Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Zusammenfassung

An der Schnittstelle von organischen und wässrigen Lösungsmitteln fügen sich maßgeschneiderte amphiphile Elastin-ähnliche Proteine zu komplexen supramolekularen Strukturen wie Vesikeln, Fasern und Koacervaten zusammen, die durch Umweltparameter ausgelöst werden. Die beschriebenen Montageprotokolle ergeben Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) mit abstimmbaren Eigenschaften, die die Verkapselung verschiedener Ladungen ermöglichen.

Zusammenfassung

Maßgeschneiderte proteinhaltige Bausteine sind vielseitige Kandidaten für die Montage supramolekularer Strukturen wie Minimalzellen, Wirkstoffabgabefahrzeuge und Enzymgerüste. Aufgrund ihrer Biokompatibilität und Tunabilität auf genetischer Ebene sind Elastin-ähnliche Proteine (ELP) ideale Bausteine für biotechnologische und biomedizinische Anwendungen. Dennoch bleibt die Montage von proteinbasierten supramolekularen Strukturen mit ausgeprägten physiochemischen Eigenschaften und gutem Verkapselungspotenzial eine Herausforderung.

Hier bieten wir zwei effiziente Protokolle für die geführte Selbstmontage von amphiphilen ELPs in supramolekulare Proteinarchitekturen wie sphärische Coacervate, Fasern und stabile Vesikel. Die vorgestellten Montageprotokolle erzeugen Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) auf Basis von ELPs mit anpassungsfähigen physikalisch-chemischen Eigenschaften. PMBCs zeigen Phasentrennungsverhalten und zeigen eine methodenabhängige Membranfusion auf und sind in der Lage, chemisch unterschiedliche fluoreszierende Ladungsmoleküle zu verkapseln. Die resultierenden PMBCs haben ein hohes Anwendungspotenzial als Wirkstoffformulierungs- und Abgabeplattform, künstliche Zelle und abgeschotteten Reaktionsraum.

Einleitung

Die Montage supramolekularer Strukturen für biotechnologische Anwendungen wird immer wichtiger^1,2,3,4,5. Für die Montage von funktionalen Architekturen wie Koacervate, Vesikel und Fasern mit den gewünschten physikalisch-chemischen Eigenschaften ist es wichtig, die physikalisch-chemischen und konformen Eigenschaften der Komponenten zu verstehen und zu kontrollieren. Aufgrund der molekularen Präzision von Molekülen in der Natur basieren Bausteine für supramolekulare Strukturen zunehmend auf Lipiden, Nukleinsäuren oder Proteinen. Im Vergleich zu synthetischen Polymeren ermöglichen proteinhaltige Bausteine eine präzise Kontrolle der entstehenden supramolekularen Strukturen⁶ auf genetischer Ebene. Die primäre Aminosäure(aa) Sequenz der einzelnen Proteinbausteine kodiert die Informationen für ihr Montagepotential von der molekularen bis zur makroskopischen Ebene sowie die dreidimensionale Form und physikalische Eigenschaften der endgültigen supramolekularen Struktur⁷.

