Synthese funktionalisierter magnetischer Nanopartikel, deren Konjugation mit dem Siderophor Feroxamin und deren Bewertung für den Bakteriennachweis

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt Protokolle für die Herstellung von magnetischen Nanopartikeln, seine Beschichtung mit SiO₂, gefolgt von seiner Aminfunktionalisierung mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und seiner Konjugation mit Deferoxamin unter Verwendung eines Succinylmoiety als Linker. Eine tiefe strukturelle Charakterisierungsbeschreibung und ein Aufnahmebakterientest mit Y. enterocolitica für alle Zwischen-Nanopartikel und das endliche Konjugat werden ebenfalls ausführlich beschrieben.

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit werden die Synthese von magnetischen Nanopartikeln, ihre Beschichtung mit SiO₂, gefolgt von ihrer Aminfunktionalisierung mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und ihre Konjugation mit Deferoxamin, einem von Yersinia enterocoliticaerkannten Siderophor, mit einem Succinyl-Moiety als Linker beschrieben.

Magnetische Nanopartikel (MNP) von Magnetit (Fe₃O₄) wurden nach solvothermaler Methode hergestellt und mit SiO₂ (MNP@SiO₂) nach dem Stöber-Verfahren beschichtet, gefolgt von der Funktionalisierung mit APTES (MNP@SiO₂@NH₂). Dann wurde Feroxamin mit dem MNP@SiO₂@NH₂ durch Carbodiimid-Kupplung konjugiert, um MNP@SiO₂@NH₂@Fa zu geben. Die Morphologie und eigenschaften der Konjugat- und Zwischenprodukte wurden mit acht verschiedenen Methoden untersucht, darunter Pulver-Röntgenbeugung (XRD), Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR), Raman-Spektroskopie, Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und energiedispersive S-Ray-Mapping (EDX). Diese erschöpfende Charakterisierung bestätigte die Bildung des Konjugats. Schließlich, um die Kapazität und Spezifität der Nanopartikel zu bewerten, wurden sie in einem Capture-Bakterien-Assay mit Yersinia enterocoliticagetestet.

Einleitung

Die Methoden zum Nachweis von Bakterien mit MNP basieren auf der molekularen Erkennung von Antikörpern, Aptamen, Bioproteinen, Kohlenhydraten, die von den pathogenen Bakterien 1 mit MNP konjugiert^werden. Unter Berücksichtigung, dass Siderophore von bestimmten Rezeptoren auf der äußeren Membran von Bakterien erkannt werden, könnten sie auch mit MNP verbunden werden, um ihre Spezifität zu erhöhen². Siderophore sind kleine organische Moleküle, die an der Fe^3+-Aufnahme durch Bakterien beteiligt sind^3,4. Die Herstellung von Konjugaten zwischen Siderophoren und MNP zusammen mit ihrer Bewertung für die Abscheidung und Isolierung von Bakterien wurde noch nicht berichtet.

Einer der entscheidenden Schritte bei der Synthese von Konjugaten magnetischer Nanopartikel mit kleinen Molekülen ist die Auswahl der Art der Bindung oder Interaktion zwischen ihnen, um sicherzustellen, dass das kleine Molekül an der Oberfläche des MNP befestigt wird. Aus diesem Grund konzentrierte sich das Verfahren zur Herstellung des Konjugats zwischen magnetischen Nanopartikeln und Feroxamin – dem von Yersinia enterocoliticaerkannten Siderophor – auf die Erzeugung einer veränderbaren Oberfläche des MNP, um es durch Carbodiimidchemie kovalent mit dem Siderophor zu verbinden. Um ein gleichmäßiges Magnetit-Nanopartikel (MNP) zu erhalten und die Keimbildung und Größenkontrolle zu verbessern, wurde in einem thermischen Block eine Solvolyse-Reaktion mit Benzylalkohol ohne Schütteln⁵durchgeführt. Dann wurde mit der Stöber-Methode eine Kieselsäurebeschichtung erzeugt, um Schutz zu gewähren und die Stabilität der Nanopartikelsuspension in wässrigen Medien zu verbessern⁶. Unter Berücksichtigung der Struktur des Feroxamins ist die Einführung von Amingruppen notwendig, um geeignete Nanopartikel (MNP@SiO₂@NH₂) herzustellen, die mit dem Siderophor konjugiert werden. Dies wurde durch Kondensation von (3-Aminopropyl)Triethoxysilan (APTES) mit den auf der Oberfläche der Kieselsäure modifizierten Nanopartikel (MNP@SiO₂) mit einer Sol-Gel-Methode⁷erreicht.

