektrischen Rasiermesser. Stellen Sie sicher, dass kein loses Haar übrig bleibt, um eine Wundkontamination zu verhindern. Anschließend desinfizieren Sie das Operationsfeld mit 70% Ethanol/Chlorhexidin/Betadin und legen Sie die Maussupine mit dem Kopf zum Chirurgen.
3. Machen Sie einen zervikalen Mittellinienschnitt mit einer Sezierenderschere.
4. Sezieren Sie die submandibulären Drüsen und Halsmuskelgewebe und trennen Sie sie, um die gemeinsame Halsschlagader freizulegen. Verwenden Sie meist stumpfe Sezierung über Zangen.
5. Platz drei 8-0 Seidenligaturen unter der rechten gemeinsamen Halsschlagader.
6. Legen Sie eine Klemme auf die proximale Ligatur und bringen Sie Spannung in die Arterie, so dass der Fluss aufgehängt wird.
7. Schließen Sie die distale Ligatur.
8. Setzen Sie den arteriellen Katheter durch ein kleines, vorgeformtes Hautloch auf den Schädelaspekt des Einschnitts. Drücken und verformen Sie das Lumen des Katheters, wenn es zu groß erscheint, um den Blutrückfluss zu reduzieren. Fixieren Sie mit allen drei Ligaturen.
9. Fixieren Sie den Katheter auf die Haut, um Verwerfungen zu vermeiden. Dazu eine Naht (z.B. 5-0 Monofilament, nicht resorbierbar), die den Katheter im Bereich des vorgeformten Hautlochs mit der Haut verbindet.

2. Tracheostomie

1. Sezieren Sie die vortracheale Muskulatur unverblümt mit Zangen.
2. Platz zwei 8-0 Seidenligaturen unter der Luftröhre.
3. Tracheotomisieren Sie mit Mikroschere so proximal wie möglich, um einseitige Belüftung zu vermeiden. Verwenden Sie eine horizontale Schnittlinie zwischen zwei Trachealknorpeln.
4. Legen Sie das Lüftungsrohr ein und fixieren Sie es mit beiden vorbereiteten Ligaturen.
   HINWEIS: Das proximale Ende der Luftröhre muss nicht geligiert werden.
5. Schließen Sie die Haut mit einer laufenden Naht (z.B. 6-0 Monofilament, nicht resorbierbar).
6. Belüften Sie die Maus mit einer Frequenz von 150/min und einem Gezeitenvolumen von 200 l.

3. Hirntodinduktion

1. Ordnen Sie die Maus an die anfällige Position an.
2. Entfernen Sie die Haut aus dem Schädel mit chirurgischer Schere und Zange, um die Haut zu halten.
3. Bohren Sie ein 1 mm Kaliber Bohrung paramedial über dem linken parietalen Kortex. Beenden Sie das Bohren, bevor Sie den inneren kompakten Knochen und den Dura mater durchbrechen.
4. Durchdringen Sie die letzte Gewebebrücke des Schädels mit stumpfer Zange und entfernen Sie scharfe Kanten.
5. Setzen Sie den Ballonkatheter ein, so dass er vollständig in der Schädelhöhle liegt. Stellen Sie sicher, dass der Ballon mit Einer Linie vorgefüllt ist und die gesamte Luft evakuiert wird.
6. Beginnen Sie die Inflation mit hilfe einer Spritzenpumpe bei 0,1 ml/min über einen Zeitraum von 10 bis 15 min (Gesamtvolumen von 0,8 bis 1,2 ml).
   HINWEIS: Die Maus wird Myoklonus, Mydriasis, weitere Anfallsaktivität und agonale Gase zeigen.
7. Aussprechen Sie das Maushirn tot, sobald der Schwanz der Maus steif geworden ist und errichtet.
   HINWEIS: BD wird durch eine charakteristische anfängliche Blutdruckspitze (Cushing Reflex), das Fehlen von Hirnstammreflexen und spontane Atmung bestätigt. Regelmäßige Apnoetests sollten während der Experimente vermieden werden, da Mäuse aufgrund eines Sauerstoffmangels kreislaufinstabil werden können.
8. Stoppen Sie die Inflation des Ballonkatheters.
9. Legen Sie eine Heizdecke über die Maus, um Unterkühlung zu vermeiden.