Gemeldete Methoden zur Montage verschiedener supramolekularer Strukturen beinhalten oft amphiphile Proteine wie temperaturempfindliche Elastin-ähnliche Proteine (ELP)^5,8,9, rekombinantes Oleosin¹⁰und künstliche Protein-Amphiphilen¹¹. Temperaturausgelöste Methoden haben zur Montage von Mizellen geführt^4,10,12Fasern¹³Blätter¹⁴und Vesikel^9,15,16. Für die Bildung dynamischer proteinbasierter Vesikel wurden Methoden mit organischen Lösungsmitteln angewendet.^8,11,14. Bisher fehlt es bei den angewandten Protokollen für die Vesikelbildung oft an Montagekontrolle über mikrometergroße Baugruppen.^16,17oder haben eine begrenzte Montageausbeute⁵. Darüber hinaus haben einige berichtete ELP-basierte Vesikel ein beeinträchtigtes¹²oder begrenzte Stabilität im Laufe der Zeit⁹. Um diese Nachteile zu beheben, ermöglichen die vorgestellten Protokolle die Selbstmontage von mikrometer- und submikrometergroßen supramolekularen Strukturen mit ausgeprägten physiochemischen Eigenschaften, gutem Verkapselungspotenzial und Langzeitstabilität. Maßgeschneiderte amphiphile ELPs fügen sich zu supramolekularen Strukturen zusammen und reichen von kugelförmigen Coacervaten und hochgeordneten verdrehten Faserbündeln bis hin zu unilamelladervetriären Vesikeln, abhängig vom angewandten Protokoll und den damit verbundenen Umgebungsbedingungen. Große vesikuläre ProteinMembran-basierte Fächer (PMBC) zeigen alle Hauptphänotypen wie Membranfusion und Phasentrennungsverhalten analog zu Liposomen. PMBCs kapseln effizient chemisch vielfältige fluoreszierende Ladungsmoleküle, die mit einfacher Epifluoreszenzmikroskopie überwacht werden können. Die in dieser Studie verwendeten sich wiederholenden ELP-Domänen sind attraktive Bausteine für proteinbasierte supramolekulare Architekturen¹⁸. Die ELP-Pentapeptid-Wiederholungseinheit (VPGVG) ist dafür bekannt, neben Prolin an der vierten Position (Valin, V) unterschiedliche Aa zu tolerieren und dabei ihre strukturellen und funktionellen Eigenschaften zu erhalten.¹⁹. Das Design von amphiphilen ELPs, die ausgeprägte hydrophile und hydrophobe Domänen enthalten, wurde durch einfügen von Aa-Gastrückständen (X) in die VPGXG-Wiederholung mit ausgeprägter Hydrophobie, Polarität und Ladung realisiert.²⁰. Amphiphile ELP-Domänen, die mit hydrophoberphenylalanin (F) oder Isoleucin (I) ausgestattet sind, während die hydrophile Domäne geladene Glutaminsäure (E) oder Arginin (R) als Gästerückstände enthielt. Eine Liste der förderfähigen amphiphilen ELP-Konstrukte und entsprechenden Aa-Sequenzen finden Sie in den ergänzenden Informationen und Referenzen^8,21. Alle Bausteine sind entweder mit kleinen Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen zur Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgestattet. mEGFP und andere fluoreszierende Proteine wurden n-terminal mit den hydrophilen Domänen der ELP-Amphiphilen verschmolzen. Organische Farbstoffe wurden über kupferfreie Stämme konjugiert, die Alkyn-Azid-Cycloaddition (SPAAC) zu einer ko-translational eingeführten unnatürlichen Aminosäure (UAA) förderten. Die ko-translationale Einbeziehung der UAApara-Azidophenylalanin (pAzF)²²ermöglicht die N-Terminal-Modifikation der hydrophilen ELP-Domäne. Auf diese Weise wird der grüne Fluoreszenzfarbstoff BDP-FL-PEG₄-DBCO (BDP) oder jedes kleine fluoreszierende Molekül mit einem gespannten Zyklopädat kann als Fluoreszenzsonde verwendet werden. Erfolgreiche Einarbeitung des UAA pAzF und Cycloaddition des Farbstoffs über SPAAC kann durch effiziente Ionisierung der entsprechenden tryptischen Peptide einfach über LC-MS/MS bestätigt werden⁸. Dieser kleine organische Farbstoff wurde angewendet, um die Lösungsmittelauswahl für Montageprotokolle zu erweitern, da fluoreszierende Proteine mit den meisten organischen Lösungsmitteln nicht kompatibel sind. Die beiden effizientesten Montageprotokolle für supramolekulare Strukturen, die in unserem Labor entwickelt wurden, werden im Folgenden beschrieben. Die THF-Schwellungsmethode ist nur mit organischem Farbstoff modifiziertem amphiphilem ELP kompatibel. Im Gegensatz dazu ist die 1-Butanol-Extrusionsmethode (BuOH) mit vielen Proteinen wie fluoreszierender Sonde, z.B. mEGFP, kompatibel, da die beschriebene Methode die Fluoreszenz dieser Fusionsproteine vollständig bewahrt. Darüber hinaus funktioniert die Verkapselung kleiner Moleküle und das vesikuläre Fusionsverhalten am besten mit der BuOH-Extrusionsmethode.