Parallel dazu wurde der Feroxamin-Eisen(III)-Komplex durch Komplexierung des handelsüblichen Deferoxamins mit Eisenacetylaceton in wässriger Lösung hergestellt. NN-Succinylferoxamin, tragende Succinylgruppen, die als Linker fungieren, wurde durch die Reaktion von Feroxamin mit Bernsteinanhydrid erhalten.

Die Konjugation zwischen MNP@SiO₂@NH₂ und N-Succinylferoxamin, um MNP@SiO₂@NH_fazu geben, wurde durch Carbodiimid-Chemie unter Verwendung von Kupplungsreagenzien benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (di Methylamino)-Phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) in einem weichen Basismedium zur Aktivierung der Terminalsäuregruppe in N-Succinylferoxamin⁸. N

Nachdem die MNPs charakterisiert wurden, bewerteten wir die Fähigkeiten von nackten und funktionalisierten magnetischen Nanopartikeln zur Erfassung des Wildtyps (WC-A) und eines Mutanten von Y. enterocolitica ohne Feroxaminrezeptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Plain MNPs, funktionalisierte MNPs und das Konjugat MNP@SiO₂@NH_Fadurften mit jedem Y. enterocolitica Stamm interagieren. Die Bakterien-Konjugat-Aggregate wurden durch die Anwendung eines Magnetfeldes von der Bakteriensuspension getrennt. Die getrennten Aggregate wurden zweimal mit Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) abgetrennt, in PBS wieder aufgehängt, um serielle Verdünnungen vorzubereiten, und dann wurden sie für die Koloniezählung plattiert. Dieses Protokoll zeigt jeden Schritt der Synthese von MNP@SiO₂@NH@Fa, die strukturelle Charakterisierung aller Zwischenprodukte und des Konjugats und einen Bakterium-Capture-Assay als einfache Möglichkeit, die Spezifität des Konjugats in Bezug auf die Zwischenprodukte zu bewerten. ⁹

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Protokoll

HINWEIS: Für die Reaktionen, die unter inerten Atmosphärenbedingungen durchgeführt wurden, wurden alle Glaswaren zuvor in einem Ofen bei 65 °C getrocknet, mit einem Gummiseptum versiegelt und dreimal mit Argon gereinigt.

