Verwendung von mehrschichtigem Hydrogel Bioink im dreidimensionalen Bioprinting für homogene Zellverteilung

Zusammenfassung

Hier haben wir eine neuartige mehrschichtige modifizierte Strategie für flüssigkeitsähnliche Bioinken (Gelatinemethacryloyl mit niedriger Viskosität) entwickelt, um die Sedimentation von verkapselten Zellen zu verhindern.

Zusammenfassung

Während des extrusionsbasierten dreidimensionalen Bioprinting-Prozesses können flüssigkeitsähnliche Bioinken mit geringer Viskosität Zellen vor Membranschäden schützen, die durch Scherspannung verursacht werden, und das Überleben der verkapselten Zellen verbessern. Eine schnelle gravitationsgetriebene Zellsedimentation im Reservoir könnte jedoch zu einer inhomogenen Zellverteilung in biobedruckten Strukturen führen und somit die Anwendung flüssigkeitsähnlicher Bioinks behindern. Hier haben wir eine neuartige mehrschichtige modifizierte Strategie für flüssigkeitsähnliche Bioinken (z.B. Gelatinemethacryloyl mit niedriger Viskosität) entwickelt, um die Sedimentation verkapselter Zellen zu verhindern. Mehrere flüssigkeitsnahe Schnittstellen wurden im vielschichtigen Bioink manipuliert, um die Grenzflächenretention zu gewährleisten. Folglich wurde die Zellsedimentationswirkung, die sich über benachbarte Schichten im mehrschichtigen System erstreckte, im Bioinkreservoir verzögert. Es wurde festgestellt, dass die Grenzflächenretention viel höher war als die Sedimentzugvon Zellen, was eine entscheidende Rolle der Grenzflächenretention bei der Verhinderung von Zellsedimentation und der Förderung einer homogeneren Dispersion von Zellen im vielschichtigen Bioink zeigt.

Einleitung

Der dreidimensionale (3D) Bioprinting war eine vielversprechende Methode zur Herstellung komplexer architektonischer und funktioneller Nachbildungen von nativen Geweben in der Biofabrikation und regenerativen Medizin^1,2,3. Die gängigen Strategien des Bioprintings, einschließlich Inkjet-, Extrusions- und Stereolithographiedruck, haben Vor- und Nachteile aus verschiedenen Perspektiven⁴. Unter diesen Techniken wird das Extrusionsverfahren aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit am häufigsten verwendet. Bioink spielt eine Schlüsselrolle bei der Prozessstabilität des Extrusionsbioprintings. Der ideale zellbeladene Bioink sollte nicht nur biokompatibel, sondern auch für mechanische^{Eigenschaften}5 geeignet sein. Bioinks mit niedriger Viskosität werden in der Regel als flüssigkeitsähnlicher Zustand dargestellt. Diese Bioinks können einfach und schnell abgelagert werden und zellmembranbedingte Schäden vermeiden, die durch hohe Scherspannung während der Extrusion verursacht werden. In komplexen Fällen, die langfristige Druckzeiten erfordern, führt jedoch eine niedrige Viskosität häufig zur unvermeidlichen Sedimentation der verkapselten Zellen im Bioinkreservoir, die in der Regel durch die Schwerkraft angetrieben wird und zu einer inhomogenen Zelldispersion im Bioink^{führt 6,7}. Folglich behindert ein Bioink mit inhomogener Zelldispergität den In-vitro-Bioprinting eines funktionellen Gewebekonstrukts.

Mehrere neuere Studien, die sich auf Bioinks konzentrieren, haben die Förderung der homogenen Dispergität von verkapselten Zellen berichtet. Für den Extrusionsbioprinting⁸wurde ein modifizierter Alginatbioink auf Basis einer zweistufigen Vernetzung verwendet. Ein Alginatpolymer wurde in dieser Studie mit Peptiden und Proteinen modifiziert. Zellen zeigten eine homogenere Verteilung in diesem modifizierten Alginat als in dem häufig verwendeten Alginat aufgrund der Anbaustellen, die von den Peptiden und den Proteinen bereitgestellt werden. Alternativ wurden gemischte Bioinks verwendet, um die Sedimentation von Zellen in Bioink zu lösen. In einer weiteren Studie wurde ein gemischter Bioink mit Polyethylenglykol (PEG) und Gelatine- oder Gelatinemethacryloyl (GelMA) mit verbesserter mechanischer Robustheit verwendet⁹. Die gekapselten Zellen zeigten eine homogene Verteilung vor allem, weil die Viskosität des gemischten Bioinks verbessert wurde. Im Allgemeinen gibt es mehrere Faktoren, die die Dispergität der verkapselten Zellen im Bioink beeinflussen, wie die Viskosität des Bioinks, die Schwerkraft der Zellen, die Dichte der Zellen und die Dauer der Arbeitszeit. Unter diesen Faktoren spielt die Schwerkraft von Zellen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Sedimentation. Der Auftrieb und die Reibung, die der zähflüssige Bioink bietet, wurden bisher als Hauptkräfte gegen die Schwerkraft untersucht¹⁰.