Protokoll

1. Design und Klonen von amphiphilen Elastin-ähnlichen Proteinen (ELPs)

1. Klonen und Entwerfen der Konstrukte wie an anderer Stelle beschrieben^8,20. Plasmide sind auf Anfrage erhältlich.

2. Proteinexpression, Reinigung und Zubereitung

1. Ausdruck von F20E20-mEGFP und F20E20-mCherry
   1. Impfen Sie die Hauptausdruckskultur von der Übernacht-Vorkultur bis zu einem OD₆₀₀ von 0,3. Bei 37 °C, 200 U/min in sterilem 400 ml LB Medium mit angeeigneten Antibiotika in einem 2-L-Kolben auftauchen.
   2. Bereiten Sie die IPTG-Lagerlösung (1 M) zur Induktion der Expressionskultur in Reinstwasser vor.
   3. Wenn OD₆₀₀ 0.5–0.8 erreicht ist, fügen Sie IPTG zur Ausdruckskultur zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzu und reduzieren Sie die Inkubationstemperatur auf 20 °C. Expression bei 20 °C für ca. 20 h bei 200 Umdrehungen pro Minute zulassen.
2. Expression von amphiphilen ELP mit UAA pAzF
   1. Impfen Sie die Hauptexpressionskultur von der E. coli-Präkultur über Nacht, die die beiden Plasmide pEVOL pAzF und z.B. pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his enthält, bis zu einem OD₆₀₀ von 0,3 (siehe Ergänzende Informationen zu Aminosäuresequenzen). Bei 37 °C, 200 U/min in sterilem 400 ml LB Medium, ergänzt mit Kanamycin und Chloramphenicol in einem 2-L-Kolben, inkubieren.
   2. Bereiten Sie 100 mM pAzF Lagerlösung in Reinstwasser vor. Für 10 ml pAzF-Stammlösung 206,2 mg pAzF wiegen und in 8 ml Reinstwasser wieder aufhängen. Um den pAzF aufzulösen, erhöhen Sie den pH-Wert der Lösung mit 3 M NaOH und mischen Sie kräftig. Wenn pAzF aufgelöst wird, senken Sie den pH-Wert vorsichtig auf 10,5 und fügen Sie Reinstwasser auf ein Endvolumen von 10 ml hinzu. Verwenden Sie einen sterilen Filter (0,22 m) und aliquotieren Sie die Lösung in 2 ml Reaktionsröhren.
   3. Bereiten Sie 1 M IPTG-Lagerlösung in Reinstwasser und 20% Arabinose-Stammlösung in Reinstwasser vor.
   4. Wenn OD₆₀₀ 0.5–0.8 erreicht ist, fügen Sie der Ausdruckskultur pAzF zu einer endgültigen Konzentration von 2 mM hinzu. Inkubationskultur für 10 min, 37 °C, 200 Rpm, um die Aufnahme von pAzF zu ermöglichen.
   5. Induzieren der Expression von Zielprotein und Expression der notwendigen tRNA/t-RNA-Synthetase durch gleichzeitige Zugabe von IPTG (1 mM) und Arabinose (2%) und reduzieren die Inkubationstemperatur auf 20 °C.
   6. Expression bei 20 °C für ca. 20 h bei 200 Umdrehungen pro Minute zulassen. Ernteausdruckskultur durch Zentrifugation bei 4 °C, 4000 x g, 40 min.
3. Zelllyse und Proteinreinigung
   1. Das E. coli Pellet im Lysepuffer (10 ml pro Liter Kultur; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M Harnstoff, 0,25% Triton X-100) mit Lysozym (0,1 mg/ml) und PMSF (0,1 mM) wieder aufsetzen. 30 min auf Eis brüten und frieren und danach zweimal auftauen, indem sie die Probe in flüssigen Stickstoff tauchen.
   2. Beschallen Sie die Suspension (30%, 15 mal, 30 s: 10 s Bruch) und löschen Sie das Lysat über Zentrifugation (4 °C, 10.000 x g für 40 min).
   3. Proteinmittel mit Affinitätschromatographie (z. B. auf einer 1 ml Nickelsäule mit einem FPLC-System, das mit einem Fraktionskollektor verbunden ist; siehe Tabelle der Materialien). Das Protein mit Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M Harnstoff, 250–500 mM Imidazol) aufbewahren und bis zur WeiterenVerarbeitung bei 4 °C lagern.
   4. Analysieren Sie die Reinigungseffizienz über SDS-PAGE.