1. Synthese von magnetischen Nanopartikeln konjugiert mit Feroxamin

1. Synthese von Fe₃O₄ magnetischen Nanopartikeln (MNPs)
   1. 0,5 g Fe(acac)₃ in eine 20 ml Glasdurchstechflasche geben und dann mit 10 ml Benzylalkohol vermischen.
   2. Beschallen Sie diese Mischung für 2 min, dann auf einen Heizblock übertragen und bei 180 °C für 72 h erhitzen.
   3. Nach Abschluss der Reaktion die Fläschchen abkühlen lassen, die Nanopartikel mit 96% Ethanol und Zentrifuge bei 4000 x g 30 min abspülen.
   4. Trennen Sie die Nanopartikel durch magnetische Anziehung mit einem Neodym -Magneten (NdFeB) vom Überstand und entsorgen Sie das Restlösungsmittel.
   5. Spülen Sie mit 96% Ethanol wiederholenSchritt 1.1.4. und entsorgen Sie den Überstand abwechselnd mit Beschallung in einem Bad für 1 min bei 40 kHz, bis das Lösungsmittel klar aussieht.
2. Magnetische Nanopartikel SiO₂ Beschichtung (MNP@SiO₂)
   1. Bereiten Sie eine Suspension von 2 g MNP in 80 ml Isopropanol vor und fügen Sie dann 4 ml 21% Ammoniak, 7,5 ml destilliertes Wasser und 0,56 ml Tetraethylorthosilikat (TEOS) (in dieser Reihenfolge) in einem runden Bodenkolben mit einem magnetischen Rührstab hinzu.
   2. Die Mischung bei 40 °C für 2 h unter kontinuierlichem Rühren erhitzen und dann 1 h beschallen.
   3. Trennen Sie die MNP mit einem Magneten, entsorgen Sie den Überstand und dispergieren Sie ihn in 30 ml Isopropanol.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1. und 1.2.2.
   5. Entfernen und waschen Sie die magnetische Rührstange mit 96% Ethanol, um das gesamte Material zurückzugewinnen.
   6. Trennen Sie die Nanopartikel vom Überstand durch magnetische Anziehung mit einem Magneten.
   7. Entsorgen Sie den Überstand und spülen Sie die Nanopartikel mit 96% Ethanol dreimal abwechselnd mit Beschallung ab.
   8. Trocknen Sie die Nanopartikel unter Vakuum bei Raumtemperatur für 12 h.
3. Funktionalisierung von MNP@SiO₂ mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES)
   1. Spülen Sie 500 mg des MNP@SiO₂ aus dem vorherigen Schritt mit N,N-Dimethylformamid (DMF) unter inerte Atmosphäre erhalten und dann für 1 min bei 40 kHz beschallen. Entsorgen Sie dann den Überstand und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
   2. Die Partikel unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in einem runden Bodenkolben wieder aufhängen und 9 ml APTES hinzufügen.
   3. Die Mischung bei 60 °C 12 h rühren.
   4. Entsorgen Sie den Überstand und spülen Sie die Nanopartikel mit 96% Ethanol dreimal abwechselnd mit Beschallung ab.
4. Synthese von Feroxamin
   1. 100 mg (0,15 mmol) Deferoxamin-Mesylatsalz und 53,0 mg (0,15 mmol) Fe(acac)₃ in 5 ml destilliertem Wasser auflösen und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur rühren.
   2. Waschen Sie das resultierende Produkt dreimal mit 20 ml EtOAc in einem Trenntrichter und entfernen Sie dann das organische Lösungsmittel unter Vakuum mit einem Rotatorverdampfer.
   3. Gefriertrocknen Sie die wässrige Phase, um sich Feroxamin als roten Feststoff zu leisten.
5. Synthese Nvon N-Succinylferoxamin
   1. Fügen Sie 350 mg (3,50 mmol) Bernsteinanhydrid zu einer Lösung von 100 mg (0,17 mmol) Feroxamin in 5 ml Pyridin in einem 50 ml runden Bodenkolben unter inerter Atmosphäre hinzu.
   2. Die resultierende Mischung bei Raumtemperatur 16 h rühren. Nach dieser Zeit entfernen Sie den Überschuss von Pyridin unter reduziertem Druck in einem rotatorischen Verdampfer, um einen dunkelroten Feststoff zu erhalten.
   3. Lösen Sie die Reaktion roh in 3 ml Methanol.
   4. Die Methanollösung in eine Sephadex-Säule (20 cm Sephadex in einer 20 mm Durchmesser-Säule) geben und bei 0,5 ml/min elute.
   5. Sammeln Sie die rote Fraktion und entfernen Sie das Methanol unter Vakuum mit einem rotatorischen Verdampfer.
6. Synthese des Konjugats MNP@SiO₂@NH@Fa
   1. Spülen Sie 30 mg trockene MNP@SiO₂@NH₂ zweimal mit DMF und beschallen Sie die Nanopartikel in einem 100 ml Erlenmeyer Kolben für 30 min unter inerer Atmosphäre.
   2. Herstellung einer Lösung von N-Succinylferoxamin (200 mg, 0,30 mmol), Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphat (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin(DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) in 10 ml DMF (Mix A) in einem 50 ml Rundkolben unter inerter Atmosphäre. N
   3. Die zuvor MNP@SiO₂@NH₂ in 3 ml DMF unter Beschallung unter trockenen Bedingungen unter sauerstofffreien Bedingungen unter Einer Argongasatmosphäre (Mix B) aussetzen.
   4. Fügen Sie Mix A hinzu, um B dropwise zu mischen.
   5. Schütteln Sie die endgültige Mischung mit einem Orbital-Shaker bei Raumtemperatur über Nacht.
   6. Trennen Sie das resultierende Konjugat (MNP@SiO₂@NH@Fa) von der Suspension mit einem Magneten.
   7. Spülen Sie den resultierenden Feststoff und beschallen Sie ihn dann fünfmal mit 10 ml Ethanol.
   8. Trocknen Sie den Feststoff unter Vakuum für 24 h.