4. Während der BD-Periode

1. Überwachen und dokumentieren Sie den Blutdruck regelmäßig. Auszuschließen Mäuse mit einer längeren hypotensiven Phase (mittlerer arterieller Druck [MAP] < 50 mmHg für >30 min).
2. Infuse 0,1 ml Kochchen alle 30 min, um den Blutdruck der Maus zu stabilisieren.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden jeder Maus insgesamt 0,8 ml Saline verabreicht.
3. Nach 4 h BD-Dauer Mausorgane/-gewebe ernten. Schließen Sie die Maus aus dem Experiment aus, wenn das Herz der Maus am Ende des Experiments nicht schlägt.

5. Scheinverfahren

1. Führen Sie die Schritte 1.1-3.3 aus.
   HINWEIS: Öffnen Sie den inneren kompakten Knochen nicht. Fügen Sie keinen Ballonkatheter ein oder aufblasen.
2. Bleiben Sie in der Nähe der Maus und beobachten Sie kontinuierlich das Tier. Immer wieder die Hinterbeine mit Zangen kneifen, um die richtige Tiefe der Anästhesie zu bestätigen. Tragen Sie zusätzliche Anästhesie subkutan auf (ca. 1/2 der Anfangsdosis), wenn die Maus Anzeichen des Erwachens zeigt, was unserer Erfahrung nach etwa nach 2 x 3 h nach der Anästhesie geschieht.
3. Tragen Sie die gleiche Menge an intravenöser Saline wie bei den BD-Mäusen auf.
   HINWEIS: Die Scheinmaus wird nach Beendigung der Beatmung wieder spontane Atmung. Die BD-Maus wird dies nicht tun. Apnoe-Tests sollten während der Erstellung des Modells durchgeführt werden, aber während der Experimente sollte es aufgrund unnötiger physiologischer Belastung vermieden werden.

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Ergebnisse

Das murine BD-Modell wurde mehr als 100 Mal mit einer Erfolgsrate von über 90% erfolgreich durchgeführt. Zusätzlich wurde eine postinterventionelle Organtransplantation von Herz und Niere sicher durchgeführt⁷.

BD induziert eine Vielzahl pathophysiologischer Veränderungen, die mit diesem Modell weiter untersucht werden können. Wie in Abbildung 1dargestellt, zeigt der Blu...

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Diskussion

BD, ein Risikofaktor für Allograft-Qualität bei Multiorganspendern, bringt eine Fülle pathophysiologischer Veränderungen mit sich, die nur mit In-vivo-Modellen ausreichend bewertet werden können. Hämodynamische Veränderungen, Zytokinsturm, hormonelle Veränderungen und ihre letztendliche Auswirkung auf die Qualität und das Überleben von Organtransplantaten können nicht in vitro analysiert werden⁴. Der Großteil der Basistransplantationen sowie der immunologischen Forschung ist von ausgek...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arterial catheter (BD Neoflon 26G)	BD	391349
Blood Pressure Transducers (APT300)	Harvard Apparatus Inc.	73-3862
Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3	Edwards Lifesciences Corporation	120403F
Forceps	FST	11271-30
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus Inc.	55-7020
Ketansol	Graeub	6680110
Micro scissor	FST	15018-10
Needle holder	FST	12060-02
Prolene 5-0	Ethicon	8698H
Pump 11 Elite Infusion Only Single	Harvard Apparatus Inc.	70-4500
Scissor	FST	14075-11
Stereotactic microscope	Olympus	SZX7
Transpore Tape	3M	1527-1
Underpads	Molinea.A	274301
Ventilator for mice (MiniVent Model 845)	Harvard Apparatus Inc.	73-0043
Xylasol	Graeub	7630109