3. Farbmodifikation von ELPs über SPAAC

1. Grob schätzen Die Konzentration der ELP-Lösung.  Eine_{280-Absorption} zur Konzentrationsbewertung ist nicht wertvoll, da die pAzF-R40F20-Sequenz keine Aminosäuren enthält, die im UV-Bereich absorbieren. Daher kann ein zuvor lyophilisiertes und gewichtetes ELP-Amphiphil als Referenz für den SDS PAGE-Bandvergleich verwendet werden. Durch den Vergleich der summierten Grauwert-Intesität von SDS PAGE-Bändern aus ELP-Lösungen mit bekannten Konzentrationen und Ihrer Probe kann die raue Konzentration Ihrer Probe geschätzt werden.
2. Fügen Sie 1 l Fluoreszenzfarbstoff BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM Stofflösung; 20 M Endkonzentration) bis zu 500 l ELP-Lösung (ca. 20 m) hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion für ca. 10 h bei 15 °C, während schüttelnd und vor Licht geschützt.
3. Für die weitere Verwendung, Dialyse die Reaktion, um übermäßige BDP zu entfernen.
   1. Equilibrate eine Dialysemembran (z.B. 12 kDa Cutoff) in Reinstwasser für 10 min. Schneiden Sie die Dialysemembran in die richtige Größe, um auf die Öffnung eines Reaktionsrohrs mit der angeklickten ELP-Lösung gelegt zu werden. Um die Dialysemembran in der Öffnung zu fixieren, legen Sie einen Reaktionsrohrdeckel mit ausgestanztem Kern auf die Öffnung und schließen Sie so das Rohr.
   2. Legen Sie das Reaktionsrohr kopfüber in den gewählten Puffer. Tauschen Sie den Puffer (2–5 L) zweimal nach der Dialyse für mindestens 3 h jedes Mal. Entfernen Sie alle Luftblasen, die zwischen der Dialysemembran und dem Puffer gefangen sind, um eine erfolgreiche Dialyse zu gewährleisten.