Hierbei haben wir eine neuartige Strategie entwickelt, um die homogene Dispergität der verkapselten Zellen in Bioink zu fördern, indem wir mehrere flüssige Schnittstellen im Bioink-Reservoir manipulieren. Diese flüssigen Schnittstellen, die durch die vielschichtige Modifikation des Bioinks entstehen, können nicht nur grenzflächenretentionsfähig sein, was die Sedimentation von Zellen verzögert, sondern auch eine geeignete Biokompatibilität und rheologisches Verhalten des Bioinks aufrechterhalten. In der Praxis haben wir die wässrige GelMA-Lösung (5%, w/v) mit Seidenfibroin (SF) in vielschichtiger Weise modifiziert, um längs vier Schnittstellen zu erzeugen, die Grenzflächenspannungen im gemischten Bioink erzeugen. Dadurch wurde die Schwerkraftbelastung der Zellen durch die vom Menschen hergestellte Grenzflächenspannung kompensiert, und eine nahezu homogene Dispersion der verkapselten Zellen im Bioink wurde durch weniger Sedimentation über die angrenzenden Zellschichten hinweg erzielt. Bisher wurde kein ähnliches Protokoll zur Verlangsamung der Sedimentation von verkapselten Zellen durch Manipulation der Grenzflächenretention in flüssigen Bioinks berichtet. Wir stellen hier unser Protokoll vor, um eine neue Möglichkeit zur Lösung der Zellsedimentation im Bioprinting aufzuzeigen.

Protokoll

1. Vorbereitung von zellbeladenem SF-GelMA

1. Sterilisieren Sie alle Materialien mit 0,22 m Spritzenfiltereinheiten. Führen Sie alle Schritte in einem biologischen Sicherheitsschrank aus.
2. 1x PBS auf 50 °C erwärmen und Gelatine in der erhitzten 1x PBS unter Rühren auflösen. Die Endkonzentration von Gelatine in PBS sollte 10% (w/v) betragen.
3. Methacrylanhydrid unter Rühren langsam in die Gelatinelösung (Gewichtsverhältnis von Methacrylanhydrid zu Gelatine von 0,6 bis 1) geben und den Komplex mindestens 1 h (50 °C) mischen. In der Regel bereiten Sie 200 ml 10% Gelatinelösung mit 12 g Methacrylanhydrid; das Volumen hängt von den Bedürfnissen der Studie ab.
4. Die gemischte Lösung mit Gelatine und Methacrylanhydrid in ein 50 ml steriles Rohr geben.
5. Zentrifugieren Sie die Mischlösung bei 3.500 x g. Es dauert in der Regel 3-5 min, um zwei Schichten zu erhalten. Sammeln Sie die obere Schicht (GelMA) und entsorgen Sie die untere Schicht (unreagiertemethacrylanhydrid).
6. Verdünnen Sie die in Schritt 1.5 erhaltene Lösung der oberen Schicht mit zwei Volumen entionisiertem Wasser (40 bis 50 °C).
7. Dialyse die in Schritt 1.6 erhaltene Lösung mit einer 12-14 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Dialysemembran gegen entionisiertes Wasser für 5 bis 7 Tage (40 bis 50 °C). Wechseln Sie das Wasser zweimal täglich.
8. Sammeln und einfrieren Sie die GelMA-Lösung bei 80 °C über Nacht.
9. Lyophilisieren Sie die GelMA-Lösung für 3 bis 5 Tage in einem Gefriertrockner mit einer Temperatur von -45 °C und einem Druck von 0,2 mbar.
10. Lösen Sie das lyophilisierte GelMA (Substitutionsgrad von ca. 75%) in 1x PBS mit 10% FBS (fetales Rinderserum, v/v), 25 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-Ethan-Sulfonsäure) und Photoinitiator (0,5%, w/v), um das GelMA-Bioinkpräparat zu erhalten.
    HINWEIS: Der Grad der Substitution von GelMA kann durch einen Ninhydrin-Assay³berechnet werden.
11. Mischen Sie die GelMA-Lösung (10%, w/v) mit unterschiedlichen Volumina der anfänglichen SF-Lösung (5%, w/v) und verschiedenen Volumina von 1x PBS, um SF-GelMA-Bioinks mit unterschiedlichen SF-Konzentrationen zu erhalten. Der Anteil pro 1 ml GelMA- und SF-Lösung in den verschiedenen Bioinks ist in Tabelle 1dargestellt.
    HINWEIS: Alle Biotinten müssen eine Endkonzentration von 5% (w/v) GelMA enthalten, aber die Konzentration von SF variiert: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 und 1,5% (w/v) in den verschiedenen SF-GelMA-Biotinten. Verwenden Sie SF-M-Layered-GelMA, um den mit SF modifizierten GelMA-Bioink Schicht für Schicht zu bezeichnen. Verwenden Sie SF-X-GelMA, um die mit SF modifizierten GelMA homogen zu bezeichnen (z. B. wurde GelMA mit Modifikation von 1% SF als SF-1-GelMA bezeichnet).
12. Beschallen Sie alle Bioinks für 10-20 min.
13. Wachsen Sie NIH3T3-Zellen mit DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium), das 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin in einem Inkubator enthält (37 °C mit 5%_CO2). Durchfahrt der Zellen im Verhältnis 1:3, wenn die Dichte 80% erreicht.
14. Zentrifugieren Sie die Suspension von NIH3T3-Zellen bei 1500 U/min für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit Absaugung und setzen Sie das Zellpellet mit frischer Bioinklösung in einem 15 ml sterilen Rohr wieder auf.
    HINWEIS: Die Konzentration der gekapselten Zellen im Bioink sollte 1 x 10⁶ Zellen/ml betragen, und die Konzentration muss mit einem Zytometer berechnet werden.
15. Verwenden Sie 2 ml verschiedene SF-GelMA Bioinks, um die Zellpellets aufzuhängen, um verschiedene zellbeladene Bioinks zu erhalten.