2. Bakterielle Assay mit Y. enterocolitica Stämmen, um den Abfang von pathogenen Bakterien mit Nanopartikeln zu quantifizieren

1. Bereiten Sie eine Suspension aller Zwischen-Nanopartikel und des Endkonjugats in PBS bei 1 mg/ml in sterilen 2 ml-Röhrchen vor.
2. Bereiten Sie eine Kultur von Y. enterocolitica in 5 ml Luria Bertani (LB) Brühe über Nacht Inkubation bei 37 °C.
3. Bereiten Sie eine 5 ml Eisenmangel tryptische Sojabrühe (TSB) durch Zugabe von 50 l von 10 mM 2,2-bipyridyl.
4. Die 5 ml Eisenmangel TSB mit 50 l der Nachtkultur von Y. enterocolitica impfen und dann bei 37 °C mit Rührung inkubieren, bis eine OD₆₀₀ = 0,5-u20120.8 erreicht ist.
5. Nehmen Sie 100 l der in Schritt 2.4 erhaltenen Kultur und verdünnen Sie sie in einem 2,0 ml-Rohr mit 900 l PBS, um eine erste Verdünnung von 1/10 zu erhalten. Bereiten Sie dann eine Verdünnung von 1/100 aus der ersten Verdünnung mit dem gleichen Verfahren vor, um eine Konzentration von Bakterienzellen bei 1 x 10⁶ Colony Forming Units (CFU)/ml ungefähr zu erhalten.
6. Fügen Sie 100 l Nanopartikel Suspension bei 1 mg/ml bis 1 ml der 1/100 Verdünnung der bakteriellen Suspension in einem 2,0 ml Rohr hinzu und homogenisieren mit Wirbel.
7. Die Kultur bei 20 °C für 1 h inkubieren.
8. Trennen Sie die MNP/Bakterienaggregate mit einem Magneten und entsorgen Sie den Überstand sorgfältig.
9. Spülen Sie die abgetrennten Nanopartikel zweimal mit 1 ml PBS mit einem Wirbel.
10. Setzen Sie die Nanopartikel in 1 ml PBS aus, um die Menge der bakteriellen Erfassung in CFU/ml zu zählen.
11. Bereiten Sie vier aufeinanderfolgende 1/10 Verdünnungen von der früheren Suspension vor, bis eine Verdünnung von 1 x 10^-4 erreicht ist.
12. Platte 10 l jeder Verdünnung auf TS-Agarplatten und inkubieren Sie sie bei 37 °C über Nacht.
13. Fotografieren Sie die Platte mit einem Gel-Digitalisierer im Epi-White-Modus. Verarbeiten Sie das Bild mit einer geeigneten Software, um einen Punkt zu verstärken, um die Anzahl der einzelnen Kolonien zu zählen.
    HINWEIS: Jedes MNP-Zwischenprodukt wurde charakterisiert, um den Fortschritt der Synthese zu verfolgen. Erstens wurden nackte MNPs von XRD untersucht, um die kristalline Struktur zu überprüfen. Dann wurde das FT-IR-Spektrum jedes Zwischenprodukts ausgeführt, um die Änderungen zu überprüfen, die in der entsprechenden Reaktion aufgetreten sind. Raman-Spektroskopie-Analyse jedes Zwischenprodukts wurde auch durchgeführt, um die Schlussfolgerungen aus FT-IR-Spektren abgeleitet zu bestätigen. Die TGA-Analyse ermöglichte es uns, das Verlustgewicht der Zwischenprodukte mit organischem Material in seiner Struktur abzuschätzen. Die Morphologie und Größe jedes Zwischenprodukts wurde von TEM untersucht. Schließlich war die XPS-Analyse entscheidend, um die Atomoxidationszustände an jeder MNP-Zwischenoberfläche zu bestimmen und die kovalente Bindungsbildung im Konjugat MNP@SiO₂@NH@Fa zu bestätigen.

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Ergebnisse

Eine erschöpfende strukturelle Charakterisierung wird durchgeführt, um die Morphologie und die Eigenschaften jedes Zwischen- und Endkonjugats zu bestimmen. Zu diesem Zweck werden die Techniken XRD, FT-IR, Raman Spektroskopie, TGA, TEM, EDX Mapping und XPS eingesetzt, um die Bildung des Konjugats zu demonstrieren. Die Oxidationszustände der Atome an der Oberfläche der nanopartikel, die durch Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) erworben wurden, sind die relevantesten Daten, um die Bildung kovalenter Bindungen zw...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese eines Konjugats zwischen magnetischen Nanopartikeln und dem Siderophor feroxamin durch kovalente Bindung. Die Synthese von Magnetit wurde mit dem von Pinna et al.⁵ gemeldeten Protokoll durchgeführt, gefolgt von einer Kieselsäurebeschichtung, um den magnetischen Korrosionskern in wässrigen Systemen zu schützen, die Aggregation zu minimieren und eine geeignete Oberfläche für die Funktionalisierung^{bereitzustellen 6}. Das Kieselsäu...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578