4. THF-Schwellungsprotokoll

1. Dialyse homogene ELP-Lösung gegen Phosphat- oder Trispuffer (10 mM) mit stabilem pH 7,5, um Salze und Restverbindungen aus der Markierungsreinigung zu entfernen.
2. Bereiten Sie den Lyophilisator vor und kühlen Sie ihn auf Starttemperatur ab, um die Trocknung zu frieren.
3. Aliquot die dialysierte Proteinlösung in 1,5 ml Reaktionsröhrchen (50–500 l pro Röhre) und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff. Um unerwünschtes Mischen verschiedener Proteinlösungen während der Gefriertrocknung zu vermeiden, können Kappen mit einem kleinen Loch auf das Reaktionsrohr gelegt werden, um es teilweise zu versiegeln.
4. Nehmen Sie die gefrorenen Proteinproben aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie sofort in den Lyophilisator, um mit der Gefriertrocknung zu beginnen. Die Gefriertrocknung ist beendet, wenn die Probe vollständig trocken ist (ca. 24–48 h). Anschließend lyophilisierte amphiphilisierte ELPs mit trockenem N₂belüften und dann sofort die Reaktionsrohrdeckel schließen, um den Kontakt mit Luftfeuchte zu vermeiden.
5. Fügen Sie den lyophilisierten Proben (ELP, 5–10 m) reines THF hinzu und legen Sie die Lösung 15 min in einen Wasserbadbeschalltoner, der Eiswasser enthält, um eine Schwellung des ELP in THF zu ermöglichen.
6. Thermocycler zur Vesikelbildung auf 30–60 °C oder bis 90 °C zur Faserbildung vorheizen und neue Reaktionsrohre mit Reinstwasser oder Puffer vorbereiten (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 5–13). Sphärische Coacervate setzen sich überwiegend bei 20 °C innerhalb von pH 9–13 zusammen. Die Vesikelbildung wird bei 50–60 °C zwischen pH 7 und 9 bevorzugt. Die Faserbildung wird überwiegend über 60 °C zwischen pH 5 und 12 induziert.
7. Legen Sie nach dem Beschallungsschritt die ELP/THF-Lösung sowie die vorbereitete Reinstwasser- oder Pufferlösung in den Thermocycler und erhitzen Sie sich 5 min auf die gewünschte Temperatur. Wenn die Temperatur erreicht ist, sollte die vorgewärmte ELP/THF-Lösung sorgfältig auf dem vorgewärmten Reinstwasser oder der Pufferlösung geschichtet werden. Eine klare Trennung der beiden Phasen mit einer deutlichen Schnittstelle sollte sichtbar sein.
8. Legen Sie die Mischung wieder in den Thermocycler und inkubieren Sie für 20 min, um eine Vesikel- oder Faserbildung an der Schnittstelle zu ermöglichen. Anschließend lassen Sie die Proben vor der Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Dialyse auf Raumtemperatur abkühlen.
9. Dialyselösung mit den supramolekularen Strukturen gegen Reinstwasser oder Puffer (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 7–10).

5. BuOH Extrusionsprotokoll

1. Bereiten Sie eine ELP-Lösung von 1–50 M in Reinstwasser oder Puffer (50 mM PB pH 7,5, 100 mM NaCl, kann bis zu 4 M Harnstoff enthalten) vor. Die Konzentration der amphiphilen ELP F20R20-mEGFP- und F20R20-mCherry-Lösung kann anhand der Molaussterbekoeffizienten (F20R20-mEGFP A₂₈₀ = 22015 M^-1 cm^-1 und F20R20-mCherry A₂₈₀ = 34380 M^-1 cm^-1) bestimmt werden (siehe Zusatzinformationen für eine Sequenza).
2. Fügen Sie 10%–20% (v/v) 1-Butanol hinzu und mischen Sie die Lösung sofort, indem Sie sie mehrmals nach oben und unten pfeifen oder durch eine Spritze ziehen. Es kann eine gemeinsame 100-L-Pipette oder eine Hamilton-Spritze mit einer 0,25 x 25 mm Nadel aufgebracht werden. Die Trübung der Lösung während des Mischens sollte zunehmen, was auf die Vesikelbildung hindeutet. 1-Oktanol 5%–15% (v/v) kann auch für die Vesikelextrusion anstelle von 1-Butanol verwendet werden.
3. Um eine schmale Größenverteilung zu erreichen, extrudieren Sie Vesikel mit einem Miniextruder durch eine Membran mit einer Porengröße von 1 m bei Raumtemperatur. Die für die Extrusion verwendete Membrangröße bestimmt den Cutoff der Vesikel in der oberen Größe.
4. Dialyse die Vesikel wie oben beschrieben (Schritt 3.3), um Rest 1-Butanol zu entfernen.

6. Farbverkapselung mit dem BuOH Extrusionsprotokoll

1. Mischen Sie ca. 40 l ELP-Lösung in 10 mM Tris-HCl, pH 8 mit 1 l Dextran Texas Red (0,0025 mg/ml Endkonzentration).
2. Fügen Sie der Lösung 10 l BuOH hinzu und extrudieren Sie 5 bis 10 Mal durch eine Spritze, die mit einer 0,25 x 25 mm Nadel ausgestattet ist.