2. Laden, Aufheizen und Bioprinting des SF-M-Layered-GelMA

1. 0,4 ml zellbeladenes SF-0.5-GelMA in die untere Schicht der Spritze geben.
   HINWEIS: Verwenden Sie in dieser Studie eine 2 ml Spritze als Bioinkreservoir. Legen Sie verschiedene SF-GelMA-Bioinks Schicht für Schicht in die Spritze.
2. Legen Sie die Spritze in ein Eiswasserbad (0 °C) für 5 min, damit sich der Bioink der Bodenschicht in einen Gelzustand verwandelt.
3. 0,4 ml zellbeladenen SF-0.75-GelMA-Bioinks über die untere Schicht laden.
4. Legen Sie die Spritze mit den beiden Schichten Von Bioinks in einem Eiswasserbad (0 °C) für 5 min, um die beiden Schichten von Bioinks in einen Gelzustand zu verwandeln.
5. Fahren Sie die Lade- und Kühlschritte noch 3 Mal mit den restlichen 3 Arten von Biotinten (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) um ein mehrschichtiges Bioinksystem mit unterschiedlichen SF-Konzentrationen in den verschiedenen Schichten zu erhalten. Das Volumen, das für die Beladung aller Bioinks verwendet wird, sollte 0,4 ml betragen.
6. Erhitzen Sie den mehrschichtigen Bioink, indem Sie die Spritze 30 min vor dem Bioprinting in einen Inkubator (37 °C) geben.
7. Verwenden Sie eine 2 ml Spritze als Bioinkreservoir mit einer 27 G Druckdüse. Stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 50 l/min, die Bewegungsgeschwindigkeit der Düse auf 2 mm/s und die Düsenhöhe auf 1 mm. Führen Sie den Bioprinting-Vorgang bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) durch.
   1. Drucken Sie das Gewebekonstrukt extrusionsfrei mit einem maßgeschneiderten Bioprinter unter den Parametern, die aus unseren früheren Studien^11,12angepasst wurden.
8. Verwenden Sie ultraviolettes Licht (365 nm, 800 mW) für 40 s, um das biogedruckte Gewebekonstrukt zu vernetzen.
9. Kultur das vernetzte Gewebekonstrukt in DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium), das 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin in einem Inkubator enthält (37 °C mit 5%_CO2). Das Medium wurde in den ersten 2 Tagen alle 8 stunden und danach alle 2-3 Tage gewechselt.

Ergebnisse

Ein Schema der Herstellung von zellbeladenen Bioinks ist in Abbildung 1dargestellt. Nach der Vorbereitung der verschiedenen Bioinks wurden Beladung, Aufwärmen und Bioprinting durchgeführt (Abbildung 2). Um die Verteilung der gekapselten Zellen im Bioinkreservoir zu bewerten, wurde ein Bioprinting-Verfahren mit drei verschiedenen zellbeladenen Bioinks in drei 96-Well-Platten durchgeführt (Abbildung 3A). Zwei Kontrollgruppen (Prist...

Diskussion

Die Stabilität des mehrschichtigen Systems ist ein wichtiger Punkt, um dieses Protokoll erfolgreich auszuführen. Theoretisch berechneten wir die Diffusion von SF-Molekülen in der GelMA-Lösung auf Basis von Naumans Studie¹³. Es wurde festgestellt, dass die Diffusion von Proteinen in Lösung mit ihrem Molekulargewicht zusammenhängt. Das durchschnittliche Molekulargewicht (MW) des Rinderserumalbumins (BSA) beträgt 66,5 kDa und sein Diffusionskoeffizient liegt bei 64-72 m²/s. Der durc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)	TCI	M64BK-QD
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630080
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	10569044
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10091
Gelatin	Sigma-Aldrich	V900863MSDS
Methacrylic anhydride (MA)	Sigma-Aldrich	276685MSDS
Penicillin–streptomycin antibiotics	Gibco	15140163
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
Silk fibroin	Advanced BioMatrix	5154