7. Analyse supramolekularer Strukturen mittels Fluoreszenzmikroskopie

1. Legen Sie einen Verstärkungsring auf eine Glasrutsche und drücken Sie die Klebeseite fest auf das Glas.
2. Fügen Sie 5 l der Probe auf die Innenseite des Bewehrungsrings und legen Sie einen Deckelschlupf oben.
3. Versiegeln Sie die Probe mit Nagellack an den Rändern des Deckelschlupfs, um eine Verdunstung der Probe während der Analyse zu vermeiden.
4. Durchführung der Fluoreszenzmikroskopie wie zuvor beschrieben⁸.

Ergebnisse

Protokollentwicklung für die Vesikelproduktion
Abbildung 1 zeigt die beiden verschiedenen Vesikelvorbereitungsmethoden. Die THF-Schwellungsmethode auf der linken Seite besteht aus drei aufeinanderfolgenden Schritten und führt je nach Temperatur zu unterschiedlichen supramolekularen Baugruppen des ELP. In Abbildung 1A zeigen Epifluoreszenzmikroskopiebilder Vesikel, die aus BDP-R20F20 zusammengesetzt sind, und fib...

Diskussion

Ein Fehler bei der Befolgung der beschriebenen Protokolle für die Montage definierter supramolekularer Strukturen führt hauptsächlich zur Bildung unspezifischer Aggregate(Abbildung 2, IV) oder zu homogen verteilten ELP-Amphiphilen. Kritische Schritte des Protokolls werden im Folgenden erläutert:

Für eine hohe Expressionsausbeute des amphiphilen ELP ist eine relativ niedrige Temperatur von 20°C optimal. Für eine erfolgreiche Affinitäts-basierte Reinigung de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm and 0.2 µm Steril Filter	VWR
1,4-Dithiothreitol	Merck
1-butanol. >99.5% p.a.	Roth
2log DNA ladder	NEB
2-Mercaptoethanol	Roth
50 mL Falcon tubes	VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye	Sigma Aldrich
Acetic acid glacial	VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%	Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO	Jena Bioscience
Biofuge	Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)	Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)	Roth
BspQI	NEB
Camera DS Qi1	Nikon
Centrifuge 5417r	Eppendorf
Centrifuge 5810r	Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid	EMS
Chloramphenicol	Roth
CompactStar CS 4	VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral	Life Technologies
Digital sonifier	Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Applichem
Dnase I	Applichem
EarI	NEB
EcoRI-HF	NEB
Environmental shaker incubator ES-20	Biosan
Ethanol absolute	Roth
Ethidium bromide solution	Roth
Filter supports	Avanti
Glass plates	Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade	Amresco
Glycin	Applichem
H4-Azido-Phe-OH	Bachhem
Heat plate MR HeiTec	Heidolph
HindIII	NEB
HisTrap FF crude column	GE Life Sciences		Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.	Merck
Illuminator ix 20	INTAS
Illuminator LAS-4000	Fujifilm
Imidazole	Merck
Immersions oil for microscopy	Merck
Incubators shakers Unimax 1010	Heidolph
Inkubator 1000	Heidolph
IPTG, >99%	Roth
Kanamycinsulfate	Roth
L(+)-Arabinose	Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE	Sartorius
LB-Medium	Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC	Christ
Lysozyme, 20000 U/mg	Roth
Microscope CM 100	Philips
Microscope Eclipse TS 100	Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)	VWR
Microscopy slides	VWR
Microwave	Studio
Mini-Extruder Set	Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.	Roth
Natriumhydroxid pellets	Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro	5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane	Avanti
PH meter 766 calimatic	Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)	Roth
Polypropylene Columns (1 mL)	Qiagen
PowerPac basic	BioRad
Propanol-2-ol	Emplura
Protein ladder 10-250 kDa	NEB
Recirculating cooler F12	Julabo
Reinforcement rings	Herma
SacI HF	NEB
SDS Pellets	Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4	VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate	VWR
T4 DNA Ligase	NEB
TEMED	Roth
TexasRed Dextran-Conjugate	MolecularProbes
Thermomix comfort	Eppendorf
THF, >99.5% p.a.	Acros
Triton X 100	Roth
Trypton/Pepton from Casein	Roth
Ultrasonic cleaner	VWR
Urea p.a.	Roth
Vacuum pump 2.5	Vacuubrand
XbaI	NEB
XhoI	NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)	Roth